Estabelecendo um ecossistema de polvo para pesquisa biomédica e bioengenharia

Resumo

Compreender as estruturas fisiológicas e anatômicas únicas dos polvos pode impactar muito a pesquisa biomédica. Este guia demonstra como configurar e manter um ambiente marinho para acomodar esta espécie e inclui imagens de última geração e abordagens analíticas para visualizar a anatomia e a função do sistema nervoso do polvo.

Resumo

Muitos desenvolvimentos em pesquisas biomédicas foram inspirados pela descoberta de mecanismos anatômicos e celulares que suportam funções específicas em diferentes espécies. O polvo é um desses animais excepcionais que deu aos cientistas novas percepções sobre os campos da neurociência, robótica, medicina regenerativa e próteses. Pesquisas com esta espécie de cefalópodes exigem a configuração de instalações complexas e cuidados intensivos tanto para o polvo quanto para seu ecossistema que é fundamental para o sucesso do projeto. Este sistema requer múltiplos sistemas de filtragem mecânica e biológica para fornecer um ambiente seguro e limpo para o animal. Junto com o sistema de controle, a manutenção e limpeza de rotina especializadas são necessárias para manter efetivamente a instalação funcionando a longo prazo. É aconselhável fornecer um ambiente enriquecido a esses animais inteligentes, mudando a paisagem do tanque, incorporando uma variedade de presas e introduzindo tarefas desafiadoras para que eles trabalhem. Nossos resultados incluem ressonância magnética e uma imagem de autofluorescência de corpo inteiro, bem como estudos comportamentais para entender melhor seu sistema nervoso. Polvos possuem fisiologia única que pode impactar muitas áreas da pesquisa biomédica. Fornecer-lhes um ecossistema sustentável é o primeiro passo crucial para descobrir suas distintas capacidades.

Introdução

Novos conceitos em pesquisa biomédica e engenharia biomédica são frequentemente inspirados na identificação de estratégias específicas que as espécies biológicas possuem para enfrentar as condições e desafios ambientais e fisiológicos. Por exemplo, a compreensão das propriedades de fluorescência em vagalumes levou ao desenvolvimento de novos sensores fluorescentes que podem relatar a atividade celular em outros organismos ^modelo1; identificar canais de íons ativados pela luz em algas levou ao desenvolvimento de neuromodulação de luz específica celular e ^{temporal2,3,4,5}; a descoberta de proteínas em bagres de vidro que navegam de acordo com o campo magnético da Terra levou ao desenvolvimento de neuromodulação de base magnética6,7,8,9,10,11; compreender o reflexo do sifão na Aplísia tem sido fundamental para a compreensão da base celular do comportamento12,13,14.

Os pesquisadores continuam a expandir-se sobre a atual bioengenharia e caixa de ferramentas filogenéticas, aproveitando os pontos fortes e novas perspectivas únicas sobre funções fisiológicas que espécies de laboratório não convencionais possuem. Os órgãos federais estão começando a apoiar essas linhas de estudos financiando novos trabalhos realizados em diversas espécies.

Um gênero de animais com capacidade única de anatomia e regeneração, bem como o controle adaptativo de cada um de seus braços, biólogos e engenheiros fascinantes, e audiências cativantes de todas as partes da sociedade são os ^Polvos17. De fato, muitos aspectos da fisiologia e comportamento do polvo foram estudados ao longo das últimas décadas15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . No entanto, desenvolvimentos recentes em biologia molecular e evolutiva, robótica, gravação de movimento, imagem, aprendizado de máquina e eletrofisiologia aceleram descobertas relacionadas à fisiologia e comportamento do polvo e as traduzem em estratégias inovadoras de bioengenharia27,28,29,30,31,32,33,34,35 36,37,38,39.

Aqui descrevemos como criar e manter a criação de polvos, o que seria de interesse e relevância para cientistas e engenheiros de diferentes origens, interesses científicos e objetivos. No entanto, nossos resultados se concentram na aplicação de polvos em neurociência e pesquisa de neuroengenharia. O polvo tem um sistema nervoso altamente desenvolvido com 45 milhões de neurônios no cérebro central, 180 milhões de neurônios nos lobos ópticos e 350 milhões de neurônios adicionais nos oito cabos axiais e gânglios periféricos; em comparação, um cão tem um número semelhante de neurônios e um gato apenas metade ^dele40. Ao contrário do sistema nervoso vertebrado, há apenas fibras diferentes e 140K que conectam os milhões de neurônios no cérebro do polvo aos milhões de neurônios em cada um dos cabos axiais de seu braço40,41,42. Essas relativamente poucas fibras interconectadas sugerem que a maioria dos detalhes para a execução dos programas motores são realizados no próprio cabo axial, enfatizando o controle neuronal exclusivamente distribuído que os polvos possuem. Os braços do polvo têm um controle motor fino extraordinário, permitindo-lhes habilidades de manipulação, como abrir tampas de frascos, mesmo quando estão dentro do recipiente. Esta capacidade motora preênsil altamente desenvolvida é exclusiva da classe de Cefalópodes (polvo, cuttlefish e lula)⁴³.

De fato, através de centenas de milhões de anos de evolução, o polvo desenvolveu um notável e sofisticado genoma e sistema fisiológico43,44 que inspirou novos desenvolvimentos e progressos em campos científicos e de engenharia. Por exemplo, um adesivo resistente à água baseado na estrutura anatômica dos do polvo pode grudar em superfícies molhadas e ^secas45; um material de camuflagem sintética inspirado na pele de camuflagem do polvo pode transformar uma superfície plana e 2D em uma tridimensional com solavancos e ^poços46. Robôs macios e autônomos em miniatura (ou seja, Octobots) que no futuro poderiam servir como ferramentas cirúrgicas dentro do ^corpo47; e um braço (ou seja, OctoArm) ligado a um robô semelhante a um ^tanque48 também foram desenvolvidos. Muitas espécies de polvos são usadas em pesquisas biomédicas, por exemplo, Polvo vulgaris, Polvo sinensis, Polvo variabilis e polvo bimaculoides (O. bimaculoides); o O. vulgaris e O. bimaculoides sendo os mais comuns34,49,50. O sequenciamento recente de diferentes genomas de polvo torna esse gênero de particular interesse e abre novas fronteiras na pesquisa de polvo34,43,51,52.

O. bimaculoides usados em nossa configuração é uma espécie de polvo de tamanho médio, descoberta pela primeira vez em 1949, que pode ser encontrada em águas rasas ao largo da costa nordeste do Pacífico, do centro da Califórnia ao sul da península da Baja ^{Califórnia17}. Pode ser reconhecido pelos falsos olhos em seu manto abaixo de seus olhos. Comparado ao Polvo Do Pacífico Gigante (Enteroctopus dofleini) e ao Polvo Comum (O. vulgaris), o Polvo de Dois Pontos da Califórnia (O. bimaculoides) é relativamente pequeno em tamanho, começando menor que alguns centímetros, crescendo rapidamente como um jovem. Quando criado dentro de um laboratório, o tamanho do manto adulto pode crescer para um tamanho médio de 100 cm e pesar até 800 ^g53,54. Os polvos têm um rápido período de crescimento nos primeiros 200 dias; até lá, eles são considerados adultos e continuam a crescer ao longo do resto de suas vidas55,56,57. Polvos podem ser canibais, especialmente quando ambos os sexos estão alojados juntos dentro de um tanque; portanto, eles precisam ser alojados individualmente em tanques ^separados58.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual de Michigan.

1. Configuração do equipamento do tanque de polvo

1. Primeiro, obter todos os materiais não biológicos para um aquário que será incorporado ao sistema ambiental marinho, conforme mostrado na Tabela de Materiais. Os tamanhos são fornecidos em polegadas.
2. Lave todas as peças do sistema de tubos, tubulações e filtros com 70% de etanol e água desionizada (DI) antes da instalação. Não use sabão ou outros produtos químicos durante a limpeza.
3. Coloque uma mesa de fibra de vidro de 13 polegadas x 49 polegadas x 1/2 polegada (Parte #71) com quatro pernas de mesa feitas de fibra de carbono e com as dimensões de 2 polegadas x 2 polegada x 23 polegadas (Parte #72). Fixar as pernas diretamente sob os cantos da mesa.
4. Abaixo da superfície superior, entre cada uma das pernas da mesa, coloque suportes de estabilização de fibra de carbono de 2 polegadas x 2 polegadas (parte #72) presos na parte inferior da mesa e diretamente contra a borda da prateleira superior. Conecte com parafusos outra prateleira com as mesmas dimensões diretamente no chão abaixo da tabela. Deixe a bomba (ver Tabela de Materiais) sentar-se diretamente na superfície inferior da prateleira enquanto o tanque se senta na superfície superior. Este sistema é mostrado na Figura 1.
   NOTA: A saída de água do tanque é alimentada pela gravidade e todos os tubos, exceto os que se alimentam dentro e fora do tanque, precisam ser inferiores ao fundo do tanque para garantir a máxima pressão da cabeça de drenagem.

