Visualizando a formação de babados de membrana usando microscopia eletrônica de varredura

Resumo

Macropinocistose é um processo endoctico altamente conservado iniciado pela formação de projeções de membrana semelhantes a folhas f-actin, também conhecidas como babados de membrana. O aumento da taxa de internalização do soluto macropinocético tem sido implicado em várias condições patológicas. Este protocolo apresenta um método para quantificar a formação de babados de membrana in vitro usando microscopia eletrônica de varredura.

Resumo

O babado da membrana é a formação de saliências de membrana plasmática motil contendo uma malha de filamentos de actina recém-polimerizados. Os babados de membrana podem se formar espontaneamente ou em resposta a fatores de crescimento, citocinas inflamatórias e ésteres de phorbol. Algumas das saliências da membrana podem se reorganizar em babados de membrana circular que se fundem em suas margens distais e formam copos que fecham e se separam no citoplasma como vacuoles grandes e heterogêneos chamados macropinossomos. Durante o processo, babados prendem fluido extracelular e solutos que internalizam dentro de macropinossomos. Microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (SEM) é uma técnica de imagem comumente usada para visualizar e quantificar a formação de babados de membrana, saliências circulares e copos macropinócticos fechados na superfície celular. O protocolo a seguir descreve as condições de cultura celular, estimulação da formação de babados de membrana in vitro e como corrigir, desidratar e preparar células para imagem usando SEM. Quantificação de babados de membrana, normalização de dados e estimuladores e inibidores da formação de babados de membrana também são descritos. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre o papel da macropinocistose nos processos fisiológicos e patológicos, investigar novos alvos que regulam a formação de babados de membrana e identificar estimuladores fisiológicos ainda não característicos, bem como novos inibidores farmacológicos da macropinocise.

Introdução

Macropinocistose é um processo endocítico responsável por internalizar uma grande quantidade de fluido extracelular e seu conteúdo através da formação de saliências dinâmicas e de membrana plasmática acionadas por atolética chamadas babados^{de membrana 1}. Muitos desses babados de membrana formam copos que se aproximam e se fundem de volta à célula e se separam da membrana plasmática como endosários intracelulares grandes e heterogêneos também conhecidos como macropinossomos¹. Embora a macropinocitose seja induzida por fatores de crescimento como fator estimulante da colônia de macrófago (M-CSF) e fator de crescimento epidérmico (EGF) em uma ampla gama de tipos celulares, um processo adicional único, dependente de cálcio conhecido como macropinocose constitutiva também foi observado em imunes inatas ^{2,3,4, 5}, 6, ^7,8.

A capacidade das células de internalizar material extracelular via macropinocise tem mostrado desempenhar um papel importante em uma variedade de processos fisiológicos que vão desde a captação de nutrientes até a captura de patógenos e apresentação de antígenos ^9,10,11. No entanto, como esse processo não é seletivo e induível, também foi implicado em uma série de condições patológicas. De fato, estudos anteriores sugeriram que a macropinocitose desempenha um papel importante na doença de Alzheimer, doença de Parkinson, câncer, nefriese e aterosclerose 12,13,14,15,16. Além disso, certas bactérias e vírus têm mostrado utilizar a macropinocitose para obter entrada em células hospedeiras e induzir a infecção^17,18. Curiosamente, a estimulação da macropinocitose também pode ser explorada para a entrega direcionada de agentes terapêuticos em diversas condições da doença^19,20.

Estudos anteriores exploraram a macropinocitose quantificando marcadores internalizados de fase fluida com marcação fluorescente na ausência e presença de agentes farmacológicos que inibem a macropinocitose usando citometria de fluxo e imagem confocal^21,22. Atualmente, as ferramentas farmacológicas disponíveis que inibem a macropinocistose estão limitadas e compreendem 1) inibidores de polimerização de actina (citochalasina D e latrunculinas), 2) bloqueadores pi3K (LY-290042 e wortmannin) e 3) inibidores de trocadores de hidrogênio de sódio (NHE) (amiloride e EIPA)5,14,15,23,24,25 . No entanto, como esses inibidores têm efeitos independentes da endocitose, é difícil determinar seletivamente a contribuição da macropinocise para a absorção de solutos e patogênese da doença especialmente in vivo²¹.

A microscopia eletrônica de varredura (SEM) é um tipo de microscópio eletrônico que produz imagens de ultra-alta resolução de células usando um feixe focalizado de elétrons²⁶. Na pesquisa de macropinocistose, a imagem SEM é considerada a técnica padrão-ouro para visualizar características topográficas e morfológicas da membrana plasmática, quantificar a formação de babados de membrana e investigar sua progressão para a internalização macropinosa. Além disso, a varredura da microscopia eletrônica combinada com a quantificação da absorção de soluto, na presença e ausência de bloqueadores de macropinocise, fornece uma estratégia confiável para examinar a internalização do soluto macropinocistótico in vitro. Este artigo fornece um protocolo detalhado sobre como preparar células para SEM, visualizar a superfície celular, quantificar a formação de babados e examinar seu progresso para o fechamento do copo e internalização macropinosa.

Protocolo

NOTA: O seguinte é um protocolo geral usado para quantificar a formação de babados de membrana em macrófagos RAW 264.7 utilizando microscopia SEM. A otimização pode ser necessária para diferentes tipos de células.

1. Linha celular e cultura celular

1. Grow RAW 264,7 macrófagos no DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco (DMEM) complementados com 10% (vol/vol) de bovino fetal inativado térmico (FBS), 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL streptomicina em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% DE CO₂. Substitua a mídia de crescimento a cada dois dias.
2. Quando as células se tornarem 80% confluentes, lave a placa duas vezes usando PBS estéril.
3. Despegar células adicionando 1.000 μL de 0,5% de trippsina-EDTA e incubar a placa de cultura celular por 3-5 min em uma incubadora umidificada a 37 °C.
4. Examine a placa sob um microscópio leve para confirmar a dissociação celular. Adicione 10 mL de mídia de crescimento contendo 10% de FBS para inativar trippsina.
5. Colete a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL e centrífuga a 400 x g por 5 min a temperatura ambiente. Resuspend suavemente células no meio completo da cultura celular e determinam a contagem de células e a viabilidade usando a coloração do Trypan Blue (0,4%) .
   NOTA: A viabilidade celular mínima recomendada para este experimento é >90%.
6. Coloque tampas de vidro estéreis em poços de uma placa de 24 poços usando fórceps autoclavados. As células de sementes em deslizamentos de cobertura a uma densidade de 1 x 10⁶ células/mL e incubam a placa durante a noite em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO₂.
7. Mude a mídia de cada poço com mídia completa de 500 μL fresca antes do tratamento. Macrófagos pré-tratados com veículo (DMSO ou outros solventes usados para dissolver o EIPA) ou o inibidor de macropinocise 5-(N-ethyl-N-isopropil)-Amiloride (EIPA, 25 μM²¹) por 30 min.
8. Tratar células com veículo e estimuladores de macropinocitose para promover o babado de membrana: phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA, 1 μM, 30 min²¹) e fator estimulante da colônia de macrófago (M-CSF, 100 ng/mL, 30 min³).
   NOTA: Inibidores alternativos [por exemplo, latrunculina A (1 μM, 30 min) ou citochalasina D (1 μM, 30 min)] e estimuladores [por exemplo, fator de crescimento epidérmico (EGF, 100 ng/mL, 10 min) ou fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] de macropinocose também pode ser usado para caracterizar macropinocise em macrófagos e outros tipos celulares^{16,27, 28,29}. As células podem exigir fome de soro durante a noite antes do tratamento com estimuladores fisiológicos da macropinocise. É importante notar que as concentrações mais eficazes e os tempos de incubação terão que ser determinados para estimular a macropinocitose em outros tipos de células.

2. Fixação SEM

1. Após o tratamento, aspire a mídia de poços e lave tampas com PBS gelado duas vezes.
2. Fixar células (4% de paraformaldeído e 2% glutaraldeído em 0,1 M de cacodilato de sódio) por 30 min à temperatura ambiente, seguido de incubação durante a noite no fixador a 4 °C.
3. Lave suavemente e incubar tampas com 500 μL de reagentes seguintes sem perturbar a monocamada celular.
   1. Lave uma vez em 0,1 M de cacodilato de sódio e incubar por 15 min.
   2. Lave duas vezes com dH₂O com incubação de 10 minutos em cada lavagem.
   3. Lave duas vezes com 25% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
   4. Lave duas vezes com 50% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
   5. Lave duas vezes com 75% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
   6. Lave duas vezes com 80% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
   7. Lave duas vezes com 95% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
   8. Lave duas vezes com 100% de etanol. Realize 10 min de incubação em cada lavagem.
      NOTA: A troca/substituição dos reagentes deve ser feita rapidamente para evitar a secagem do ar das células. As tampas podem ser deixadas em 100% de etanol por vários dias a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo, adicione 100% de etanol adicional e cubra poços com parafilm para evitar a secagem do ar da amostra.

3. Secagem de pontos críticos

1. Coloque as tampas em um Secador de Ponto Crítico e cubra com 100% de etanol. Pressione o botão Ligar e abra o tanque de CO₂ .
2. Pressione o botão Esfriar por aproximadamente 30 s até que a temperatura diminua para 0 °C. Pressione o botão Encher até que uma bolha apareça na janela da câmara.
3. Pressione o botão Desatenção até que o cheiro de etanol do escapamento do expurgo desapareça. Pressione novamente o botão Esfriar até que a temperatura diminua para 0 °C.
4. Pressione os botões Encher e Limpar para desligá-los e fechar o tanque de CO₂ . Pressione o botão Esfriar para desligá-lo e pressione o botão Aquecer.
5. Coloque a temperatura em 42 °C e a pressão em 1.200 psi. Uma vez que a pressão e a temperatura estabilizem, pressione o botão Sangrar para permitir que a pressão diminua lentamente.
6. Quando a pressão da câmara atingir 150 psi, pressione o botão Vent e espere até que a pressão diminua para 0 psi. Desligue o secador de ponto crítico e remova as tampas.
7. As tampas de montagem em montagens de alumínio SEM são montadas usando abas adesivas de carbono e sujeitas ao revestimento sputter usando ouro/paládio em um revestimento de sputter.
8. Ligue o botão Ligar e espere até que o vácuo atinja 30 mTorr. Lave a câmara para remover a umidade e o ar desligando o interruptor de gás e girando a válvula de gás fina no sentido anti-horário.
9. Uma vez que o vácuo aumenta para 200 mTorr desligue o interruptor de gás e espere até que o vácuo atinja 30 mTorr. Repita este passo 3 vezes.
10. Pressione o botão Temporizador e ajuste o botão de tensão até que o medidor leia 10 mA. Remova as tampas revestidas da câmara.
    NOTA: Siga as instruções do fabricante para realizar a secagem de pontos críticos e o revestimento da amostra.

4. Imagem e quantificação

1. Inserir manchas de amostra na câmara de um microscópio eletrônico de varredura. Feche a porta e pressione o botão Evac .
2. Abra o software de operação SEM. Coloque a tensão acelerada em 15 kv e a distância de trabalho para 10 mm.
3. Pressione o botão Coordenadas e mova-se ao redor do controlador até que as células apareçam no centro da tela de observação. Defina a ampliação em 3.500x e imagem da amostra clicando no botão Foto.
   NOTA: Use um nível mais elevado de ampliação (8.500x a 16.000x) para mostrar a membrana plasmática em maiores detalhes.
4. Faça imagens de pelo menos 10 locais aleatórios nas tampas, certificando-se de que cada campo microscópico contenha múltiplas células. Salvar imagens como .tif arquivos.
5. A partir das imagens, localize os babados de membrana, definidos como dobras salientes semelhantes a uma manta da membrana plasmática, com um tamanho superior a 500 nm (Figura 1). Conte o número de babados por célula.
   NOTA: Os babados em forma de C foram identificados como saliências de membrana curva que não se fundiram em suas extremidades laterais [(Figura 1 (tratamento M-CSF) e Figura 2B]. Babados de membrana circular fundido, antes de seu fechamento, foram identificados como copos macropinocéticos (Figura 2C).
6. Normalizar o número de babados de membrana para o número total de células no campo microscópico avaliado. Repita esta análise para as amostras de cada grupo.

Resultados

Aqui, descrevemos os resultados da técnica apresentada. As imagens representativas da SEM mostradas na Figura 1 demonstram a formação de babados de membrana em macrófagos RAW 264,7 após o tratamento com PMA e M-CSF. As imagens foram capturadas pela primeira vez em uma ampliação de 3.500x para fins de quantificação e, em seguida, em níveis mais elevados de ampliação (8.500x a 16.000x) para mostrar a membrana plasmática em maiores detalhes. Pré-tratamento de macrófagos com o ini...

Discussão

O presente protocolo de imagem SEM fornece uma ferramenta para visualizar e quantificar a formação de babados de membrana, saliências circulares e copos macropinócticos na superfície celular in vitro. Embora o protocolo atual se concentre em macrófagos, estudos têm demonstrado que a formação de babados de membrana também ocorre em vários outros tipos celulares, incluindo células dendríticas, fibroblastos, neurônios e células cancerosas 11,12,14,21,30.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
2% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
4% Paraformaldehyde	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive Tabs	Electron Microscopy Sciences	77825-09
Dimethyl Sulfoxide	Corning	25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Falcon	353047
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover Glass	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Pen Strep	Gibco	15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetate	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrophage	ATCC	ATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Critical Point Dryer	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Aluminum Specimen Mounts	Electron Microscopy Sciences	75220
Sodium Cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope