为生物医学和生物工程研究建立章鱼生态系统

摘要

了解章鱼独特的生理和解剖结构可以极大地影响生物医学研究。本指南展示了如何建立和维护海洋环境以适应该物种，并包括最先进的成像和分析方法，以可视化章鱼的神经系统解剖结构和功能。

摘要

生物医学研究的许多发展都受到发现支持不同物种特定功能的解剖学和细胞机制的启发。章鱼是这些特殊的动物之一，为科学家提供了对神经科学，机器人技术，再生医学和假肢领域的新见解。对这种头足类动物的研究需要建立复杂的设施，并为章鱼及其生态系统提供重症监护，这对项目的成功至关重要。该系统需要多个机械和生物过滤系统，为动物提供安全清洁的环境。除控制系统外，还需要专门的例行维护和清洁，以有效保持设施长期运行。建议通过改变水族箱的景观，加入各种猎物，并引入具有挑战性的任务，为这些聪明的动物提供丰富的环境。我们的结果包括MRI和全身自发荧光成像以及行为研究，以更好地了解他们的神经系统。章鱼具有独特的生理学，可以影响生物医学研究的许多领域。为他们提供可持续的生态系统是发现其独特能力的第一个关键步骤。

引言

生物医学研究和生物医学工程中的新概念通常受到确定生物物种所拥有的特定策略以应对环境和生理条件和挑战的启发。例如，了解萤火虫的荧光特性导致了新的荧光传感器的开发，可以报告其他模式生物的细胞活性¹;识别藻类中由光激活的离子通道已导致细胞和时间特异性基于光的神经调节的发展^{2，3，4，5};在玻璃鲶鱼中发现根据地球磁场导航的蛋白质导致了基于磁性的神经调节的发展^6，7，^{8，9，10，11};了解Aplysia中的虹吸反射有助于理解行为的细胞基础^12，13，14。

研究人员继续通过利用非常规实验室物种所具有的独特优势和对生理功能的新观点来扩展当前的生物工程和系统发育工具箱。联邦机构正开始通过资助对不同物种进行的新工作来支持这些研究。

章鱼属动物具有独特的解剖学和再生能力，以及对其每个手臂的适应性控制，迷人的生物学家和工程师，以及来自社会各个角落的迷人观众是章鱼¹⁷。事实上，在过去的几十年里，章鱼的生理和行为的许多方面都得到了研究^{15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26}.然而，分子和进化生物学，机器人技术，运动记录，成像，机器学习和电生理学的最新发展加速了与章鱼生理学和行为学相关的发现，并将其转化为创新的生物工程策略^27，28，^{29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39}.

在这里，我们描述了如何建立和维护章鱼饲养，这对来自不同背景，科学兴趣和目标的科学家和工程师来说既有趣又相关。尽管如此，我们的结果集中在章鱼在神经科学和神经工程研究中的应用。章鱼具有高度发达的神经系统，中枢脑有4500万个神经元，视叶有1.8亿个神经元，八个轴索和外周神经节有3.5亿个神经元;相比之下，狗的神经元数量相似，而猫只有其中的一半⁴⁰。与脊椎动物神经系统不同，只有32K传出和140K传入纤维将章鱼大脑中的数百万个神经元连接到其手臂每条轴向索中的数百万个神经元^40，41，42。这些相对较少的互连纤维表明，执行运动程序的大多数细节都是在轴索本身中执行的，强调了章鱼具有的独特分布的神经元控制。章鱼的手臂具有非凡的精细运动控制能力，使它们能够掌握诸如打开罐盖之类的操作技能，即使它们在容器内也是如此。这种高度发达的预制运动能力是头足类动物（章鱼、墨鱼和鱿鱼）^{所独有的43}。

事实上，通过数亿年的进化，章鱼已经发展出一个非凡而复杂的基因组和生理系统^43，44 ，激发了科学和工程领域的新发展和进步。例如，基于章鱼吸盘解剖结构的防水粘合剂贴片可以粘附在潮湿和干燥的表面上⁴⁵;受章鱼迷彩皮肤启发的合成迷彩材料可以将平坦的2D表面转换为带有凹凸和凹坑的三维表面⁴⁶。微型软体和自主机器人（即Octobots），将来可以作为体内的手术工具⁴⁷;并且还开发了连接到类似坦克的机器人⁴⁸ 的手臂（即OctoArm）。许多种类的章鱼用于生物医学研究，例如， 寻常章鱼， 中华章鱼， 变种章鱼和 双章鱼 （O. bimaculoides）;O. vulgaris 和O. bimaculoides 是最常见的^34，49，50。最近对不同章鱼基因组的测序使该属特别感兴趣，并为章鱼研究开辟了新的领域^{34，43，51，52}。

在我们的设置中使用的O. bimaculoides是一种中型章鱼物种，于1949年首次发现，可以在从加利福尼亚中部到下加利福尼亚半岛南部的东北太平洋海岸的浅水区找到¹⁷。它可以通过眼睛下方地幔上的假眼点来识别。与巨型太平洋章鱼（Enteroctopus dofleini）和普通章鱼（O. vulgaris）相比，加州双斑章鱼（O. bimaculoides）的尺寸相对较小，开始时小于几厘米，作为幼年生长迅速。当在实验室内饲养时，成年地幔大小可以长到100厘米的平均大小，重达800 ^g53，54。章鱼在最初的200天内有一个快速的生长期;到那时，他们被认为是成年人，并在余生中继续成长^55，56，57。章鱼可能是同类相食的，特别是当两性一起被安置在水箱内时;因此，它们需要单独存放在单独的储罐中⁵⁸。

