주사 전자 현미경을 이용한 멤브레인 러플 형성 시각화

요약

Macropinocytosis는 막 프릴이라고도 알려진 F-actin이 풍부한 시트 형 막 돌기의 형성에 의해 시작된 고도로 보존 된 내시세포 과정입니다. 거대 피노사이토틱 용질 내재화의 증가된 속도는 다양한 병리학적 조건에 연루되어 왔다. 이 프로토콜은 주사 전자 현미경을 사용하여 시험관 내에서 막 프릴 형성을 정량화하는 방법을 제시한다.

초록

막 프릴링은 새로 중합된 액틴 필라멘트의 메쉬워크를 함유하는 운동성 원형질막 돌출부의 형성이다. 막 프릴은 자발적으로 또는 성장 인자, 염증성 사이토카인, 및 포볼 에스테르에 반응하여 형성될 수 있다. 막 돌출부 중 일부는 원위 여백에서 융합되는 원형 막 주름으로 재구성되어 마크로 피노솜이라고 불리는 크고 이질적인 액포로 세포질에 닫히고 분리되는 컵을 형성 할 수 있습니다. 이 과정에서 프릴은 거대 피노좀 내에서 내재화되는 세포 외 유체와 용질을 포획합니다. 고해상도 주사 전자 현미경 (SEM)은 세포 표면의 막 프릴 형성, 원형 돌출부 및 폐쇄 된 거대 피노시스 컵을 시각화하고 정량화하는 데 일반적으로 사용되는 이미징 기술입니다. 다음 프로토콜은 세포 배양 조건, 시험관 내에서 막 프릴 형성의 자극, 및 SEM을 사용하여 이미징을 위해 세포를 고정, 탈수 및 준비하는 방법을 기술한다. 멤브레인 프릴링의 정량화, 데이터 정규화, 및 막 프릴 형성의 자극기 및 억제제가 또한 기재되어 있다. 이 방법은 생리 학적 및 병리학 적 과정에서 대식세포증의 역할에 대한 주요 질문에 답하고, 막 프릴 형성을 조절하는 새로운 표적을 조사하고, 아직 특징이 없는 생리적 자극제뿐만 아니라 거대 세포증의 새로운 약리학 적 억제제를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

Macropinocytosis는 막 프릴¹이라고 불리는 역동적이고 액틴 구동 원형질막 돌출부의 형성을 통해 다량의 세포외 유체와 그 함량을 내재화하는 내시성 과정입니다. 이러한 막 프릴 중 많은 부분이 세포에 근접하고 다시 융합되어 원형질막으로부터 분리되는 컵을 형성하여 마크로피노솜¹로도 알려진 크고 이질적인 세포 내 엔도솜으로 알려져 있습니다. 대식세포증은 광범위한 세포 유형에서 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 표피 성장 인자(EGF)와 같은 성장 인자에 의해 유도되지만, 구성적 거대세포증으로 알려진 추가적인 독특하고 칼슘-의존적 과정은 선천적 면역 세포 2,3,4,5,6,7,8에서도 관찰되었다.

거대 세포증을 통해 세포외 물질을 내재화하는 세포의 능력은 영양 섭취에서 병원체 포획 및 항원 제시에 이르기까지 다양한 생리적 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다 9,10,11. 그러나이 과정은 비 선택적이고 유도성이 있기 때문에 여러 병리학 적 조건에도 연루되어 있습니다. 실제로, 이전의 연구들은 거대 세포증이 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 암, 신장 결석 및 죽상 동맥 경화증 12,13,14,15,16에서 중요한 역할을한다고 제안했다. 더욱이, 특정 박테리아 및 바이러스는 숙주 세포로의 진입을 얻고 감염을 유도하기 위해 거대 세포증을 이용하는 것으로 나타났다^17,18. 흥미롭게도, 거대세포증의 자극은 또한 다양한 질병 상태^(19,20)에서 치료제의 표적화된 전달을 위해 이용될 수 있다.