Figura 1: Configuração do tanque de polvo. Entrada e saída de água (a). Três tanques de polvo cada um com uma área de 1,22 m x 0,3 m (b). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Faça um único furo de 13/4 polegadas, 2 polegadas de um dos lados do tanque, usando brocas de corte de vidro. A parte inferior da tela de sucção da saída de água determinará a elevação do orifício de saída, conforme mostrado no lado direito da Figura 2a. O nível da água será determinado pela tela de sucção e precisará estar a pelo menos 6 polegadas do topo do tanque permitindo uma zona de respingo de água.
6. Use um primer de PVC e cimento para conectar permanentemente as seções. Para isso, primeiro, deslize a extremidade do tubo de PVC masculino pretendido para a extremidade do tubo feminino. Coloque um pedaço da fita dos pintores na parte externa da parte masculina que ainda é visível para evitar que o primer e o cimento aparecendo na parte externa do tubo. Separe as peças após a gravação e coloque uma leve camada de primer na parte externa do tubo masculino após a aplicação do cimento na mesma área.
7. Recoloque o tubo masculino no tubo feminino, o mais rápido possível, após a aplicação do cimento e remova a fita. 24 h após a aplicação do primer e cimento, lave as peças recém-conectadas com água DI. Para o tempo de cura, olhe para o produto de cimento para mais direções.
   NOTA: Certifique-se de que a configuração de todos os tubos e equipamentos seja colocada corretamente antes de usar primer de PVC e cimento; Os requisitos de comprimento do tubo podem variar.
8. Em seguida, conecte permanentemente a extremidade de 1 polegada de diâmetro externo (OD) da tela de sucção à extremidade de diâmetro interno (ID) de 1 polegada da articulação do cotovelo. Conecte a extremidade da articulação do cotovelo à tubulação de PVC reto (1 polegada OD). Conecte o outro lado da tubulação reto e, em seguida, ao ID de 1 polegada da conexão feminina adaptador reto da parede.
   NOTA: O ID refere-se à maior distância entre as paredes internas do tubo. OD refere-se à parte externa da largura do tubo.
9. Conecte permanentemente o adaptador reto da parede a um tubo de PVC de 4 polegadas de comprimento com um OD de 1 polegada (a partir da etapa 1.8). Este cano vai sair do tanque.
10. Conecte permanentemente o tubo reto ao centro do conector de PVC (1 polegada em forma de ID Tee; a partir do passo 1.9). Em seguida, conecte permanentemente dois tubos de 6 polegadas de comprimento (parte #69) (1 polegada OD) para ambas as extremidades opostas do conector tee-um voltado diretamente para cima para a liberação de ar e o outro diretamente para baixo para o fluxo de água.
11. Conecte permanentemente o tubo reto estendido para baixo (a partir da etapa 1.10) a um adaptador reto de cano farpado de soquete feminino (ID de 1 polegada). Conecte um tubo de borracha de 36 polegadas de comprimento (3/4 polegadas ID) ao adaptador de tubos farpados.
12. Coloque o sistema de resfriamento entre a tubulação de saída de água e o sistema de súmia.
13. Conecte os encaixes de barb de 3/4 polegadas, que vem com o sistema, às portas de entrada e saída da unidade de refrigerção. Coloque o tubo de borracha (a partir do passo 1.11) no encaixe da entrada do refrigerador.
14. Conecte uma nova peça de tubo de ID de 3/4 polegadas (a partir da etapa 1.13) da saída do refrigerador (a partir da etapa 1.12) à entrada do sistema de sump, como mostrado na Figura 2b.
15. Em seguida, coloque o filtro de meia de 4 polegadas x 12 polegadas, com tamanho de poros de 200 μm, em sua área designada, como mostrado na Figura 2. Além disso, como descrito na Figura 2, coloque o skimmer de proteína e a bomba de retorno em suas áreas apropriadas. Juntamente com a bomba de retorno, conecte a válvula de flutuação de topo automático à parede interna da área da bomba, 2 polegadas acima do topo da entrada de água da bomba; não bloqueie que a bomba seja removida do tanque, se necessário.
16. Conecte permanentemente um tubo reto de 12 polegadas de comprimento (3/4 polegadas OD) à tomada da bomba (a partir da etapa 1,15). Na outra extremidade do tubo reto de 3/4 polegadas OD, conecte permanentemente o OD do tubo a uma articulação de cotovelo de 3/4 polegadas ID 45°. Na outra extremidade da articulação, conecte permanentemente uma tubulação OD de 3/4 polegadas.
17. Fixar a outra extremidade do tubo reto (da etapa 1.16) ao ID de 3/4 polegadas de um adaptador de redução reta. Conecte permanentemente a extremidade adaptador maior (OD de 2 polegadas) à entrada da luz UV.
    NOTA: Os comprimentos de tubulação reto podem variar.
18. Em seguida, combine a colocação da entrada de luz UV com o tubo de saída da bomba (a partir da etapa 1.17) para que o tubo não esteja dobrando entre a luz e a bomba (a partir do passo 1.15). Faça furos na cinta de estabilização para combinar com os orifícios de fixação da luz UV. Combine o tamanho dos parafusos com a broca e conecte a luz UV à mesa usando os parafusos dados.
19. Conecte permanentemente o lado de 2 polegadas de outro adaptador redutor à saída da luz UV (a partir da etapa 1.18). Conecte um OD de 1 polegada de um tubo reto de 5 polegadas de comprimento ao ID de 1 polegada do adaptador. Em seguida, conecte uma peça de canto de 90° com o ID de 1 polegada ao tubo OD de 1 polegada; ter a extremidade desapegada da peça de canto apontando para o lado do tanque onde a entrada de água é destinada a ir (mesmo lado da etapa 1.5).
20. Conecte permanentemente a outra extremidade do canto (da etapa 1.19) a um tubo de 6 polegadas de comprimento (Parte #69) com OD de 1 polegada com a entrada da unidade de controle de fluxo (Parte #2). Conecte permanentemente outro tubo OD de 1 polegada (Parte #69) à saída da unidade de monitoramento de fluxo; o comprimento deve estender pelo menos 3 polegadas além do lado do tanque.
21. Usando uma broca de corte de vidro de 13/4 polegadas (Parte #1), corte um novo orifício 3 polegadas acima da linha d'água pretendida e 2 polegadas de distância do lado do tanque (Figura 1a) na lateral oposta à que tem orifício de saída de água. Conecte outro encaixe de anteparo na parede com um deslizamento de 1 polegada (Parte #77) voltado para fora do tanque.
22. Ao deslizamento do anteparo conecte um tubo reto com o OD de 1 polegada e 4 polegadas de comprimento (Parte #69) permanentemente. Reduza a tubulação da última parte da etapa 1.21 para combinar com a distância que este tubo se estende do tanque. Conecte permanentemente um tubo de 90° (Parte #65) a cada um dos tubos abertos e corte um tubo reto OD de 1 polegada final (Parte #69) que conecta permanentemente ambas as peças de canto.
    NOTA: A Figura 3 mostra uma representação simples do sistema de aquário.
23. Configure o resto do sistema de controle (Parte #34), primeira montagem da tira de alimentação (Parte #53) para a própria mesa ou para uma parede próxima. Ao lado dele, monte o módulo de monitoramento de fluidos (Parte nº 2).
24. Conecte o sensor de fluxo, a tira de alimentação e os sensores de detecção de vazamento ao módulo. Configure a luz de crescimento (parte #26) que está anexada à caixa de algas (Figura 2).
25. Conecte o sensor de fluxo, luz UV, luz de crescimento, bomba e skimmer de proteínas para a barra de energia. Configure a programação do sistema de controle de água de acordo com o manual do fabricante.
26. Prepare a água salgada misturando meia xícara de mistura de sal comercialmente disponível com 1 galão de osmose reversa (RO) ou água desionizada (DI). Faça 45 galões para encher totalmente um tanque e sistema de soma.
27. Ligue a bomba dentro do controlador de fluxo do sistema de sump e continue adicionando água salgada até que a válvula de topo automático esteja na posição desligada para que não seja necessária água doce adicional.
28. Uma vez que a água esteja cheia, pare de encher e ligue a unidade de refrigeração da água para definir a temperatura entre 18 °C e 22 °C, pois esta é a faixa de temperatura ^{preferível53}. Ligue o skimmer de proteínas.
29. Adicione 30 kg de coral esmagado ao fundo do tanque, bem como uma camada de coral esmagado no fundo da caixa de algas. Adicione várias rochas vivas e quaisquer outras adições ao ambiente do polvo. Coloque uma parte superior para cobrir a abertura do tanque.
    NOTA: Rochas vivas são corais mortos que são habitados por vida marinha macroscópica, como bactérias e algas.
30. Adicione bactérias nitrificantes utilizadas nos aquários de água salgada conforme indicado na embalagem. Continue adicionando isso conforme indicado, verificando temperatura, salinidade, pH, amônia, nitrito e nitrato diariamente com kits de teste de água, sensor de pH e sensor de temperatura. Os valores seguros para os níveis de amônia, nitrito e nitrato estão abaixo de 0,5 ppm, 0,25 ppm e 10 ppm, ^{respectivamente,58}.
31. Certifique-se de que a luz UV seja desligada durante os dias de nitrifiquendo bactérias está sendo adicionada para permitir que os microrganismos de água salgada cresçam. Depois que os parâmetros estiverem dentro de faixas seguras, a luz UV pode ser reativada.
32. Após a implantação do sistema, verifique também se o pH e a oxigenação estão em 8,0-8,4 e ⁵⁹, respectivamente. Antes de adicionar qualquer animal ao aquário, verifique se há níveis de cobre e oxigênio dentro do sistema usando um kit de teste de água de cobre.
    NOTA: O cobre causa danos aos invertebrados e interfere com a osmoregulação nas brânquias ^{de peixe60,61}.
33. Se o cobre for encontrado na água, teste a fonte de água DI/RO. Depois de determinar que a fonte de água não contém cobre, realize uma troca de água de 30% e coloque o bloco de carbono ativado (Parte #46) dentro da água. Se o problema persistir, realize uma troca completa de água e limpe todas as peças.
34. Depois de todos os parâmetros de água serem determinados a estar dentro de níveis seguros, adicione 10 camarões fantasmas ao sistema pelo menos uma semana antes de adicionar os polvos. Isso ajudará a introduzir a biomassa para bactérias e indicar a qualidade geral da água.
35. Adicione mais habitantes do ecossistema de aquário à lixeira de algas. Isso inclui Chaetomorpha spp. (algas de espaguete), Trochus Sp. (caracol de trochus banded), e Mercenaria mercenaria (moluscos de cereja).

Figura 2: Sistema sump. Visão lateral do sistema sump (a). Vista superior do sistema sump (b). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Aquário com sistema de filtragem sump abaixo do tanque e unidades de controle ambiental. Setas verdes indicam a direção do fluxo de água através do sistema. Água fluindo da seção um para dois para resfriamento e para três para separar matéria biológica pesada da matéria mais leve. Resíduos pesados flutuam para o fundo e para fora para a seção cinco, enquanto a matéria biológica menor flui para o filtro de meia dentro da seção quatro. A água flui de quatro por baixo da seção cinco entrando no skimmer de proteína em seis para remover resíduos restantes dentro da água. A caixa de algas contém microrganismos para quebrar resíduos, amônia e nitratos, bem como oxigenar a água. Na última parte do sistema, mais água é adicionada para explicar a evaporação antes de ser bombeada de volta para o tanque. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Tanques de armazenamento

1. Configure dois tanques de armazenamento de água de 60 galões altos, um para a água salgada e outro para água ro. Certifique-se de que a linha máxima de enchimento do tanque de água doce é mais alta que a mesa. Conecte uma tubulação de 1/4 polegada à parte superior automática da válvula flutuante no sistema de sump e conecte a outra extremidade da tubulação ao fundo do tanque de água doce.
   NOTA: Isto é para reabastecer se a água evaporar. O sal vai ficar na água.
2. Encha o reservatório de água salgada com água e adicione a quantidade proporcional de sal ao tanque. Aerar continuamente o tanque de armazenamento de água salgada para mistura e oxigenação adequada. Aguarde uma hora antes do uso para garantir a mistura completa do sal.
   NOTA: O tanque de água salgada é útil para reabasteceção dos tanques após a limpeza.

3. Configuração do tanque de alimentos

1. Para manter o camarão vivo por mais de uma semana, armazene-os em um tanque separado do polvo com a salinidade abaixo de 30 ppt e a temperatura próxima a 25 °C.
2. Para isso, uma semana após a maturação dos tanques de polvo, transfira 8 galões de água salgada amadurecida para o tanque de camarão. Adicione 15 kg de coral esmagado no fundo do tanque. Adicione algumas rochas vivas ao tanque para esconder pontos para fundição (Figura 4).
   NOTA: A água do mar amadurecida refere-se ao processo de permitir que as bactérias marinhas cresçam dentro da água salgada, como mostrado na etapa 1,30.
3. Conecte um filtro de cannister à borda do tanque. Configure o filtro do recipiente conforme indicado pelo fabricante. Adicione uma bomba de ar ao lado do tanque conectada a um tubo com uma pedra de ar presa colocada no tanque.
4. Limpe o filtro e troque as almofadas do filtro toda semana. Além disso, 25% da água precisará ser trocada ao mesmo tempo. Verifique os parâmetros de nitrogênio, pH e temperatura diariamente nos reservatórios de alimentos com kits de teste de água, conforme descrito na etapa 1.30. Se os parâmetros de nitrogênio da água permanecerem altos, realize mudanças adicionais de água e adicione um saco absorvente de nitrogênio à água; ou se os problemas persistirem por mais de um mês, o camarão precisará ser movido para um tanque maior.
5. Adicione camarão assim que o sedimento de coral esmagado for dissipado. Para adicionar camarão primeiro, na chegada, mova o camarão sem enviar água para o pequeno tanque de água salgada por 5 minutos para remover o biomusícula. Em seguida, o camarão pode ser adicionado diretamente ao tanque. Os peixes-mosquitos, na chegada, podem ser adicionados diretamente ao tanque de camarão.
   NOTA: Os peixes de camarão e mosquito podem ser adquiridos de qualquer fornecedor comercial de animais vivos listados na folha de material ou outros fornecedores de alimentos. Também é possível oferecer polvos de camarão descongelado.
6. Alimente camarão e peixes com flocos de peixe, vegetação morta ou ^algas62, conforme orientação sobre as instruções alimentares.
7. Para o tanque de caranguejo, adicione 1 galão de água salgada e 10 kg de seixos. Empilhe as pedras de um lado deixando terra seca de um lado e 2 cm de água salgada do outro lado (como observado na Figura 4). Os parâmetros de água ambiental ideal para esses invertebrados devem ser de 30-35 ppt e 22-25 °C para salinidade e ^{temperatura11,63}, respectivamente.
8. Adicione caranguejos violinista diretamente no tanque (Figura 4). Os caranguejos passarão a maior parte de suas vidas em terra, mas podem ficar debaixo d'água por alguns dias de cada vez, tornando o tanque que está parcialmente subaquático crucial para sua sobrevivência a longo prazo.
9. Alimente caranguejos violinista uma vez por dia adicionando flocos de peixe no prato na área seca do tanque. Limpe semanalmente removendo caranguejos e alterando 100% da água salgada. Limpe as pedras.
10. Armazene moluscos de bivalve marinhos (moluscos e mexilhões) dentro dos tanques de água salgada para que os polvos se abram e forneçam outro mecanismo de filtragem de ^água64.
11. Coloque mexilhões dentro de um tanque separado desocupado durante a primeira semana para evitar colocar uma carga de resíduos desnecessária no sistema de filtragem do tanque do polvo.
    NOTA: Embora os mexilhões tenham sido o alimento preferido do polvo, eles são mais propensos a morrer logo após a chegada e aumentarão substancialmente os resíduos biológicos dentro do tanque se estiverem presentes em grandes quantidades.

4. Introdução do polvo ao tanque

1. As níveis de amônia, nitrito e nitrato estão abaixo de 0,5 ppm, 0,25 ppm e 10 ppm, respectivamente. Tenha a bomba de mão de água disponível para remover tinta de polvo do tanque. Também é recomendado ter duas pessoas para este procedimento.
2. Na chegada, coloque o saco na balança e subtraia o peso do saco após a retirada do polvo. Adicione uma pedra de ar ao saco para aumentar a oxigenação da água enquanto transfere o animal para seu tanque. Meça a temperatura e a salinidade da água do transporte. Casos recordes de doença prolongada após o embarque.
   1. Sem transferir água do saco para o tanque, pendure o saco de transporte sobre o canto do tanque com o saco parcialmente submerso na água do tanque para começar a mudar a temperatura do saco de transporte. Retire 10% da água do saco e despeje na pia. Adicione a mesma quantidade de água do tanque ao saco. Repita a cada 10 minutos até que a temperatura da água no saco não seja superior a 1° diferente da temperatura da água no tanque.
   2. Uma vez que a diferença de temperatura do saco e do tanque estejam dentro de 1°, certifique-se de que as luvas sejam usadas para mover os polvos para o tanque individual. Para se mover, coloque as duas mãos sob o polvo para fornecer suporte durante a transferência; a segunda pessoa precisará puxar suavemente os braços aspirados do lado do saco.
   3. Uma vez que o polvo está fora do saco, mova-o rapidamente para a água de seu novo habitat transferindo o mínimo de água do saco de transporte possível. Use a bomba manual para remover qualquer tinta que o polvo solte quando estiver no tanque. Agora pese o saco com água para obter peso aproximado do animal.
3. Nas primeiras 2 semanas após a chegada, monitore o consumo diário do polvo que deve ficar em torno de 4% a 8% de seu peso58,65,66. O polvo deve ser verificado quatro vezes por dia; isso pode ser reduzido para duas vezes por dia após 2 semanas. Pesar a cada duas semanas para ajustar o consumo alimentar conforme necessário.
   NOTA: Algumas espécies de polvo são conhecidas por escapar de seu tanque, por isso é aconselhável colocar um peso de 2,5 kg na tampa de seu tanque.

5. Cuidados diários

1. Usando um kit de teste de água salgada comercialmente disponível para pH, amônia, nitrito e nitrato, adicione a quantidade direcionada de água do tanque aos quatro tubos de ensaio fornecidos com o kit. Conforme especificado no kit de teste, adicione a quantidade de reativo colorimétrico ao tubo correspondente.
2. Se os níveis de amônia, nitrito e nitrato estiverem acima de 0,5 ppm, 0,25 ppm e 10 ppm, respectivamente, lave a biomassa do filtro de meia ou mude para um novo filtro de meia. Além disso, limpe a biomassa do topo do skimmer com um pincel e adicione bactérias denitificantes adicionais ao tanque. Se os problemas persistirem, substitua 25% da água salgada fresca.
   NOTA: As etapas acima reduzem os compostos de nitrogênio dentro do ecossistema.
3. Remova todas as carcaças de caranguejo e camarão mortos do tanque, bem como qualquer matéria fecal de polvo usando uma bomba de mão. Remova todos os caranguejos vivos restantes do tanque e mova-os de volta para o tanque de armazenamento. Em seguida, reorganize objetos grandes dentro do tanque.
4. Introduza metade do número de caranguejos que o polvo comeria diariamente no tanque pesando 1,25 +/- 0,25 g. Alimente camarão descongelado ou pequenos caranguejos machos para polvos juvenis. Dependendo do experimento, caranguejos e camarões podem ser introduzidos em qualquer lugar do tanque ou no polvo diretamente.
   NOTA: O consumo diário de alimentos é de 4%a 8% do seu ^peso67. Camarão congelado também pode ser fornecido como uma fonte de alimento com base no peso do polvo.
5. Ofereça cinco camarões fantasmas diariamente. Em média, três foram consumidos neste experimento. Para fornecer uma variedade de alimentos para o polvo, dê um molusco vivo ou mexilhões uma vez por semana e mantenha sempre três peixes mosquitos dentro do tanque.
   NOTA: Não é necessário dar aos animais uma variedade de alimentos e pode impedir que os animais sejam seduzidos por alimentos durante os experimentos. O cronograma de alimentação usado aqui para monitorar melhor a alimentação e o comportamento do polvo é introduzir metade do número de caranguejos à base de peso e aumentar o número de camarões para cinco da manhã. À noite, introduza a segunda metade dos caranguejos ao tanque.

6. Saneamento semanal

1. Desligue o skimmer, a bomba e as luzes da lixeira de algas antes de limpar o sistema de sump. Em seguida, desligue a válvula automática do sistema antes de remover a água. Finalmente, remova o skimmer e toda a água apenas do sistema de sump.
2. Esfregue levemente as algas para remover a maior parte da biomassa de suas paredes. Limpe o resto da área da soma com um pincel. Retire o filtro de meia, limpe com vinagre e deixe secar; gire com outro filtro de meia a cada semana substituindo por novos a cada três meses. Remova e limpe a biomassa do topo do skimmer semanalmente.
   NOTA: Evite usar o metal para limpar o plástico, pois ele criará arranhões que podem ser propensos ao crescimento microbiano.
3. Coloque o skimmer de volta no sistema e comece a encher com água salgada. Quando a área da bomba está começando a encher, todos os sistemas podem ser ligados de volta. Pare de adicionar água quando a parte superior automática da válvula flutuante estiver na posição desligada.

Figura 4: Tanque para caranguejos violinista (Minuca pugnax). O fundo do tanque é meio designado para cama seca e a outra metade para 2 cm de água salgada rasa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Tanque para camarão fantasma (Palaemonetes paludosus). As rochas no tanque de camarão fornecem lugares para o camarão se esconder e molt, bem como para o crescimento de microrganismos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Cuidado com animais doentes

1. Siga a referência ^guia66 para avaliar o bem-estar do polvo.
   NOTA: Para polvos fêmeas, o fim do ciclo de vida normalmente começa depois de colocar ovos. O animal começará a diminuir o consumo alimentar e deixará de comer completamente e ficará mais letárgico. A vida útil após o processo de fim de vida varia. Nenhuma outra ação pode ser tomada, exceto alimentação e monitoramento do animal. Os machos senescentes diminuirão o consumo alimentar e ficarão ^{letárgicos68}.

8. Anestesia de polvo

1. Realize anestesia de polvo como detalhado em Butler-Struben et ^al.69.
2. Obtenha um recipiente de 6 L com tampa com pelo menos 15 cm de altura. Coloque 4 L de água diretamente do tanque do polvo no recipiente e forneça aeração para 4 L de água salgada usando uma pequena bomba de ar com pedra de ar para disseminar oxigênio para o ambiente ^hídrico58.
3. Antes da introdução do polvo, adicione 1% de EtOH ao recipiente. Antes de manusear o polvo, regisse o número de respirações por minuto contando a expiração da água do sifão.
   NOTA: Para polvos dentro do laboratório do pesquisador, a respiração da linha de base é de 16 a 24 respirações por minuto.
4. Antes de mover o polvo, registo a pigmentação da pele do polvo e a taxa de respiração da linha de base. Remova o polvo do tanque usando um recipiente limpo de boca aberta 4 L, recolhendo-o com sua água circundante.
   NOTA: Durante a anestesia, as taxas de respiração não indicam necessariamente anestesia completa.
5. Pesar o polvo enquanto estiver no recipiente e, em seguida, movê-lo colocando as duas mãos ao redor do corpo do polvo e levantando-o. Uma segunda pessoa pode ser necessária para remover os membros aspirados das paredes do recipiente.
6. Mova rapidamente o polvo para o recipiente preparado com 1% de EtOH. Feche a tampa para evitar uma possível fuga.
7. Regissuam a respiração do polvo por minuto contando a expiração da água do sifão no final dos primeiros 5 minutos. Se a respiração permanecer acima da linha de base e o animal continuar a responder a uma pitada leve, adicione um Adicional de 0,25% de EtOH à água. A adição de etanol à água pode continuar a um máximo de 3% de EtOH.
   NOTA: Uma indicação de que o polvo está inconsciente é a perda de controle de seus cromatoforas. Neste caso, a pele parece mais pálida do que o normal. Uma outra indicação é beliscar levemente os braços e testar se há uma resposta motora. Se ainda não houver resposta neste momento, o polvo está inconsciente, e experimentos podem ser realizados.
8. Enquanto estiver sob anestesia, monitore a respiração e a cor do polvo para garantir que ele permaneça inconsciente durante a duração do procedimento. Se o polvo começar a acordar durante o procedimento, adicione um Adicional de 0,25% de EtOH.
9. Para reverter os efeitos da anestesia do etanol, transfira o polvo para um novo tanque de água oxigenada de 4 L ou maior de seu tanque permanente de retenção. Uma vez que as respirações voltam ao normal, o polvo se torna ativo, e sua pele volta aos pigmentos normais; ele pode ser movido de volta para o seu tanque.

9. Eutanásia de polvo

1. Siga os padrões internacionais para eutanásia de polvo como detalhado em Fiorito et al., Moltschaniwskyj et al., e Butler-Struben et al57,58,69.
2. Prepare um novo recipiente 6 L com 4 L de água do tanque de retenção do polvo. Misture em _MgCl2 a uma concentração de 4% com o tanque de eutanásia. Realizar passos de 8,1 a 8,9 para anestesiar o polvo.
3. Mova o polvo após o passo 8.8 para o tanque de eutanásia. Depois que a respiração parar, espere por 5 minutos e realize uma descerebração do polvo ou mantenha no tanque de eutanásia por 5 minutos adicionais.

10. Comportamento de O. bimaculoides

1. Não alimente o polvo nas manhãs, quando eles serão treinados para usar um recipiente de tampa de parafuso. Configure um dispositivo de gravação de câmera apontando para a área destinada à alimentação.
2. Obtenha um tubo de tampa de parafuso de 50 mL com furos de 1 mm de diâmetro em toda a superfície e a tampa para fluxo de água em todo o recipiente. Coloque um caranguejo de violinista dentro do recipiente. Coloque um peso dentro do recipiente ou preso ao exterior para que ele permaneça na parte inferior do tanque.
3. Coloque o recipiente na parte inferior do tanque dentro da área aberta e à vista do polvo e da câmera. Se o caranguejo não tiver sido comido depois das 4h, remova-o do tubo e retome o horário de alimentação do dia. Continue realizando este exercício diariamente.
   NOTA: Este é mostrado na Figura 6 e discutido na seção de resultados representativos.

11. Ressonância magnética do polvo

NOTA: Anteriormente, as respostas de ressonância magnética funcional evocadas na retina do polvo foram medidas em animais ^{anestesiados70}. Aqui, obtivemos uma ressonância magnética de resolução espacial ultra-alta do sistema nervoso do polvo que exigia horas de varredura. Assim, isso foi realizado em um O. bimaculoides eutanizado.

1. Obtenha imagens de ressonância magnética usando um sistema 7T. Enrole o polvo em um envoltório plástico de cloreto de polivinil de grau de cozinha para manter a hidratação do tecido. Coloque o polvo no envoltório, coloque as pontas e role para selar.
2. Use uma bobina de transmissão/recebimento de volume com um diâmetro de 4 cm para adquirir imagens do cérebro e braços múltiplos. Use sequência RARE ponderada T1 com os seguintes parâmetros: Tempo de repetição (TR) de 1500 ms, tempo de eco (TE) de 20 ms, resolução de 117 x 117 x 500 μm, 100 médias, fator RARO 8. Estes são parâmetros típicos de ressonância magnética para cérebros de roedores de imagem. O uso de um fator RARE torna a imagem mais rápida, enquanto 100 imagens são mediadas juntas para aumentar a relação ^{sinal-ruído71}.
3. Imagem o braço do polvo usando uma bobina de transmissão de volume de 86 mm e uma matriz de 4 cm e 4 canais recebem bobina. Corte um braço usando uma tesoura cirúrgica e coloque-o em um tubo cônico de 15 mL cheio de soro fisco tamponado.
   NOTA: A sequência foi uma sequência de recuperação de inversão T1_weighted (MP-RAGE) com parâmetros: TR/TE = 4000/2.17 ms, atraso de inversão 1050 ms, resolução de 100 x 100 x 500 μm, 9 médias, tempo de varredura 1,5 h (Figura 7). Uma sequência de inversão-recuperação anula o sinal da água e aumenta o contraste dentro da imagem; esta sequência foi escolhida porque permite a visualização da anatomia interna do ^braço72.

12. Tomografia crio-fluorescência (CFT)

1. Congele o polvo: trabalhe em um capô de fumaça. Cubra o fundo de um Dewar com gelo seco, e depois encha com hexanes. Abaixe lentamente o polvo para os hexanos ao longo de cerca de 10 minutos, adicionando hexanos frescos e gelo seco, conforme necessário para cobrir totalmente o polvo com hexanos frios. Mantenha o polvo congelado a -20 °C até que esteja embutido.
2. Incorporar e seção do polvo: Crie um molde retangular do tamanho apropriado para segurar o polvo usando as ferramentas fornecidas pelo fabricante CFT. Cubra a parte inferior do molde com mídia OCT (temperatura de corte ideal) (material padrão usado em laboratórios de histologia) e deixe congelar em um gel semissólido.
3. Coloque o polvo congelado na camada de gel do OCT e cubra lentamente com OCT em camadas de 2-3. Entre os passos de derramamento, congele as etapas do bloco até que o OCT esteja na fase de gel. Depois que o polvo estiver totalmente coberto, congele o bloco por pelo menos 12 h a -20 °C.
4. Coloque a amostra no sistema de tomografia crio-fluorescência73.
5. Seção e imagem de toda a O. eutanizada O. bimaculoides em resolução mesoscópica usando 3 filtros de emissão/excitação, produzindo assim vários conjuntos de dados isotrópicos 3D.
6. Quando a secção atingir o braço e o sistema digestivo, transfira as seções para os slides para mais histologia.
7. Carregue o conjunto de dados bruto no software de reconstrução do fornecedor CFT projetado especificamente para permitir o processamento rápido.
8. Reconstrua uma pilha tridimensional usando alinhamento de marcos, balanceamento de histogramas e correções de fluorescência e normalização, incluindo a remoção de efeitos de fluorescência subsuperficial para cada comprimento de onda.
9. Uma vez que a pilha 3D final é produzida pela ferramenta de reconstrução, visualize os dados com a ferramenta de software de imagem e crie fly-throughs com sobreposições de luz branca e fluorescência, juntamente com projeções de intensidade máxima 3D (3D-MIPS), por exemplo, Figura ⁸⁷³.

Resultados

Todos os animais em nossos estudos foram obtidos da natureza, e assim sua idade exata não pôde ser determinada e sua permanência no laboratório foi variável. A condição do polvo era observada diariamente. Não vimos parasitas, bactérias, danos na pele ou comportamento anormal. O peso médio dos animais foi de 170,38 +/- 77,25 g. Cada animal habitava seu próprio tanque de 40 galões. O desvio padrão médio ± para os parâmetros registrados para um tanque ao longo de uma semana foram: pH 8,4 ± 0,0, salinidade 3...

Discussão

Configuração do sistema:
O ecossistema do aquário foi desenvolvido de forma que sejam empregados métodos mecânicos e biológicos de filtragem e oxigenação da água. Os elementos filtrantes do sistema utilizam filtros de meias, skimmers de proteínas e limpeza regular para manter os níveis de nitrogênio e oxigênio. Mais importante, também contamos com microrganismos marinhos para consumir os perigosos compostos nitrogenados e outros resíduos biológicos, bem como aerar a água através de p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-3/4 in. Drill Bit	Home Depot	204074205	Glass cutting tool Part number:1
1" flow sensors	Neptune Systems	Local Dealer	Pipe with sensor to measure water flow Part number:2
1" Slip Bulkhead Strainer	Bulk Reef Supply	207113	Strainer for water leaving tank Part number:3
10 gallon tank	Pruss Pets	Local Dealer	Fiddler crab holding tank Part number:4
4 inch X 12 inch 200 Micron Nylon Monofiliment Mesh Filter Sock w/ Plastic Ring	AQUAMAXX	UJ41171	Filter for large organic matter in sump Part number:5
40 gallon aquarium	Pruss Pets	Local Dealer	4 Food aquarium tanks Part number:6
60g poly tanks - rectangle	Pruss Pets	Local Dealer	2 Water Storage (salt and freshwater) Part number:7
Active Aqua 1/10th HP Hydroponic or Aquarium Chiller 2018 Model	WayWe	719574198463	For cooling water continuously Part number:8
ALAZCO 2 Soft-Grip Handle Heavy-Duty Tile Grout Brush	ALAZCO	B06W2FT5V5	Tank Cleaning Part number:9
Ammonia Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	33D	For water testing Part number:10
Apex system WiFi	Neptune Systems	Local Dealer	System connection for off site monitoring Part number:11
API Aquarium Test Kit	Amazon	B001EUE808	For water testing Part number:12
API Copper Test Kit	Amazon	B0006JDWH8	For water testing Part number:13
Aqua Ultraviolet Classic UV 25 Watt Series Units	Aqua Ultraviolet	A00028	For removing bacteria leaving sump system Part number:14
AquaClear 50 Foam Filter Inserts, 3 pack	Aquaclear	A1394	Food Tank Carbon Filter Inserts Part number:15
Aqueon QuietFlow LED PRO Aquarium Power Filter 30	Aqueon	100106082	Food tank filtering units Part number:16
Auto Top Off Kit (ATK) (Each includes 1 FMM module, 2 optical sensors and 1 float)	Neptune Systems	Local Dealer	For freshwater tank Part number:17
Automatic top off from RODI (LLC)	Neptune Systems	Local Dealer	From water storage to octopus tanks Part number:18
Banded Trochus Snail	LiveAquaria	CN-112080	For algae bin Part number:19
Chaetomorpha Algae, Aquacultured	LiveAquaria	BVJ-76354	For algae bin Part number:20
Clams - Live, Hard Shell, Cherrystone, Wild, USA Dozen	Fulton Fish Market	N/A	Live food Part number:21
Classic Sea Salt Mix - Tropic Marin	Bulk Reef Supply	211813	Salt for tank water Part number:22
Clear Masterkleer Soft PVC Plastic Tubing, for Air and Water, 3/4" ID, 1" OD	McMaster	5233K71	Cleaning tool Part number:23
Continuum Aquablade-P Acrylic Safe Algae Scraper W/ Plastic Blade - 15 Inch	Marine Depot	4C31001	Cleaning tool Part number:24
Copper Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	65L	For water testing Part number:25
Curve Refugium CREE LED Aquarium Light	Eshopps	6500K	Algae bin light Part number:26
Eheim 1262 return pumps	EHEIM	1250219	Pump for storage tanks Part number:27
Eshopps R-100 Refugium Sump GEN 3	Eshopps	15000	Sump system Part number:28
Ethyl Alcohol, 200 Proof	Sigma-Aldrich	64-17-5	Anesthesia Part number:29
Extech DO600 ExStik II Dissolved Oxygen Meter	Extech	DO600	Oxygen measurment Part number:30
Fiddler Crabs; live; dozen	NORTHEAST BRINE SHRIMP	N/A	Live food Part number:31
Filter Cartrages	Aqueon	100106087	Food tank filters Part number:32
Florida Crushed Coral Dry Sand - CaribSea	Bulk Reef Supply	212959	Sedimate for bottom of tank Part number:33
FMM module	Neptune Systems	Local Dealer	Controller for apex system Part number:34
Fritz-Zyme TurboStart 900 - Fritz	Bulk Reef Supply	213036	Bacteria start Part number:35
Hand Operated Drum Pump, Siphon, Basic Pump with Spout, For Container Type Bucket, Pail	Granger	38Y789	Water Hand Pump Part number:36
High pH Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	27	For water testing Part number:37
Imagitarium Fine Mesh Net for Shrimp	Petco	2580993	Shrimp and fish transfer net Part number:38
Leak Detection Kit (LDK) - Includes FMM module plus 2 ALD sensors	Neptune Systems	Local Dealer	Placed on floor to detect water Part number:39
Lee`S Algae Scrubber Pad Jumbo - Glass	Marine Depot	LE12007	Cleaning tool Part number:40
Live rocks	Pruss Pets	Local Dealer	Habitat for octopus Part number:41
Long Bottle Cleaning Brush 17" Extra Long	Haomaomao	B07FS7J7PN	Tank Cleaning Part number:42
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M1028-100ML	Euthanasia Part number:43
Magnetic Probe Rack	Neptune Systems	Local Dealer	For holding apex sensor probes Part number:44
Marine Ghost Shrimp	NORTHEAST BRINE SHRIMP	N/A	Live food Part number:45
Marineland C-Series Canister Carbon Bags Filter Media, 2 count	Chewy	98331	For elevated copper levels Part number:46
Nitra-Zorb Bag	Aquarium Pharmaceuticals	AP2213	Absorbes nirtogen compounds Part number:47
Nitrate Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	LR1800	For water testing Part number:48
Nitrite Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	26	For water testing Part number:49
Pawfly 2 Inch Air Stones Cylinder 6 PCS Bubble Diffuser Airstones for Aquarium Fish Tank Pump Blue	Amazon	B076S56XWX	Aierating water Part number:50
Penn Plax Airline Tubing for Aquariums –Clear and Flexible Resists Kinking, 8 Feet Standard	Amazon	B0002563MM	Tubing for connecting air pump to air stone Part number:51
Plumbing with unions/valves plus 3/4" flex hose	Pruss Pets	Local Dealer	Water transport Part number:52
PM1 module	Neptune Systems	Local Dealer	Power control module for apex Part number:53
Protein skimmer	Reef Octopus	AC20284	Removes biowaste from system Part number:54
PVC Apex Mounting board, grommets, wire mounts	Neptune Systems	Local Dealer	Helps ensure organization for wires and tubing within system Part number:55
PVC Regular Cement and 4-Ounce NSF Purple Primer	Amazon	Oatey - 30246	For connecting PVC pipes Part number:56
RODI unit	Neptune Systems	Local Dealer	RO Water Part number:57
Salinity Probes	HANNA probes	HI98319	Measures salinity of water Part number:58
Seachem Pristine Aquarium Treatment	Sea Chem	1438	Provides bacteria that break down excess food, waste and detritus Part number:59
Seachem Stability Fish Tank Stabilizer	Sea Chem	116012607	Seachem Stability will rapidly and safely establish the aquarium biofilter in freshwater and marine systems Part number:60
Set of lexan tops	Pruss Pets	Local Dealer	Aquarium tank lids Part number:61
Set of Various extended length aquabus cables	Neptune Systems	Local Dealer	Cables for Apex system Part number:62
SLSON Aquarium Algae Scraper Double Sided Sponge Brush Cleaner Long Handle Fish Tank Scrubber for Glass Aquariums	Amazon	B07DC2TZCJ	Cleaning tool Part number:63
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 45 Degree Elbow Adapter, 3/4 Socket Female x 3/4 Socket Male	McMaster	4880K189	PVC pipe Part number:64
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 90 Degree Elbow Adapter, 1 Socket Female x 1 Socket Male	McMaster	4880K773	PVC pipe Part number:65
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Adapter, 1 Socket-Connect Female x 1 Barbed Male	McMaster	4880K415	PVC pipe Part number:66
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Straight Reducer, 2 Socket Female x 3/4 Socket Female	McMaster	4880K008	PVC pipe Part number:67
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Tee Connector, White, 1 Size Socket-Connect Female	McMaster	4880K43	PVC pipe Part number:68
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 1 Pipe Size, 10 Feet Long	McMaster	48925K13	PVC pipe Part number:69
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 3/4 Pipe Size, 5 Feet Long	McMaster	48925K92	PVC pipe Part number:70
Structural FRP Fiberglass Sheet, 48" Wide x 96" Long, 1/4" Thick	McMaster	8537K15	Table top material Part number:71
Structural FRP Fiberglass Square Tube, 10 Feet Long, 2" Wide x 2" High Outside, 1/8" Wall Thickness	McMaster	8548K33	Structural table materal Part number:72
Tank Sediment	TopDawg Pet Supply	8479001207	Sediment for bottom of fiddler crab tank Part number:73
Temperature probe	Neptune Systems	Local Dealer	Temperature probe for tanks Part number:74
Tetra TetraMarine Large Saltwater Flakes for all Marine Fish	Amazon	B00025K0US	Fish, shrimp, and crab food Part number:75
Tetra Whisper Aquarium Air Pump for 10 gallon Aquariums	Petco	2335234	Air pump for smaller tanks Part number:76
Thick-Wall Through-Wall Pipe Fitting, for Water, PVC Connector, 1 Socket-Connect Female	McMaster	36895K843	PVC pipe Part number:77
Vectra s2 pump	Bulk Reef Supply	212141	Aquarium Pump Part number:78
Water Pump	TACKLIFE	GHWP1A	Pump for cleaning tanks Part number:79
Wyze Cam v2 1080p HD Indoor WiFi Smart Home Camera with Night Vision	Amazon	B076H3SRXG	DeepLabCut Recording Part number:80