研究方案

所有动物研究均由密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 八达通罐设备设置

1. 首先，获取将纳入海洋环境系统的水族馆的所有非生物材料，如 材料表所示。尺寸以英寸为单位提供。
2. 在安装之前，用70%乙醇和去离子（DI）水清洗所有管道，管道和过滤系统部件。清洁时请勿使用肥皂或任何其他化学品。
3. 放置一张13英寸x 49英寸x 1/2英寸（第71部分）的玻璃纤维桌子，其中四个桌腿由碳纤维制成，尺寸为2英寸x 2英寸x 23英寸（部件#72）。将支腿直接连接到桌面的角落下方。
4. 在顶面下方，在每个桌腿之间，放置2英寸x 2英寸长（第72部分）的碳纤维稳定支架，连接到桌子的底部，直接靠在顶部搁板的边缘。用螺钉将另一个尺寸相同的搁板直接固定在桌子下方的地面上。让泵（见 材料表）直接位于底部搁板表面，而罐位于顶部表面。该系统如图 1所示。
   注意:水箱的输出水是重力供给的，除进水和出水箱的油管外，所有油管都需要低于水箱的底部，以确保最大的排水头压力。

图1:八达通坦克设置。 进水和出水口（a）。三个章鱼水箱，面积为1.22米×0.3米（b）。 请点击此处查看此图的放大版本。

5. 使用玻璃切割钻头，从水箱的一侧钻一个13/4英寸的13/4英寸孔。出水吸盘的底部将确定输出孔的高度，如图 2a右侧所示。水位将由吸入过滤器决定，并且需要距离水箱顶部至少6英寸，以允许水飞溅区。
6. 使用PVC底漆和水泥永久连接各部分。为此，首先，将预期的公PVC管的末端滑入母管的末端。在男性部分的外部放置一块油漆工胶带，该胶带仍然可见，以防止底漆和水泥在管道外部显示。胶带后分离部件，并在在同一区域施用水泥后，在公管的外部涂上一层轻质底漆。
7. 将公管改装成母管，尽快涂上水泥后取下胶带。涂上底漆和水泥24小时后，用去离子水冲洗掉新连接的部件。有关固化时间，请查看水泥产品以获取进一步的说明。
   注:在使用PVC底漆和水泥之前，请确保所有管道和设备的设置正确放置;管道长度要求可能会有所不同。
8. 接下来，将吸盘的1英寸外径（OD）端永久连接到肘关节的1英寸内径（ID）端。将弯头接头的末端连接到直的PVC管（1英寸外径）。将直管的另一侧连接到直通式适配器母插座连接的 1 英寸 ID。
   注:ID是指管道内壁之间的最宽距离。外径是指管路的外侧宽度。
9. 将穿壁直型适配器永久连接到外径为 1 英寸的 4 英寸长 PVC 直管（从步骤 1.8 开始）。该管道将面向水箱。
10. 将直管永久连接到 PVC 连接器的中心（1 英寸 ID 三通体形状;从步骤 1.9 开始）。接下来，将两根 6 英寸长（部件 #69）的管道（外径 1 英寸）永久连接到三通接头的两端 - 一端直接朝上以用于空气释放，另一端直接朝下用于水流。
11. 将向下延伸的直管（从步骤 1.10 开始）永久连接到母插座倒钩管（1 英寸 ID）直适配器。将一根 36 英寸长的橡胶管（3/4 英寸内径）连接到倒钩管适配器。
12. 将冷却系统放置在出水管和集水池系统之间。
13. 将系统随附的 3/4 英寸倒钩接头连接到冷水机组的输入和输出端口。将橡胶管（从步骤1.11开始）放在冷却器的入口接头上。
14. 将一根新的3/4英寸ID管（从步骤1.13开始）从冷却器输出（从步骤1.12开始）连接到集水槽系统的入口，如图 2b所示。
15. 接下来，将孔径为200μm的4英寸x 12英寸袜子过滤器放入其指定区域，如图 2所示。此外，如图 2所示，将蛋白质分离器和回流泵放入适当的区域。与回油泵一起，将自动顶部关闭浮球阀连接到泵区域的内壁上，位于泵进水口顶部上方2英寸处;如果需要，不要阻止泵从油箱中取出。
16. 将一根 12 英寸长的直管（外径为 3/4 英寸）永久连接到泵的出口（从步骤 1.15 开始）。在3/4英寸外径直管的另一端，将管的外径永久连接到3/4英寸内径45°弯头接头。在接头的另一端，永久连接一个3/4英寸的外径管。
17. 将直管的另一端（从步骤1.16开始）连接到直变适配器的3/4英寸ID。将较大的适配器端（2 英寸外径）永久连接到紫外光的输入端。
    注:直管长度可能会有所不同。
18. 接下来，将紫外线入口的位置与泵的输出管（从步骤1.17开始）相匹配，以便管道不会在光和泵之间弯曲（从步骤1.15开始）。在防抖支架上钻孔以匹配紫外线连接孔。将螺钉的尺寸与钻头相匹配，并使用给定的螺钉将紫外线连接到工作台上。
19. 将另一个减速适配器的 2 英寸侧永久连接到紫外线输出端（从步骤 1.18 开始）。将 5 英寸长直管的 1 英寸外径连接到适配器的 1 英寸 ID 上。接下来，将带有1英寸ID的90°角片连接到1英寸外径管;使角片的未连接端指向水箱的一侧，水输入要去那里（与步骤1.5中的同一侧）。
20. 将拐角的另一端（从步骤1.19开始）永久连接到具有1英寸外径的6英寸长管（第69部分），并带有流量控制单元的输入（第2部分）。将另一个1英寸的外径管（第69部分）永久连接到流量监测单元的输出端;长度必须至少延伸到油箱侧面之外3英寸。
21. 使用13/4英寸玻璃切割钻头（第1部分），在预定水线上方3英寸处，距离水箱侧面2英寸处（图1a）切割一个新孔，该孔位于具有水输出孔的一侧对面。安装另一个透壁隔板配件，带有一个1英寸的滑轨（第77部分），面向油箱外。
22. 在隔板滑移上，永久连接一个外径为1英寸和4英寸长的直管（部件#69）。从步骤1.21的最后部分切下卡套管，以匹配该管与油箱延伸的距离相匹配。将一根 90° 管（部件 #65）永久连接到每个开口管道，并切割最终的 1 英寸外径直管（部件 #69），该管永久连接两个角件。
    注: 图3 显示了水族箱系统的简单表示。
23. 设置控制系统的其余部分（第 34 部分），首先将接线板（第 53 部分）安装到工作台本身或附近的墙上。在它旁边安装流体监测模块（第2部分）。
24. 将流量传感器、接线板和泄漏检测传感器连接到模块。设置连接到藻类箱的生长灯（第26部分）（图2）。
25. 将流量传感器、紫外线、生长灯、泵和蛋白质分离器插入能量棒。根据制造商手册设置水控制系统编程。
26. 通过将半杯市售盐混合物与1加仑反渗透（RO）或去离子（DI）水混合来制备盐水。制造45加仑以完全填充一个水箱和油底壳系统。
27. 打开集水坑系统流量控制器内的泵，并继续添加盐水，直到自动加满阀处于关闭位置，因此不需要额外的淡水。
28. 一旦水充满，停止加注并打开水冷却装置，将温度设置为18°C至22°C之间，因为这是优选的温度范围⁵³。打开蛋白质分离器。
29. 在水箱底部添加30公斤碎珊瑚，并在藻类箱底部添加一层碎珊瑚。添加多个活石和章鱼环境的任何其他添加物。放置顶部以覆盖罐的开口。
    注意:活岩是死珊瑚，栖息着宏观海洋生物，如细菌和藻类。
30. 按照包装上的指示添加盐水族箱中使用的硝化细菌。继续按照指示添加，每天使用水测试套件，pH传感器和温度传感器检查温度，盐度，pH值，氨，亚硝酸盐和硝酸盐。氨、亚硝酸盐和硝酸盐含量的安全值分别低于 0.5 ppm、0.25 ppm 和 10 ^ppm58。
31. 确保在添加硝化细菌的日子里关闭紫外线，以使盐水微生物生长。参数在安全范围内后，可以重新激活紫外线。
32. 系统建立后，还要检查pH值和氧合度是否分别为8.0-8.4和 ⁵⁹。在将任何动物添加到水族箱之前，请使用铜水测试套件检查系统中是否存在任何铜和氧水平。
    注意:铜对无脊椎动物造成损害，并干扰鱼鳃的渗透调节^60，61。
33. 如果在水中发现铜，请测试DI / RO水源。确定水源不含铜后，进行30%的换水，并将活性炭块（第46部分）放入水中。如果问题仍然存在，请进行完全换水并清洁所有部件。
34. 在确定所有水参数都在安全水平内后，在添加章鱼之前至少一周将10只幽灵虾添加到系统中。这将有助于引入细菌的生物质并指示整体水质。
35. 将额外的水族生态系统居民添加到藻类箱中。这包括 Chaetomorpha spp.（意大利面藻）， Trochus Sp。 （带状蜗牛）和 Mercenaria mercenaria （樱桃石蛤蜊）。

图2:油底壳系统。 油底壳系统的侧视图（a）。油底壳系统的顶视图（b）。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3:水族箱下方带有油底壳过滤系统的水族箱和环境控制单元。 绿色箭头表示流经系统的水流方向。水从第一部分流向第二部分进行冷却，然后流向第三部分，以将重生物物质与较轻物质分开。重废物漂浮到底部，流向第五部分，而较小的生物物质流入第四部分内的袜子过滤器。水从第五部分下方的四个流入蛋白质分离器，以六个形式去除水中的剩余废物。藻类箱含有微生物，可分解废物，氨和硝酸盐，并为水充氧。在系统的最后一部分，在泵送回水箱之前，添加更多的水以考虑蒸发。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 储罐

1. 设置两个高60加仑的储水箱，一个用于盐水，另一个用于RO水。确保淡水箱的最大填充线高于表。将1/4英寸的管子连接到集水坑系统中浮球阀的自动顶部，并将油管的另一端连接到淡水箱的底部。
   注意:这是在水蒸发时重新填充。盐会留在水中。
2. 用水加满盐水箱，并将成比例的盐加入水箱中。连续曝气盐水储存罐以进行混合和适当氧化。使用前等待一小时，以确保盐充分混合。
   注意:盐水箱可用于在清洁后重新填充水箱。

3. 食品罐设置

1. 为了使虾存活超过一周，请将它们与章鱼分开储存在单独的水箱中，盐度低于30 ppt，温度接近25°C。
2. 为此，在章鱼池成熟一周后，将8加仑的成熟盐水转移到虾缸中。将15公斤碎珊瑚加入水箱底部。在水箱中加入一些活石，以隐藏蜕皮点（图4）。
   注:成熟的海水是指允许海洋细菌在盐水中生长的过程，如步骤1.30所示。
3. 将罐式过滤器连接到罐的边缘。按照制造商的指示设置容器过滤器。在罐旁边添加一个空气泵，该泵连接到一个管子，并将一个附加的空气石放入罐中。
4. 每周清洁过滤器并更换过滤器垫。此外，25%的水需要同时更换。如步骤1.30所述，使用水测试套件每天检查食品罐中的氮气，pH值和温度参数。如果水氮参数保持较高，请进行额外的换水，并在水中加入氮吸收袋;或者，如果问题持续超过一个月，则需要将虾移到更大的水箱中。
5. 一旦粉碎的珊瑚沉积物消散，立即加入虾。要先添加虾，在到达时，将虾移动到不将水运到小盐水箱5分钟以除去生物废物。然后，可以将虾直接添加到水箱中。蚊子鱼在抵达时可以直接添加到虾缸中。
   注意:虾和蚊子鱼可以从材料表上列出的任何活体动物商业供应商或其他食品供应商处购买。也可以提供章鱼解冻虾。
6. 按照食物说明的指示，用鱼片，死植被或藻类⁶²喂养虾和鱼。
7. 对于蟹缸，加入1加仑盐水和10公斤鹅卵石。将鹅卵石堆放在一侧，一侧留下干燥的土地，另一侧留有2厘米的盐水（如图 4所示）。这些无脊椎动物的最佳环境水参数应分别为30-35 ppt和22-25°C，用于盐度和温度^11，63。
8. 将小提琴蟹直接加入水箱（图4）。螃蟹一生中的大部分时间都在陆地上度过，但一次可以在水下呆几天，这使得部分在水下的水箱对它们的长期生存至关重要。
9. 每天喂食一次小提琴手螃蟹，将鱼片加入水箱干燥区域的盘子中。每周通过去除螃蟹和更换100%的盐水来清洁。清理鹅卵石。
10. 将海洋双壳软体动物（蛤蜊和贻贝）储存在盐水箱内，供章鱼自行打开并提供另一种水过滤机制⁶⁴。
11. 第一周将贻贝放入单独的空置水箱内，以避免在章鱼水箱的过滤系统上放置不必要的废物负荷。
    注意:虽然贻贝一直是章鱼的首选食物，但它们更有可能在到达后不久死亡，如果它们大量存在，它们将大大增加水箱内的生物废物。

4. 将章鱼引入水箱

1. 确保氨、亚硝酸盐和硝酸盐水平分别低于 0.5 ppm、0.25 ppm 和 10 ppm。有水手泵可用来清除水箱中的章鱼墨水。还建议有两个人进行此手术。
2. 抵达后，将袋子放在秤上，并在取下章鱼后减去袋子的重量。在袋子里加入一块空气石，以增加水的氧合，同时将动物转移到他们的水箱中。测量运输水的温度和盐度。记录装运后长期患病的病例。
   1. 在不将任何水从袋子转移到水箱的情况下，将运输袋悬挂在水箱的角落，袋子部分浸没在水箱水中，以开始改变运输袋的温度。从袋子里取出10%的水，然后倒入水槽。将相同量的水从水箱中加入到袋子中。每10分钟重复一次，直到袋中的水温与水箱中的水温相差不超过1°。
   2. 一旦袋子和水箱的温差在1°以内，请确保戴上手套将章鱼移动到各自的水箱中。要移动，请将双手放在章鱼下方，以便在转移过程中提供支撑;第二个人需要从袋子的侧面轻轻拉动吸力的手臂。
   3. 一旦章鱼从袋子里出来，就迅速将其移动到新栖息地的水中，尽可能少地从运输袋中转移水。使用手动泵清除章鱼在水箱中释放的任何墨水。现在用水称量袋子，以获得动物的近似重量。
3. 到达后的前两周，监测章鱼的日常消费量，应约为其体重的4%至8%^58，65，66。章鱼应每天检查四次;2周后，这可以减少到每天两次。每两周称重一次，根据需要调整食物消耗量。
   注意:已知某些种类的章鱼会从其水箱中逃脱，因此建议将2.5公斤的重量放在其水箱的盖子上。

5. 日常护理

1. 使用市售的pH值、氨、亚硝酸盐和硝酸盐盐水检测试剂盒，将试剂盒导向量的罐水加入到试剂盒随附的四个试管中。按照测试试剂盒上的规定，将适量的比色反应物加入相应的管中。
2. 如果氨、亚硝酸盐和硝酸盐水平分别高于 0.5 ppm、0.25 ppm 和 10 ppm，则将生物质从袜子过滤器中洗出或更换为新的袜子过滤器。此外，用刷子清除撇渣器顶部的生物质，并向罐中添加额外的反硝细菌。如果问题仍然存在，则更换25%的新鲜盐水。
   注意:上述步骤可减少生态系统中的氮化合物。
3. 使用手动泵从水箱中清除所有死蟹和虾的尸体以及任何章鱼粪便。从水箱中取出所有剩余的活螃蟹，并将它们移回储罐。接下来，重新排列水箱内的大型物体。
4. 将章鱼每天吃的螃蟹数量的一半引入重达1.25 +/- 0.25克的水箱中。将解冻的虾或小型雄性小提琴蟹喂给幼年章鱼。根据实验的不同，螃蟹和虾可以直接引入水箱中的任何地方或章鱼。
   注意:章鱼每天的食物消耗量是其体重的4%-8%⁶⁷。冷冻虾也可以根据章鱼的体重作为食物来源提供。
5. 每天提供五只鬼虾。平均而言，在这个实验中消耗了三个。为了给章鱼提供各种食物，每周给一次活蛤蜊或贻贝，并始终在水箱内养三条蚊子鱼。
   注意:不需要给动物各种食物，可以防止动物在实验过程中被食物诱惑。这里用来最好地监测章鱼喂养和行为的喂养时间表是根据重量引入一半的螃蟹数量，并将虾的数量增加到早上五只。晚上，将螃蟹的后半部分引入水箱。

6. 每周卫生

1. 在清洁油底壳系统之前，请关闭撇油器、泵和藻类仓灯。然后，在除水之前关闭系统的自动阀。最后，仅从油底壳系统中取出撇油器和所有水。
2. 轻轻擦洗藻类箱，以去除其壁上的大部分生物质。用刷子清洁油底壳区域的其余部分。取出袜子过滤器，用醋清洗干净，让它干燥;每周轮换一次袜子过滤器，每三个月更换一次新的袜子过滤器。每周从撇渣器顶部去除并清除生物质。
   注意:避免使用金属清洁塑料，因为它会产生可能容易滋生微生物生长的划痕。
3. 将撇渣器放回系统中，开始用盐水重新填充。当泵区域开始充满时，所有系统都可以重新打开。当浮球阀的自动顶部处于关闭位置时，停止加水。

图4:小提琴蟹（Minuca pugnax）的水箱。 水箱的底部一半指定用于干床，另一半用于2厘米的浅盐水。 请点击此处查看此图的放大版本。

图5:幽灵虾（Paleemonetes paludosus）的水箱。 虾缸中的岩石为虾的藏身和蜕皮以及微生物的生长提供了场所。 请点击此处查看此图的放大版本。

7. 照顾身体不适的动物

1. 按照指南参考⁶⁶ 评估章鱼的健康状况。
   注意:对于雌性章鱼，生命周期的结束通常在产卵后开始。动物将开始减少食物消耗，并将完全停止进食，并变得更加昏昏欲睡。生命周期结束过程后的寿命各不相同。除了喂养和监测动物外，不能采取进一步的行动。衰老的男性会减少食物消耗并变得昏昏欲睡⁶⁸。

8. 章鱼麻醉

1. 进行章鱼麻醉，详见Butler-Struben等人⁶⁹。
2. 获得一个6升的容器，盖子至少为15厘米高。将 4 L 水直接从章鱼的水箱中放入容器中，并使用带有空气石的小型空气泵为 4 L 盐水提供曝气，以将氧气传播到水环境中⁵⁸。
3. 在引入章鱼之前，在容器中添加1%的EtOH。在处理章鱼之前，通过计算虹吸管呼出的水来记录每分钟的呼吸次数。
   注意:对于研究人员实验室内的章鱼，基线呼吸为每分钟16-24次呼吸。
4. 在移动章鱼之前，记录章鱼的皮肤色素沉着和基线呼吸频率。使用干净的4升开口容器将章鱼从水箱中取出，将其与周围的水一起舀起。
   注意:在麻醉期间，呼吸频率并不一定表示完全麻醉。
5. 在容器中称量章鱼的重量，然后通过将双手放在章鱼的身体上并将其抬起来移动它。可能需要第二个人从容器壁上取下吸出的肢体。
6. 快速将章鱼放入含有1%EtOH的准备好的容器中。合上盖子以防止可能的逃逸。
7. 通过计算前5分钟结束时虹吸水的呼气量来记录章鱼每分钟的呼吸量。如果呼吸保持在基线以上，并且动物继续对轻微的挤压做出反应，则在水中额外添加0.25%的EtOH。向水中加入乙醇可以继续达到最高3%的EtOH。
   注意:章鱼失去知觉的一个迹象是它失去了对染色体的控制。在这种情况下，皮肤看起来比正常人更苍白。另一个迹象是轻轻捏住手臂并测试是否有运动反应。如果此时仍然没有反应，章鱼是无意识的，可以进行实验。
8. 在麻醉下，监测章鱼的呼吸和颜色，以确保它在手术过程中保持无意识。如果章鱼在手术过程中开始醒来，请额外添加0.25%的EtOH。
9. 为了逆转乙醇麻醉的影响，将章鱼从其永久保持罐转移到新的4L或更大的含氧水罐中。一旦呼吸恢复正常，章鱼就会变得活跃，皮肤恢复正常色素;它可以移回其坦克。

9. 章鱼安乐死

1. 遵循章鱼安乐死的国际标准，详见Fiorito等人，Moltschaniwskyj等人和Butler-Struben等人^57，58，69。
2. 准备一个新的6升容器，装有4升来自章鱼储罐的水。将_MgCl2 混合至浓度为4%到安乐死罐中。执行从8.1到8.9的步骤来麻醉章鱼。
3. 将步骤8.8后的章鱼移动到安乐死罐中。呼吸停止后，等待5分钟，然后对章鱼进行分月，或在安乐死罐中再保持5分钟。

10. 双翅目动物的行为

1. 不要在早上喂章鱼，因为章鱼将被训练使用螺旋盖容器。设置指向要进食的区域的相机录制设备。
2. 获得一个50 mL螺旋盖管，整个表面有1 mm直径的孔，盖子用于整个容器中的水流。将小提琴螃蟹放入容器内。将一个砝码放在容器内或连接到外面，使其保持在罐的底部。
3. 将容器放在露天区域内的水箱底部，并看到章鱼和相机。如果螃蟹在4小时后没有被吃掉，那么将其从管中取出并恢复当天的喂养计划。每天继续进行此练习。
   注意:如图 6 所示，并在代表性结果部分中进行了讨论。

11. 八达通磁共振成像

注意:以前，在麻醉动物中测量章鱼视网膜中诱发的功能性MRI反应⁷⁰。在这里，我们获得了章鱼神经系统的超高空间分辨率MRI，这需要数小时的扫描。因此，这是在安乐死的 O. bimaculoides中进行的。

1. 使用7T系统获取MRI图像。用厨房级聚氯乙烯保鲜膜包裹章鱼，以保持组织的水分。将章鱼放在包装上，塞入两端，然后滚动密封。
2. 使用直径为4厘米的体积发送/接收线圈来获取大脑和多个手臂的图像。使用具有以下参数的 T1 加权 RARE 序列:重复时间 （TR） 为 1500 ms，回波时间 （TE） 为 20 ms，分辨率为 117 x 117 x 500 μm，平均值为 100，RARE 因子 8。这些是用于对啮齿动物大脑进行成像的典型MRI参数。使用稀有因子可加快成像速度，同时将 100 张图像平均在一起以增加信噪比⁷¹。
3. 使用86 mm体积的发射线圈和4 x 4 cm 4通道阵列接收线圈对章鱼臂进行成像。使用手术剪刀剪掉手臂，并将其放入充满磷酸盐缓冲盐水的15 mL锥形管中。
   注:该序列是一个T1_weighted反转恢复序列（MP-RAGE），参数为:TR/TE = 4000/2.17 ms，反转延迟1050 ms，分辨率为100 x 100 x 500 μm，9个平均值，扫描时间为1.5小时（图7）。反转恢复序列使来自水的信号为零，并增加图像内的对比度;之所以选择这个序列，是因为它可以可视化手臂的内部解剖结构⁷²。

12. 冷冻荧光断层扫描 （CFT） 成像

1. 闪光冻结章鱼:在通风橱中工作。用干冰覆盖杜瓦瓶的底部，然后填充六边形。在大约10分钟内将章鱼慢慢放入六边形中，根据需要加入新鲜的六边形和干冰，以用冷六边形完全覆盖章鱼。将章鱼冷冻在-20°C直至嵌入。
2. 嵌入并分割章鱼:使用CFT制造商提供的工具创建适当尺寸的矩形模具以容纳章鱼。用OCT（最佳切割温度）介质（组织学实验室中使用的标准材料）覆盖模具底部，并使其冻结成半固体凝胶。
3. 将冷冻的章鱼放入OCT的凝胶层中，然后用OCT慢慢覆盖2-3层。在浇注步骤之间，冻结块步骤，直到OCT处于凝胶阶段。章鱼完全覆盖后，在-20°C下将块冷冻至少12小时。
4. 将样品装入冷冻荧光断层扫描系统⁷³。
5. 使用3个发射/激发过滤器以介观分辨率对整个安乐死的双歧杆菌进行切片和成像，从而产生多个3D各向同性数据集。
6. 当切片到达手臂和消化系统时，将切片转移到载玻片上进行进一步的组织学检查。
7. 将原始数据集加载到 CFT 供应商专门设计的重建软件中，以实现快速处理。
8. 使用地标对准、直方图平衡、荧光校正和归一化重建三维堆栈，包括去除每个波长的地下荧光效应。
9. 一旦重建工具生成了最终的3D堆栈，使用成像软件工具可视化数据，并使用白光和荧光叠加以及3D最大强度投影（3D-MIPS）创建飞越，例如 图⁸⁷³。

结果

我们研究中的所有动物都是从野外获得的，因此它们的确切年龄无法确定，它们在实验室中的停留时间是可变的。每天观察章鱼的状况。我们没有看到寄生虫，细菌，皮肤损伤或异常行为。动物的平均体重为170.38 +/- 77.25克。每只动物都栖息在自己的40加仑水箱中。一周内记录的罐的参数的平均±标准偏差为:pH 8.4 ±0.0，盐度34.06±0.61 ppt，温度18.7±0.75°C，氨0.11±0.14 ppm，亚硝酸盐0.25±0.14 ppm，硝酸盐1....

讨论

系统设置:
水族馆生态系统的发展方式是采用过滤和氧化水的机械和生物方法。该系统的过滤元件利用袜子过滤器，蛋白质分离器和定期清洁来保持氮气和氧气水平。更重要的是，我们还依靠海洋微生物来消耗危险的含氮化合物和其他生物废物，并通过光合作用过程给水充气。除了使用藻类之外，向水中添加氧气的其他方法是通过带有附加空气石的外部曝气器。在添加任何细菌之前...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-3/4 in. Drill Bit	Home Depot	204074205	Glass cutting tool Part number:1
1" flow sensors	Neptune Systems	Local Dealer	Pipe with sensor to measure water flow Part number:2
1" Slip Bulkhead Strainer	Bulk Reef Supply	207113	Strainer for water leaving tank Part number:3
10 gallon tank	Preuss Pets	Local Dealer	Fiddler crab holding tank Part number:4
4 inch X 12 inch 200 Micron Nylon Monofiliment Mesh Filter Sock w/ Plastic Ring	AQUAMAXX	UJ41171	Filter for large organic matter in sump Part number:5
40 gallon aquarium	Preuss Pets	Local Dealer	4 Food aquarium tanks Part number:6
60g poly tanks - rectangle	Preuss Pets	Local Dealer	2 Water Storage (salt and freshwater) Part number:7
Active Aqua 1/10th HP Hydroponic or Aquarium Chiller 2018 Model	WayWe	719574198463	For cooling water continuously Part number:8
ALAZCO 2 Soft-Grip Handle Heavy-Duty Tile Grout Brush	ALAZCO	B06W2FT5V5	Tank Cleaning Part number:9
Ammonia Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	33D	For water testing Part number:10
Apex system WiFi	Neptune Systems	Local Dealer	System connection for off site monitoring Part number:11
API Aquarium Test Kit	Amazon	B001EUE808	For water testing Part number:12
API Copper Test Kit	Amazon	B0006JDWH8	For water testing Part number:13
Aqua Ultraviolet Classic UV 25 Watt Series Units	Aqua Ultraviolet	A00028	For removing bacteria leaving sump system Part number:14
AquaClear 50 Foam Filter Inserts, 3 pack	Aquaclear	A1394	Food Tank Carbon Filter Inserts Part number:15
Aqueon QuietFlow LED PRO Aquarium Power Filter 30	Aqueon	100106082	Food tank filtering units Part number:16
Auto Top Off Kit (ATK) (Each includes 1 FMM module, 2 optical sensors and 1 float)	Neptune Systems	Local Dealer	For freshwater tank Part number:17
Automatic top off from RODI (LLC)	Neptune Systems	Local Dealer	From water storage to octopus tanks Part number:18
Banded Trochus Snail	LiveAquaria	CN-112080	For algae bin Part number:19
Chaetomorpha Algae, Aquacultured	LiveAquaria	BVJ-76354	For algae bin Part number:20
Clams - Live, Hard Shell, Cherrystone, Wild, USA Dozen	Fulton Fish Market	N/A	Live food Part number:21
Classic Sea Salt Mix - Tropic Marin	Bulk Reef Supply	211813	Salt for tank water Part number:22
Clear Masterkleer Soft PVC Plastic Tubing, for Air and Water, 3/4" ID, 1" OD	McMaster	5233K71	Cleaning tool Part number:23
Continuum Aquablade-P Acrylic Safe Algae Scraper W/ Plastic Blade - 15 Inch	Marine Depot	4C31001	Cleaning tool Part number:24
Copper Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	65L	For water testing Part number:25
Curve Refugium CREE LED Aquarium Light	Eshopps	6500K	Algae bin light Part number:26
Eheim 1262 return pumps	EHEIM	1250219	Pump for storage tanks Part number:27
Eshopps R-100 Refugium Sump GEN 3	Eshopps	15000	Sump system Part number:28
Ethyl Alcohol, 200 Proof	Sigma-Aldrich	64-17-5	Anesthesia Part number:29
Extech DO600 ExStik II Dissolved Oxygen Meter	Extech	DO600	Oxygen measurement Part number:30
Fiddler Crabs; live; dozen	NORTHEAST BRINE SHRIMP	N/A	Live food Part number:31
Filter Cartridges	Aqueon	100106087	Food tank filters Part number:32
Florida Crushed Coral Dry Sand - CaribSea	Bulk Reef Supply	212959	Sediment for bottom of tank Part number:33
FMM module	Neptune Systems	Local Dealer	Controller for apex system Part number:34
Fritz-Zyme TurboStart 900 - Fritz	Bulk Reef Supply	213036	Bacteria start Part number:35
Hand Operated Drum Pump, Siphon, Basic Pump with Spout, For Container Type Bucket, Pail	Grainger	38Y789	Water Hand Pump Part number:36
High pH Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	27	For water testing Part number:37
Imagitarium Fine Mesh Net for Shrimp	Petco	2580993	Shrimp and fish transfer net Part number:38
Leak Detection Kit (LDK) - Includes FMM module plus 2 ALD sensors	Neptune Systems	Local Dealer	Placed on floor to detect water Part number:39
Lee`S Algae Scrubber Pad Jumbo - Glass	Marine Depot	LE12007	Cleaning tool Part number:40
Live rocks	Preuss Pets	Local Dealer	Habitat for octopus Part number:41
Long Bottle Cleaning Brush 17" Extra Long	Haomaomao	B07FS7J7PN	Tank Cleaning Part number:42
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M1028-100ML	Euthanasia Part number:43
Magnetic Probe Rack	Neptune Systems	Local Dealer	For holding apex sensor probes Part number:44
Marine Ghost Shrimp	NORTHEAST BRINE SHRIMP	N/A	Live food Part number:45
Marineland C-Series Canister Carbon Bags Filter Media, 2 count	Chewy	98331	For elevated copper levels Part number:46
Nitra-Zorb Bag	Aquarium Pharmaceuticals	AP2213	Absorbs nitrogen compounds Part number:47
Nitrate Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	LR1800	For water testing Part number:48
Nitrite Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	26	For water testing Part number:49
Pawfly 2 Inch Air Stones Cylinder 6 PCS Bubble Diffuser Airstones for Aquarium Fish Tank Pump Blue	Amazon	B076S56XWX	Aerate water Part number:50
Penn Plax Airline Tubing for Aquariums –Clear and Flexible Resists Kinking, 8 Feet Standard	Amazon	B0002563MM	Tubing for connecting air pump to air stone Part number:51
Plumbing with unions/valves plus 3/4" flex hose	Preuss Pets	Local Dealer	Water transport Part number:52
PM1 module	Neptune Systems	Local Dealer	Power control module for apex Part number:53
Protein skimmer	Reef Octopus	AC20284	Removes biowaste from system Part number:54
PVC Apex Mounting board, grommets, wire mounts	Neptune Systems	Local Dealer	Helps ensure organization for wires and tubing within system Part number:55
PVC Regular Cement and 4-Ounce NSF Purple Primer	Amazon	Oatey - 30246	For connecting PVC pipes Part number:56
RODI unit	Neptune Systems	Local Dealer	RO Water Part number:57
Salinity Probes	HANNA probes	HI98319	Measures salinity of water Part number:58
Seachem Pristine Aquarium Treatment	Seachem	1438	Provides bacteria that break down excess food, waste and detritus Part number:59
Seachem Stability Fish Tank Stabilizer	Seachem	116012607	Seachem Stability will rapidly and safely establish the aquarium biofilter in freshwater and marine systems Part number:60
Set of lexan tops	Preuss Pets	Local Dealer	Aquarium tank lids Part number:61
Set of Various extended length aquabus cables	Neptune Systems	Local Dealer	Cables for Apex system Part number:62
SLSON Aquarium Algae Scraper Double Sided Sponge Brush Cleaner Long Handle Fish Tank Scrubber for Glass Aquariums	Amazon	B07DC2TZCJ	Cleaning tool Part number:63
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 45 Degree Elbow Adapter, 3/4 Socket Female x 3/4 Socket Male	McMaster	4880K189	PVC pipe Part number:64
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 90 Degree Elbow Adapter, 1 Socket Female x 1 Socket Male	McMaster	4880K773	PVC pipe Part number:65
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Adapter, 1 Socket-Connect Female x 1 Barbed Male	McMaster	4880K415	PVC pipe Part number:66
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Straight Reducer, 2 Socket Female x 3/4 Socket Female	McMaster	4880K008	PVC pipe Part number:67
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Tee Connector, White, 1 Size Socket-Connect Female	McMaster	4880K43	PVC pipe Part number:68
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 1 Pipe Size, 10 Feet Long	McMaster	48925K13	PVC pipe Part number:69
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 3/4 Pipe Size, 5 Feet Long	McMaster	48925K92	PVC pipe Part number:70
Structural FRP Fiberglass Sheet, 48" Wide x 96" Long, 1/2" Thick	McMaster	8537K15	Table top material Part number:71
Structural FRP Fiberglass Square Tube, 10 Feet Long, 2" Wide x 2" High Outside, 1/8" Wall Thickness	McMaster	8548K33	Structural table material Part number:72
Tank Sediment	TopDawg Pet Supply	8479001207	Sediment for bottom of fiddler crab tank Part number:73
Temperature probe	Neptune Systems	Local Dealer	Temperature probe for tanks Part number:74
Tetra TetraMarine Large Saltwater Flakes for all Marine Fish	Amazon	B00025K0US	Fish, shrimp, and crab food Part number:75
Tetra Whisper Aquarium Air Pump for 10 gallon Aquariums	Petco	2335234	Air pump for smaller tanks Part number:76
Thick-Wall Through-Wall Pipe Fitting, for Water, PVC Connector, 1 Socket-Connect Female	McMaster	36895K843	PVC pipe Part number:77
Vectra s2 pump	Bulk Reef Supply	212141	Aquarium Pump Part number:78
Water Pump	TACKLIFE	GHWP1A	Pump for cleaning tanks Part number:79
Wyze Cam v2 1080p HD Indoor WiFi Smart Home Camera with Night Vision	Amazon	B076H3SRXG	DeepLabCut Recording Part number:80