이전의 연구들은 유세포 분석기 및 공초점 이미징^21,22를 사용하여 거대 피노사이토시스를 억제하는 약리학적 제제의 부재 및 존재 하에 내재화된 형광 태그가 붙은 유체 상 마커를 정량화함으로써 거대 세포작용을 탐구^하였다. 현재 이용가능한 거대세포증을 억제하는 약리학적 도구는 1) 액틴 중합 억제제(시토칼라신 D 및 라트룬쿨린), 2) PI3K 차단제(LY-290042 및 워트만닌) 및 3) 나트륨 수소 교환기(NHE)(아밀로라이드 및 EIPA)^{5,14,15,23,24,25}의 억제제로 제한되고 포함된다. . 그러나, 이들 억제제는 엔도사이토시스 독립적인 효과를 갖기 때문에, 특히 생체내²¹에서 용질 흡수 및 질병 병인에 대한 거대 세포증의 기여를 선택적으로 결정하는 것은 어렵다.

주사 전자 현미경 (SEM)은 전자²⁶의 집중 빔을 사용하여 세포의 초고해상도 이미지를 생성하는 전자 현미경의 일종입니다. 거대 세포증 연구에서 SEM 이미징은 원형질막의 지형 학적 및 형태 학적 특성을 시각화하고, 막 프릴 형성을 정량화하고, 거대 피노좀 내재화로의 진행을 조사하는 황금 표준 기술로 간주됩니다. 또한, 거대 세포증 차단제의 존재 및 부재 하에서, 용질 흡수의 정량화와 결합된 주사 전자 현미경은 시험관 내에서 거대 세포성 용질 내재화를 조사하는 신뢰할 수 있는 전략을 제공한다. 이 논문은 SEM을 위해 세포를 준비하고, 세포 표면을 시각화하고, 프릴 형성을 정량화하고, 컵 폐쇄 및 마크로 피노좀 내재화를 향한 진행 상황을 조사하는 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

프로토콜

참고: 다음은 SEM 현미경을 사용하여 RAW 264.7 대식세포에서 막 프릴 형성을 정량화하는 데 사용되는 일반적인 프로토콜입니다. 최적화는 상이한 세포 유형에 대해 요구될 수 있다.

1. 세포주 및 세포배양

1. 37°C 및 5% CO2의 가습 배양기에서 10%(vol/vol) 열 불활성화된 태아 소 혈청(FBS), 페니실린 100IU/mL 및 스트렙토마이신 100μg/mL로 보충된 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)에서 RAW 264.7 대식세포를 성장시킨다. 격일로 성장 매체를 교체하십시오.
2. 세포가 80% 합류하게 되면, 멸균 PBS를 사용하여 플레이트를 두 번 세척한다.
3. 1,000 μL의 0.5% 트립신-EDTA를 첨가하여 세포를 분리하고, 세포 배양 플레이트를 37°C의 가습 인큐베이터에서 3-5분 동안 인큐베이션한다.
4. 세포 해리를 확인하기 위해 광학 현미경으로 플레이트를 검사하십시오. 트립신을 불활성화시키기 위해 10% FBS를 함유하는 성장 배지 10 mL를 첨가한다.
5. 세포 현탁액을 50 mL 원뿔형 튜브에 수집하고, 실온에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리한다. 완전한 세포 배양 배지에서 세포를 부드럽게 재현탁시키고, Trypan Blue (0.4%) 염색을 사용하여 세포 수 및 생존율을 결정하였다.
   참고: 이 실험에 권장되는 최소 세포 생존율은 >90%입니다.
6. 멸균 유리 커버슬립을 오토클레이브 포셉을 사용하여 24웰 플레이트의 웰에 놓습니다. 종자 세포를 1 x 10⁶ cells/mL의 밀도로 커버슬립 상에 상에, 플레이트를 37°C 및 5%_CO2의 가습된 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다.
7. 각 웰의 배지를 치료 전에 신선한 500 μL 완전 배지로 변경하십시오. 대식세포를 비히클 (DMSO 또는 EIPA를 용해시키는데 사용되는 다른 용매) 또는 마크로피노사이토시스 억제제 5-(N-에틸-N-이소프로필)-아밀로리드 (EIPA, 25 μM²¹)로 30분 동안 전처리한다.
8. 세포를 막 주름을 촉진하기 위해 거대 세포증의 비히클 및 자극제로 세포를 치료하십시오 : phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 1 μM, 30 min²¹) 및 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF, 100 ng / mL, 30 분³).
   참고: 대식세포증의 대안적인 억제제 [예를 들어, 라트룬쿨린 A (1 μM, 30 분) 또는 시토칼라신 D (1 μM, 30 분)] 및 자극제 [예를 들어, 표피 성장 인자 (EGF, 100 ng/mL, 10 분) 또는 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF, 100 ng/mL, 15 분)]는 또한 대식세포 및 다른 세포 유형^16,27에서 대식세포증을 특성화하는데 사용될 수 있고^{, 28,29.} 세포는 거대 피노사이토시스의 생리학적 자극제로 치료하기 전에 하룻밤 사이에 혈청 기아를 필요로 할 수 있다. 가장 효과적인 농도와 배양 시간은 다른 세포 유형에서 거대 세포증을 자극하기 위해 결정되어야한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

2. SEM 고정

1. 치료 후, 웰에서 배지를 흡인하고 얼음처럼 차가운 PBS로 커버 슬립을 두 번 씻으십시오.
2. 세포를 고정시키고 (0.1 M 소듐 카코딜레이트 중의 4% 파라포름알데히드 및 2% 글루타르알데히드) 실온에서 30분 동안, 이어서 4°C에서 고정제에서 밤새 인큐베이션하였다.
3. 세포 단일층을 방해하지 않으면서 500 μL의 다음 시약으로 커버슬립을 부드럽게 세척하고 인큐베이션한다.
   1. 0.1 M 소듐 카코딜레이트에 1회 세척하고 15분 동안 인큐베이션한다.
   2. 각 세척에서 10분 인큐베이션으로_{dH2O로 2}회 세척한다.
   3. 각 세척물에서 10분 인큐베이션으로 25% 에탄올로 두 번 세척한다.
   4. 각 세척에서 10분 인큐베이션으로 50% 에탄올로 두 번 세척한다.
   5. 각 세척에서 10분 인큐베이션으로 75% 에탄올로 두 번 세척한다.
   6. 각 세척에서 10분 인큐베이션으로 80% 에탄올로 두 번 세척한다.
   7. 각 세척물에서 10분 인큐베이션으로 95% 에탄올로 두 번 세척한다.
   8. 100 % 에탄올로 두 번 씻으십시오. 각 세척에서 10분간의 인큐베이션을 수행한다.
      참고 : 시약의 교체 / 교체는 세포의 공기 건조를 방지하기 위해 신속하게 수행되어야합니다. 커버슬립은 4°C에서 며칠 동안 100% 에탄올에 방치할 수 있다. 장기간 보관하려면 100 % 에탄올을 추가하고 시료의 공기 건조를 방지하기 위해 파라 필름으로 웰을 덮으십시오.

3. 임계점 건조

1. 커버슬립을 임계점 건조기에 넣고 100% 에탄올로 덮으십시오. 전원 버튼을 누르고_CO2 탱크를 엽니 다.
2. 온도가 0°C로 떨어질 때까지 냉각 버튼을 약 30초 동안 누릅니다. 챔버 창에 거품이 나타날 때까지 채우기 단추를 누릅니다.
3. 퍼지 배기가스에서 나오는 에탄올 냄새가 사라질 때까지 퍼지 버튼을 누릅니다. 온도가 0°C로 떨어질 때까지 냉각 단추를 다시 누릅니다.
4. 채우기 및 지우기 버튼을 눌러 끄고_CO2 탱크를 닫습니다. 냉각 버튼을 눌러 끄고 Heat 버튼을 누릅니다.
5. 온도를 42°C로 설정하고 압력을 1,200psi로 설정합니다. 압력과 온도가 안정되면 블리드 버튼을 눌러 압력을 천천히 줄입니다.
6. 챔버 압력이 150psi에 도달하면 벤트 버튼을 누르고 압력이 0psi로 떨어질 때까지 기다립니다. 임계점 건조기를 끄고 커버슬립을 분리합니다.
7. 탄소 접착제 탭을 사용하여 SEM 알루미늄 시편 마운트에 커버슬립을 장착하고 스퍼터 코터에서 금/팔라듐을 사용하여 스퍼터 코팅을 받습니다.
8. 전원 버튼을 켜고 진공이 30mTorr에 도달 할 때까지 기다리십시오. 챔버를 플러시하여 가스 스위치를 끄고 Fine 가스 밸브를 시계 반대 방향으로 돌려 습도와 공기를 제거하십시오.
9. 진공이 200mTorr로 증가하면 가스 스위치를 끄고 진공이 30mTorr에 도달 할 때까지 기다리십시오. 이 단계를 3번 반복합니다.
10. 타이머 버튼을 누르고 게이지가 10mA를 읽을 때까지 전압 노브를 조정합니다. 챔버에서 코팅 된 커버 슬립을 제거하십시오.
    참고: 제조업체의 지침에 따라 샘플의 임계점 건조 및 스퍼터 코팅을 수행하십시오.

4. 이미징 및 정량화

1. 샘플 커버슬립을 주사 전자 현미경의 챔버에 삽입합니다. 도어를 닫고 Evac 버튼을 누릅니다.
2. SEM 작동 소프트웨어를 엽니다. 가속 전압을 15kv로 설정하고 작동 거리를 10mm로 설정합니다.
3. 좌표 단추를 누르고 셀이 관찰 화면 중앙에 나타날 때까지 컨트롤러 주위로 이동합니다. 배율을 3,500x로 설정하고 사진 버튼을 클릭하여 샘플을 이미지화합니다.
   참고: 더 높은 수준의 배율(8,500x ~ 16,000x)을 사용하여 원형질막을 더 세밀하게 표시합니다.
4. 커버슬립의 최소 10개의 무작위 위치에서 이미지를 촬영하여 각 현미경 필드에 여러 셀이 포함되어 있는지 확인합니다. 이미지를 .tif 파일로 저장합니다.
5. 이미지에서 크기가 500nm보다 큰 원형질막의 돌출된 담요 모양의 주름으로 정의되는 멤브레인 프릴을 찾습니다(그림 1). 셀당 프릴 수를 계산합니다.
   참고: C자형 프릴은 측면 말단에 융합되지 않은 곡선형 막 돌출부로 확인되었다[(그림 1 (M-CSF 처리) 및 그림 2B]. 융합된 원형 막 프릴은, 그들의 폐쇄 전에, 거대 세포성 컵으로 확인되었다(도 2C).
6. 막 프릴의 수를 평가된 현미경 필드에서 총 세포 수로 정규화한다. 각 그룹의 샘플에 대해이 분석을 반복하십시오.

결과

여기에서는 제시된 기술의 결과를 설명합니다. 도 1에 도시된 대표적인 SEM 이미지는 PMA 및 M-CSF로 처리한 후 RAW 264.7 대식세포에서 막 프릴 형성을 입증한다. 이미지는 먼저 정량화 목적으로 3,500x의 배율로 캡처 한 다음 더 높은 배율 (8,500x ~ 16,000x)에서 캡처하여 원형질막을 더 자세히 보여줍니다. 대식세포를 대식세포증 억제제 EIPA로 전처리하여 막프릴 형성을 감쇠시켰다(

토론

본 SEM 이미징 프로토콜은 시험관 내에서 세포 표면 상의 막 프릴 형성, 원형 돌출부 및 마크로피노시스 컵을 시각화하고 정량화하는 도구를 제공한다. 현재의 프로토콜은 대식세포에 초점을 맞추고 있지만, 연구 결과에 따르면 막 프릴 형성은 수지상 세포, 섬유 아세포, 뉴런 및 암 세포^{11,12,14,21,30}을 포함한 다?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
2% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
4% Paraformaldehyde	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive Tabs	Electron Microscopy Sciences	77825-09
Dimethyl Sulfoxide	Corning	25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Falcon	353047
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover Glass	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Pen Strep	Gibco	15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetate	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrophage	ATCC	ATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Critical Point Dryer	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Aluminum Specimen Mounts	Electron Microscopy Sciences	75220
Sodium Cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope