生物医学・バイオエンジニアリング研究のためのタコ生態系の確立

Tyler VanBuren; Carolina Cywiak; Petra Telgkamp; Christiane L. Mallett; Galit Pelled

doi:10.3791/62705

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この記事について

要約
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要約

タコの独特の生理学的構造と解剖学的構造を理解することは、生物医学研究に大きな影響を与える可能性があります。このガイドでは、この種に対応するための海洋環境の設定と維持方法を示し、タコの神経系の解剖学と機能を視覚化するための最先端のイメージングおよび分析アプローチが含まれています。

要約

生物医学研究の多くの発展は、異なる種の特定の機能をサポートする解剖学的および細胞的メカニズムを発見することによって刺激されています。タコは、科学者に神経科学、ロボット工学、再生医療、補生の分野に新しい洞察を与えたこれらの例外的な動物の一つです。この種の頭足類を用いた研究では、プロジェクトの成功に不可欠なタコとその生態系の両方に対する複雑な施設の設置と集中治療が必要です。このシステムは動物に安全できれいな環境を提供するために複数の機械および生物のフィルタリングシステムを必要とする。制御システムに加えて、施設を長期に保つためには、特別な定期メンテナンスと清掃が必要です。タンクの風景を変え、様々な獲物を取り入れ、彼らが働くために挑戦的なタスクを導入することによって、これらの知的動物に豊かな環境を提供することをお勧めします。我々の結果は、MRIと全身自己蛍光イメージングだけでなく、彼らの神経系をよりよく理解するための行動研究を含む。タコは、生物医学研究の多くの分野に影響を与えることができるユニークな生理学を持っています。持続可能なエコシステムを提供することは、その明確な能力を明らかにする上で最初に重要なステップです。

概要

生物医学研究と生物医学工学の新しい概念は、多くの場合、生物種が環境や生理学的条件や課題に対処するために持っている特定の戦略を特定することによって触発されます。例えば、ホタルの蛍光特性を理解することは、他のモデル生物¹の細胞活動を報告できる新しい蛍光センサーの開発につながっています。藻類の光によって活性化されたイオンチャネルを同定することは、細胞および時間的な特定光ベースの神経変調²^、³^、⁴^、⁵の開発につながっている。地球の磁場に従って移動するガラスナマズのタンパク質を発見することは、磁気ベースの神経変調⁶^、7,8,9,10,11の開発につながっています。Aplysiaのサイフォン反射を理解することは、行動の細胞基盤を理解するのに役立っています 12,13,14^.

研究者は、非従来のラボ種が保持する生理機能に関するユニークな強みと新しい視点を利用して、現在のバイオエンジニアリングと系統ツールボックスを拡大し続けています。連邦政府機関は、多様な種に対して行われた新しい研究に資金を提供することで、これらの研究ラインを支援し始めています。

ユニークな解剖学と再生能力を持つ動物の1つの属だけでなく、その腕、魅力的な生物学者やエンジニアの適応制御、そして社会のあらゆる部分からの観客を魅了するOctopus17です。実際、タコの生理学と行動の多くの側面は、過去数十年にわたって研究されてきました15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 .しかし、近年の分子・進化生物学、ロボット工学、運動記録、画像、機械学習、電気生理学の発展により、タコの生理学や行動に関連する発見が加速し、革新的なバイオエンジニアリング戦略に変換される27,28,29,30,31,32,33,34,35^,36,37,38,39^.

ここでは、さまざまな背景、科学的関心、目標を持つ科学者やエンジニアに関心と関連性があるタコの夫を設定し、維持する方法を説明します。しかし、我々の結果は、神経科学および神経工学研究におけるタコの応用に焦点を当てています。タコは、中枢脳に4,500万個のニューロン、視神経ローブに1億8,000万個のニューロン、および8つの軸索と末梢神経節に3億5,000万個のニューロンを持つ高度に発達した神経系を有する。それに比べて、犬は同じような数のニューロンを持ち、猫はそのうちの半分しか^40です。脊椎動物の神経系とは異なり、タコの脳内の何百万ものニューロンを各腕の軸索^40,41,42のニューロンに接続する^32K efferentと^140Kの摂便繊維しかありません。これらの比較的少数の相互接続繊維は、モータプログラムの実行に関する詳細のほとんどが軸索自体で行われることを示唆しており、タコが持つ独特の分布した神経制御を強調している。タコの腕は、容器の中に入っていても、瓶の蓋を開けるなどの操作スキルを可能にする並外れた細かいモーターコントロールを備えています。この高度に発達した先天性運動能力は、頭足類(タコ、イカ、イカ)⁴³のクラスに固有です。

確かに、何億年もの進化を通じて、タコは科学的および工学的分野にわたる新しい開発と進歩に影響を与えた驚くべき洗練されたゲノムと生理学的システム^43,44を開発しました。例えば、タコの吸盤の解剖学的構造に基づく耐水性の粘着性パッチは、湿潤および乾燥した表面に固執することができます⁴⁵;タコの迷彩肌に触発された合成カモフラージュ材料は、凹凸とピット⁴⁶を備えた平面の2D表面を立体的な表面に変換することができます。将来的には^body47内の外科用ツールとして機能する小型ソフトおよび自律ロボット(オクトボット)。また、戦車状ロボット⁴⁸に取り付けられたアーム(すなわちOctoArm)も開発されています。タコの多くの種は、例えば、生物医学の研究で使用されている, タコの下流, タコの副鼻腔炎, タコのババアビリス, およびオクトパスビマキュロイド (O. ビマキュロイド);O.下品とO.ビマキュロイドは最も一般的です^34,49,50。最近の異なるタコゲノムのシーケンシングは、この特に関心のある属を作り、タコ研究で新しいフロンティアを開きます34,43,51,52。

私たちのセットアップで使用されるBimaculoidesは、1949年に最初に発見された中型のタコ種で、カリフォルニア州中部からバハカリフォルニア半島の南まで北東太平洋沖の浅瀬で見つけることができます¹⁷。それは、その目の下のマントルの偽のアイスポットによって認識することができます。ジャイアントパシフィックタコ(腸頭突起小体)やコモンタコ(O.vulgaris)と比較すると、カリフォルニア2スポットタコ(O.ビマキュロイド)は比較的小さく、数センチメートル未満から始まり、少年のように急速に成長しています。実験室内で飼育すると、成人マントルサイズは平均100cmに成長し、最大800g53,54の重量を量ることができます。タコは最初の200日以内に急速な成長期間を持っています。それまでに、彼らは大人とみなされ、彼らの人生の残りの部分を通して成長し続けます55,56,57。タコは、特に両方の男女がタンク内に一緒に収容されている場合、共食いすることができます。したがって、それらは別々のタンク⁵⁸に個別に収容される必要があります。

プロトコル

すべての動物研究は、ミシガン州立大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. タコタンク装置のセットアップ

まず、材料表に示すように、海洋環境システムに組み込まれる水槽のすべての非生物学的材料を取得 します。サイズはインチで提供されます。
すべてのチューブ、配管、フィルターシステム部品を70%エタノールで洗浄し、取り付け前に脱イオン(DI)水を使用してください。清掃時には石鹸などの薬品を使用しないでください。
グラスファイバーテーブル13インチ×49インチ×1/2インチ(パート#71)を、炭素繊維で作られた4つのテーブルレッグと、2インチx 2インチx 23インチ(パート#72)の寸法で配置します。脚を卓上の角の真下に取り付けます。
上面の下、各テーブル脚の間に、2インチ x 2 インチの長さ (パート #72) カーボンファイバー安定化ブレースをテーブルの下側に取り付け、上の棚の端に直接置きます。テーブルの下の地面に同じ寸法の別の棚をねじで取り付けます。タンクが上面に座っている間、ポンプ( 材料表を参照)を底面の表面に直接置きます。このシステムは図 1 に示されています。
注:タンクからの水出力は重力供給され、タンクに出入りするものを除くすべてのチューブは、最大排水ヘッド圧力を確保するためにタンクの底部よりも低くする必要があります。

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図1:タコタンクのセットアップ。水の入口および出口(a)。3つのタコタンクは、それぞれ1.22 m x 0.3 m(b)の面積を有する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ガラス切断ドリルビットを使用して、タンクの側面の1つから2インチの単一の13/4インチの穴を掘削します。図 2aの右側に示すように、水出力吸引画面の底部が出力穴の標高を決定します。水位は吸引スクリーンによって決定され、水のスプラッシュゾーンを可能にするタンクの上部から少なくとも6インチである必要があります。
PVCプライマーとセメントを使用してセクションを永久に接続します。これを行うには、まず、目的の男性のPVCパイプの端をメスパイプの端にスライドさせます。プライマーとセメントがパイプの外側に表示されるのを防ぐために、まだ見える男性の部分の外側に画家のテープを置きます。テーピング後に部品を分離し、同じ領域にセメントの適用に続いて、オスのパイプの外側にプライマーの軽いコートを置きます。
セメントの適用後、できるだけ早く、メスのパイプにオスのパイプを再フィットし、テープを取り外します。プライマーとセメントの塗布後24時間、新たに接続された部分をDI水で洗い流す。硬化時間については、セメント製品をさらに方向に向けて見てください。
注:PVCプライマーとセメントを使用する前に、すべてのチューブと機器のセットアップが適切に配置されていることを確認してください。パイプの長さの要件は異なる場合があります。
次に、吸引スクリーンの1インチ外径(OD)端部を肘関節の1インチ内径(ID)端部に永久に接続します。肘ジョイントの端部をストレート PVC チューブ(1 インチ OD)に接続します。ストレートチューブの反対側を、通壁ストレートアダプタメスソケットの1インチIDに接続します。
注: ID は、パイプの内側の壁間の最も広い距離を指します。ODは、チューブ幅の外側を指します。
スルーウォールストレートアダプタを、1インチOD(ステップ1.8から)を備えたストレート4インチの長いPVCパイプに永久に接続します。このパイプはタンクの外に向かうでしょう。
ストレートパイプをPVCコネクタの中心に永続的に接続します(1インチID Tee型、ステップ1.9から)。次に、2 つの 6 インチ長さ (パート #69) パイプ (1 インチ OD) を、エアリリース用に直接上に向いているティーコネクタの反対側の端と、水の流れのためにもう一方を直接下に向けて、2 本の長さ (パート #69) パイプを永続的に接続します。
下向きの拡張ストレートパイプ(ステップ1.10から)を女性ソケット有刺鉄線パイプ(1インチID)ストレートアダプタに永久に接続します。長さ36インチのゴムチューブ(3/4インチID)を有刺鉄線管アダプターに取り付けます。
冷却システムを水出力チューブとサンプシステムの間に配置します。
システムに付属の3/4インチバーブフィッティングをチラーユニットの入力ポートと出力ポートに取り付けます。チラーの入口継ぎ手にゴムチューブ(ステップ1.11から)を置きます。
図 2b に示すように、3/4 インチ ID チューブの新しい部分(ステップ 1.13 から)を、冷却装置出力(ステップ 1.12 から)から、sump システムの入口に接続します。
次に、4インチ x 12 インチのソックスフィルタ(200 μm の細孔サイズ)を、 図 2 に示すように指定された領域に配置します。また、図2に示すように、タンパク質スキマーとリターンポンプを適切な領域に配置します。リターンポンプと一緒に、ポンプの水入口の上部の上に2インチ、ポンプ領域の内側の壁に自動トップオフフロートバルブを取り付けます。必要に応じて、ポンプがタンクから取り外されるのを妨げないでください。
まっすぐな12インチの長いチューブ(3/4インチOD)をポンプの出口に永久に接続します(ステップ1.15から)。3/4インチODストレートチューブのもう一方の端で、チューブのODを3/4インチID 45°エルボージョイントに永久に接続します。ジョイントのもう一方の端まで、3/4 インチの OD チューブを永続的に接続します。
ストレートチューブのもう一方の端(ステップ1.16から)を、ストレートレダクタの3/4インチIDに取り付けます。大きいアダプターの端部(2インチ OD)を UV ライトの入力に永続的に接続します。
注: ストレートチューブの長さは異なる場合があります。
次に、UV ライトインレットの配置をポンプの出力パイプ(ステップ 1.17 から)と一致させて、パイプがライトとポンプの間で曲がっていないようにします(ステップ 1.15 から)。UV ライトアタッチメント穴に合わせて、安定化ブレースに穴を開けます。ドリルビットとネジのサイズを一致させ、与えられたネジを使用してテーブルにUVライトを取り付けます。
別の低減アダプターの 2 インチ側を UV ライトの出力に永続的に接続します(ステップ 1.18 から)。5インチの長いストレートチューブの1インチODをアダプタの1インチIDに取り付けます。次に、1インチのIDを持つ90°コーナーピースを1インチのODチューブに接続します。コーナーピースの未接続の端部は、水の入力が行くタンクの側面に向かって(ステップ1.5と同じ側)を持っています。
コーナーのもう一方の端(ステップ 1.19 から)を、フロー制御ユニットの入力(パート#2)で1インチのODを持つ6インチの長いチューブ(パート#69)に永久に接続します。別の1インチODチューブ(パート#69)を流量監視ユニットの出力に永久に接続します。長さはタンクの側面を越えて少なくとも3インチを伸ばす必要があります。
13/4インチのガラス切断ドリルビット(パート#1)を使用して、目的のウォーターラインの上に3インチ、水出力穴がある側の反対側のタンク(図1a)から2インチ離れた新しい穴を切ります。タンクの外に向かって1インチのスリップ(パート#77)で別のスルーウォールバルクヘッドフィッティングを取り付けます。
バルクヘッドスリップに1インチのODと4インチの長さ(パート#69)とストレートチューブを永久に接続します。ステップ 1.21 の最後の部分からチューブを切り取り、このチューブがタンクから伸びる距離に合わせて切り取ります。90°チューブ(パート#65)を開いたパイプのそれぞれに永久に接続し、両方のコーナーピースを永久に接続する最後の1インチODストレートチューブ(パート#69)を切断します。
注: 図 3 は、水槽システムの簡単な表現を示しています。
制御システムの残りの部分(パート#34)を設定し、まず、パワーストリップ(パート#53)をテーブル自体または近くの壁に取り付けます。その隣に流体監視モジュールを取り付けます(パート#2)。
フローセンサー、パワーストリップ、およびリーク検出センサーをモジュールに接続します。藻類ビンに取り付けられている成長灯(パート#26)を設定します(図2)。
フローセンサー、UV光、成長灯、ポンプ、およびタンパク質スキマーをエネルギーバーに差し込みます。メーカーのマニュアルに従って、水制御システムのプログラミングを設定します。
1ガロンの逆浸透(RO)または脱イオン化(DI)水と市販の塩ミックスの半分のカップを混合して塩水を調製します。1つのタンクとサンプシステムを完全に満たすために45ガロンを作ります。
サンプシステムフローコントローラ内でポンプをオンにし、自動トップオフバルブがオフの位置になるまで塩水を追加し続けるので、追加の淡水は必要ありません。
水が満杯になったら、充填を停止し、水冷ユニットをオンにして、温度を18°C~22°Cの間に設定^します。プロテインスキマーをオンにします。
水槽の底に砕いたサンゴの30キロだけでなく、藻類のビンの底に砕いたサンゴの層を追加します。タコの環境に複数のライブ岩やその他の追加で追加します。タンクの開口部を覆う上を置きます。
注:生きた岩石は、細菌や藻類などの巨視的な海洋生物が生息する死んだサンゴです。
包装に指示されるように、塩水の水槽で使用される硝化細菌を追加します。これを指示どおりに追加し、水テストキット、pHセンサー、温度センサーで、温度、水分量、pH、アンモニア、亜硝酸塩、硝酸塩を毎日チェックしてください。アンモニア、亜硝酸塩、硝酸塩の安全な値は、それぞれ0.5 ppm、0.25 ppm、および10 ppm^{以下です58}。
硝化細菌が加えられる日にUV光が消灯し、塩水微生物が増殖できるようにします。パラメータが安全範囲内に収まる場合、UV ライトを再アクティブ化できます。
システムが確立された後、pHと酸素化がそれぞれ8.0-8.4および ⁵⁹であることを確認してください。水族館に動物を追加する前に、銅水試験キットを使用して、システム内の銅と酸素レベルの存在を確認してください。
注:銅は無脊椎動物に損傷を与え、魚のエラ^60,61の浸透制御を妨げます。
水の中に銅が見つかった場合は、DI/RO水源をテストします。水源に銅が含まれていないと判断した後、30%の水質変化を行い、活性炭ブロック(パート#46)を水の中に入れます。問題が解決しない場合は、水の交換を完全に行い、すべての部品を清掃してください。
すべての水のパラメータが安全なレベル内であると判断された後、タコを追加する少なくとも1週間前にシステムに10のゴーストエビを追加します。これは、細菌のバイオマスを導入し、全体的な水質を示すのに役立ちます。
藻類のビンに追加の水族館の生態系の住民を追加します。これには 、チェエトモルファ spp.(スパゲッティ藻類)、 トロガスSpが含まれます。 (縞状のトロカスカタツムリ)、メル セナリアメルセナリア (チェリーストーンアサリ)。

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図2:サンプシステムサンプシステムの側面図(a)。サンプシステムのトップビュー (b)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:タンクと環境制御ユニットの下にサンプフィルタリングシステムを備えた水族館。緑色の矢印は、システムを通る水の流れの方向を示します。冷却のためにセクション1から2に流れる水と、重い生物学的物質を軽い物質から分離するために3つに流れる水。重い廃棄物は、より小さな生物学的物質がセクション4内の靴下フィルターに流れ込む間、セクション5に底と外に浮かびます。水は、水の中に残りの廃棄物を除去するために、6でタンパク質スキマーに入るセクション5の下の4つ下から流れます。藻類ビンには、廃棄物、アンモニア、硝酸塩を分解する微生物が含まれ、水を酸素化します。システムの最後の部分では、タンクに戻ってポンプで送られる前に蒸発を考慮して、より多くの水が追加されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. 貯蔵タンク

背の高い60ガロンの貯水タンクを2つ設置し、1つは海水用、もう1つはRO水用です。淡水タンクの最大充填ラインがテーブルよりも高いことを確認します。1/4インチチューブをサンプシステムのフロートバルブの自動上部に取り付け、チューブのもう一方の端を淡水タンクの底に取り付けます。
注: 水が蒸発した場合に補充します。塩は水の中にとどまるでしょう。
塩水タンクに水を入れ、塩の比例量をタンクに加えます。塩水貯蔵タンクを連続的に空入し、混合し、適切な酸素化を行います。塩の完全な混合を確実にするために使用する前に1時間待ちます。
注:海水タンクは、洗浄後にタンクを補充するのに便利です。

3. フードタンクのセットアップ

エビを1週間以上生き続けるには、30 ppt以下の表れと25°C近くの温度でタコとは別のタンクに保管してください。
そのためには、タコのタンクが成熟した1週間後に、8ガロンの成熟した海水をエビタンクに移します。タンクの底に砕いたサンゴの15キロを追加します。タンクに生きた岩をいくつか加え、脱皮用スポットを隠します(図4)。
注:成熟した海水とは、ステップ1.30に示すように、海水中で海洋細菌が成長することを可能にするプロセスを指します。
タンクの端にカニスターフィルターを取り付けます。製造元の指示に従って、カニスターフィルタを設定します。タンクにエアストーンを取り付けたチューブに接続されたタンクの隣にエアポンプを追加します。
フィルタをクリーニングし、毎週フィルタパッドを変更します。また、水の25%を同時に交換する必要があります。ステップ 1.30 で説明したように、水テストキットを使用して、食品タンク内の窒素、pH、温度パラメータを毎日チェックします。水窒素パラメータが高いままの場合は、追加の水の変更を実行し、水に窒素吸収袋を追加します。または問題が1ヶ月以上続く場合は、エビはより大きなタンクに移動する必要があります。
砕いたサンゴの堆積物が消散するとすぐにエビを加えます。エビを最初に加えるには、到着時に、小さな海水タンクに水を送らずにエビを5分間動かしてバイオ廃棄物を除去します。その後、エビをタンクに直接加えることができます。到着時に、蚊の魚は、エビタンクに直接追加することができます。
注:エビとモスキートの魚は、材料シートまたは他の食品サプライヤーに記載されている生きた動物の商業サプライヤーから購入することができます。また、タコの解凍されたエビを提供することも可能です。
食物の指示に従って、エビと魚に魚のフレーク、死んだ植生、または藻類⁶²を与えます。
カニタンクの場合は、1ガロンの塩水と10kgの小石を加えます。片側に小石を積み、片側に乾燥した土地を残し、もう一方の側に2cmの海水を積みます(図4に記載されています)。これらの無脊椎動物のための最適な環境水の変数は、それぞれ、30-35 pptと22-25 °Cの間、^11,63の、分量と温度を^表す必要があります。
フィドラーカニをタンクに直接追加します(図4)。カニは人生のほとんどを陸上で過ごしますが、一度に数日間水中にいることができ、水中のタンクは長期的な生存のために部分的に重要になります。
水槽の乾燥した部分の皿に魚のフレークを加えることによって、1日1回フィドラーカニを養います。カニを取り除き、塩水の100%を変更することによって、毎週きれいにします。小石をきれいにします。
タコが自分自身を開き、別の水フィルタリングメカニズムを提供するために、海水タンク内に海洋二枚貝軟骨(アサリとムール貝)を保管してください⁶⁴。
タコタンクのフィルタリングシステムに不必要な廃棄物の負荷を置かないように、最初の週のために別の空きタンクの中にムール貝を置きます。
注:ムール貝はタコの食べ物ですが、到着後すぐに死ぬ可能性が高く、大量に存在する場合はタンク内の生物学的廃棄物を大幅に増加させます。

4. タンクへのタコの導入

アンモニア、亜硝酸塩、硝酸塩の各レベルがそれぞれ0.5ppm、0.25 ppm、および10 ppm未満であることを確認してください。タンクからタコのインクを取り除くために利用可能な水ハンドポンプを持っています。この手順では 2 人のユーザーを使用することもお勧めします。
到着時に、スケールにバッグを置き、タコが取り除かれた後、バッグの重量を差し引きます。動物をタンクに移しながら水の酸素を増やすために袋にエアストーンを加えます。出荷水の温度と分量を測定します。出荷後の長期にわたる病気の症例を記録する。
1. 袋からタンクに水を移さずに、タンクの角に輸送バッグを掛け、袋をタンク水に部分的に水没させたまま、輸送バッグの温度を変え始める。袋から水の10%を取り出し、シンクを捨てる。タンクから同量の水を袋に加えます。袋の水温がタンク内の水温と1°以上の差になるまで10分ごとに繰り返します。
2. 袋とタンクの温度差が1°以内になったら、個々のタンクにタコを移動するために手袋を着用することを確認してください。移動するには、タコの下に両手を置き、転送中にサポートを提供します。二人目は、吸引した腕をバッグの側面からそっと引っ張る必要があります。
3. タコが袋から出たら、できるだけ少ない水を出荷袋から移す新しい生息地の水に素早く移動します。ハンドポンプを使用して、タンク内でタコが放出するインクを取り除きます。今、動物のおおよその重量を得るために水で袋の重量を量る。
到着後の最初の2週間は、体重^58,65,66の約4%から8%のタコの毎日の消費量を監視^します。タコは1日4回チェックする必要があります。これは、2週間後に1日2回に減少させることができます。必要に応じて彼らの食品消費量を調整するために2週間ごとに重量を量る。
注:タコのいくつかの種は、そのタンクから脱出することが知られているので、そのタンクの蓋に2.5キロの重量を配置することをお勧めします。

5. 毎日のケア

市販の塩水試験キットをpH、アンモニア、亜硝酸塩、硝酸塩用に使用し、キットに付属の4つの試験管にキット指示量のタンク水を加えます。テストキットで指定されているように、対応するチューブに、着色反応物の量を追加します。
アンモニア、亜硝酸塩、硝酸塩のレベルがそれぞれ0.5ppm、0.25 ppm、および10ppmを超える場合は、バイオマスを靴下フィルターから洗い流すか、新しい靴下フィルターに変更します。さらに、スキマーの上からバイオマスをブラシできれいにし、タンクに脱窒細菌を追加します。問題が解決しない場合は、淡水の25%を交換してください。
注: 上記の手順では、生態系内の窒素化合物を削減します。
ハンドポンプを使用して、タンクからすべての死んだカニとエビの死体だけでなく、任意のタコの便を除去します。残りのすべての生きたカニをタンクから取り出し、貯蔵タンクに戻します。次に、タンク内の大きなオブジェクトを再配置します。
タコが毎日食べるカニの半分の数を1.25 +- 0.25gのタンクに導入します。解凍したエビや小さなオスのフィドラーカニを若いタコに食べさせます。実験に応じて、カニやエビはタンク内のどこにでも、またはタコに直接導入することができます。
注:タコの毎日の食品消費量は、その重量の4%-8%^です67。冷凍エビはタコの体重に基づく食料源としても提供できます。
毎日5つの幽霊エビを提供しています。平均して、この実験では3人が消費された。タコに様々な食べ物を提供するには、週に1回生きたアサリやムール貝を1匹与え、常にタンク内に3匹の蚊の魚を維持します。
注意:動物に様々な食べ物を与えることは必須ではなく、実験中に動物が食べ物に魅了されるのを防ぐことができます。ここでタコの餌と行動を最もよく監視するために使用される給餌スケジュールは、体重に基づいてカニの半分の数を導入し、朝にエビの数を5に増やすことでした。夕方には、カニの後半をタンクに導入します。

6. 毎週の衛生

サンプシステムをクリーニングする前に、スキマー、ポンプ、藻類ビンライトをシャットダウンします。次に、水を取り除く前に、システムの自動バルブをオフにします。最後に、スキマーとすべての水をサンプシステムから取り除きます。
藻類のビンを軽くスクラブして、バイオマスの大部分を壁から取り除きます。残りの部分のサムプ部分をブラシで清掃します。靴下フィルターを取り出し、酢できれいにし、乾燥させます。毎週別の靴下フィルターで回転し、3ヶ月ごとに新しいものに置き換えます。毎週スキマーの上からバイオマスを取り除き、きれいにします。
注:金属を使用してプラスチックをきれいにすることは避けてください。
スキマーをシステムに戻し、塩水で補充を開始します。ポンプ領域が満杯になり始めると、すべてのシステムを再度オンにすることができます。フロートバルブの自動上部がオフの位置にある場合は、水を追加します。

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図4:フィドラーカニ用タンク(ミヌカプニャックス)。タンクの底部は、乾燥したベッドの半分と浅い海水の2cmの残りの半分を指定します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:幽霊エビ用タンク(パレミテス・パルドサス)。エビタンクの岩石は、エビが隠れて脱皮するだけでなく、微生物の成長のための場所を提供します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

7. 体調の不整動動物のケア

タコのウェルネスを評価するには、ガイドリファレンス⁶⁶ に従ってください。
注:メスのタコの場合、ライフサイクルの終わりは通常、卵を産んだ後に始まります。動物は食物消費量を減らすことを開始し、完全に食べるのをやめ、より無気力になります。終末期プロセス後の寿命はさまざまです。動物に餌を与え、監視する以外に、それ以上の行動は取ることができない。老化男性は食物消費を減らして無気力⁶⁸になる。

8. タコ麻酔

バトラー・ストルーベンら⁶⁹で詳述されているようにタコ麻酔を行う。
高さ15cm以上の蓋付き6L容器を手に入れます。タコのタンクから直接4Lの水を容器に入れ、空気石を入れた小さな空気ポンプを使用して4Lの海水に通気を与え、水環境⁵⁸に酸素を広めます。
タコの導入に先立ち、1%のEtOHを容器に加えます。タコを扱う前に、サイフォンからの水の呼出を数えることによって、毎分呼吸数を記録する。
注:研究者の研究室内のタコの場合、ベースライン呼吸は毎分16〜24呼吸です。
タコを動かす前に、タコの皮膚色素沈着とベースライン呼吸数を記録します。きれいな4 L開いた口の容器を使って、周囲の水でくすい上げて、タンクからタコを取り出します。
注:麻酔中、呼吸数は必ずしも完全な麻酔を示すものではありません。
容器の中でタコの重量を量り、タコの体の周りに両手を置き、それを持ち上げることによってそれを移動します。第二の人は、容器の壁から吸引された手足を取り除くために必要とされるかもしれない。
1%のEtOHで準備された容器にタコを素早く移します。蓋を閉じて、エスケープを防ぎます。
最初の5分の終わりにサイフォンからの水の呼気を数えることによって、毎分タコの呼吸を記録します。呼吸がベースラインを上回り、動物が軽いピンチに反応し続ける場合は、さらに0.25%のEtOHを水に加えます。水へのエタノールの添加は、最大3%のEtOHまで継続することができます。
注:タコが無意識であることを示す1つの徴候は、そのクロマトフォアの制御の喪失です。この場合、皮膚は通常よりも青白く見えます。さらに、軽く腕をつまみ、モーター応答があるかどうかをテストする方法もあります。この時点でまだ応答がない場合は、タコは無意識であり、実験を行うことができます。
麻酔下でタコの呼吸と色を監視し、処置の間、意識不明のままであることを確認します。タコが手順中に目覚め始めた場合は、さらに0.25%のEtOHを追加します。
エタノール麻酔の効果を逆転させるために、タコを永久保持タンクから新しい4 L以上の酸素化水タンクに移します。呼吸が正常に戻ると、タコは活発になり、皮膚は正常な色素に戻ります。それはタンクに戻すことができる。

9. タコ安楽死

フィオリトら、モルチャニフスキーら、バトラー・ストルーベンら57,58,69で詳述されているように、タコ安楽死の国際基準に従^{ってください}。
タコの保持タンクから4 Lの水を入れた新しい6 L容器を準備します。_MgCl2 を安楽死槽に4%の濃度に混合します。8.1から8.9までの手順を実行してタコを麻酔します。
ステップ8.8の後にタコを安楽死タンクに移動します。呼吸が止まった後、5分間待ち、タコの減少を行うか、さらに5分間安楽死タンクに入れておきます。

10. O. ビマキュロイドの挙動

彼らはスクリューキャップコンテナを使用するように訓練される朝にタコを供給しないでください。給餌対象の領域を指すカメラ記録装置を設定します。
表面全体に直径1mmの穴をあける50 mLのスクリューキャップチューブと、容器全体の水流用キャップを入手します。容器の中にフィドラーカニを入れます。容器の中に重みを入れるか、外側に取り付けてタンクの底に残ります。
コンテナをタンクの底部に置き、タコとカメラを見ます。カニが4時間後に食べられていない場合は、チューブから取り出し、その日の給餌スケジュールを再開します。この練習を毎日行い続けてください。
注: これは 図 6 に示され、代表的な結果セクションで説明されています。

11. タコMRI

注:以前、タコのレチナにおける機能的MRI応答を麻酔動物⁷⁰で測定した。ここでは、何時間もスキャンを要するタコの神経系の超高空間分解能MRIを得た。したがって、これは安楽死性 のO.ビマキュロイドで行われた。

7Tシステムを使用してMRIイメージを取得します。ティッシュの水和を維持するために台所等級のポリ塩化ビニルのラップでタコを包みます。ラップの上にタコを置き、端にタックし、シールするために転がします。
脳と複数の腕の画像を取得するために、直径4cmのボリューム送受信コイルを使用してください。T1重み付け RARE シーケンスを次のパラメータで使用します: 1500 ms の繰り返し時間 (TR) 、20 ms のエコー時間 (TE) 、117 x 117 x 500 μm 解像度、100 平均、RARE ファクター 8。これらは、げっ歯類の脳をイメージングするための典型的なMRIパラメータです。RARE ファクターを使用すると、画像の撮影速度が速くなり、100 個の画像を一緒に平均化して、信号対雑音比⁷¹ を増加させます。
86 mmのボリューム伝送コイルと4 x 4 cmの4チャンネルアレイ受信コイルを使用してタコアームをイメージします。手術用ハサミを使って腕を切り落とし、リン酸緩衝生理食塩液で満たされた15 mL円錐形チューブに入れます。
注:シーケンスは、パラメータを持つT1_weighted反転回復シーケンス(MP-RAGE)でした: TR / TE = 4000 / 2.17 ms、反転遅延1050ミリ秒、100 x 100 x 500 μm解像度、9平均、スキャン時間1.5時間(図7)。反転回復シーケンスは、水からの信号をヌルにし、画像内のコントラストを増加させます。このシーケンスは、^arm72の内部解剖学の可視化を可能にするため選択された。

12. クライオ蛍光断層撮影(CFT)イメージング

タコをフラッシュフリーズ:ヒュームフードで作業します。デュワーの底をドライアイスで覆い、ヘキサネで満たします。約10分にわたってタコをヘキサンにゆっくりと下げ、必要に応じて新鮮なヘキサンとドライアイスを加え、タコを冷たいヘキサネで完全に覆います。タコが埋め込まれるまで-20°Cで冷凍してください。
タコを埋め込み、切り離す: CFT メーカーが提供するツールを使用して、タコを保持する適切なサイズの長方形の金型を作成します。OCT(最適な切削温度)メディア(組織学の実験室で使用される標準材料)で金型の底部を覆い、半固体ゲルに凍結させます。
凍結したタコをOCTのゲル層に入れ、OCTでゆっくりと2~3層に覆います。ステップを注ぐ間に、OCTがゲル段階になるまでブロックステップを凍結します。タコを完全に覆った後、-20°Cで少なくとも12時間ブロックを凍結します。
このサンプルをクライオ蛍光断層撮影システム⁷³にロードします。
3つの放出/励起フィルタを使用して、メゾスコピック解像度で安楽死したO.ビマキュロイド全体を切り離して画像化し、いくつかの3D等方性データセットを生成する。
切断が腕と消化器系に達したら、セクションをスライドに移してさらなる占いします。
高速処理を可能にするために特別に設計された CFT ベンダーの再構築ソフトウェアに生のデータセットを読み込みます。
ランドマークアライメント、ヒストグラムバランシング、蛍光補正、正規化を用いて、各波長の表面下蛍光効果の除去を含む3次元スタックを再構築します。
再構築ツールによって最終的な 3D スタックが作成されたら、イメージングソフトウェアツールでデータを視覚化し、3D 最大強度投影 (3D-MIPS) と共に白色光と蛍光のオーバーレイを使用してフライスルーを作成します(図 ⁸⁷³)。

結果

私たちの研究のすべての動物は野生から得られたので、彼らの正確な年齢を決定することはできなかったし、研究室での彼らの滞在は可変でした。タコの状態は毎日観察された。寄生虫、細菌、皮膚損傷、異常な行動は見ませんでした。動物の平均重量は170.38 +/- 77.25 gであった。各動物は、独自の40ガロンタンクに住んでいました。1週間にわたって記録されたタンクの平均±標準偏差は、pH 8....

ディスカッション

システムセットアップ:
水槽の生態系は、水のフィルタリングと酸素化の機械的および生物学的方法の両方が採用されている方法で開発されました。システムのフィルター要素は、窒素と酸素のレベルを維持するために、靴下フィルター、タンパク質スキマー、および定期的な洗浄を利用します。さらに重要なことは、海洋微生物に頼って危険な窒素化合物やその他の生物学的...

開示事項

すべての著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この作品は、NIH UF1NS115817(G.P.)によってサポートされました。G.P.は、NIH助成金R01NS072171およびR01NS098231によって部分的にサポートされています。Xerraイメージングプラットフォーム上のデータ収集と視覚化に関する支援とサポートを行ってくれたことを、Emit Imagingのパトリック・ザクゼウキとモハメド・ファルフードに感謝します。MSUはブルカー・バイオスピンと研究契約を結んでいます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-3/4 in. Drill Bit	Home Depot	204074205	Glass cutting tool Part number:1
1" flow sensors	Neptune Systems	Local Dealer	Pipe with sensor to measure water flow Part number:2
1" Slip Bulkhead Strainer	Bulk Reef Supply	207113	Strainer for water leaving tank Part number:3
10 gallon tank	Preuss Pets	Local Dealer	Fiddler crab holding tank Part number:4
4 inch X 12 inch 200 Micron Nylon Monofiliment Mesh Filter Sock w/ Plastic Ring	AQUAMAXX	UJ41171	Filter for large organic matter in sump Part number:5
40 gallon aquarium	Preuss Pets	Local Dealer	4 Food aquarium tanks Part number:6
60g poly tanks - rectangle	Preuss Pets	Local Dealer	2 Water Storage (salt and freshwater) Part number:7
Active Aqua 1/10th HP Hydroponic or Aquarium Chiller 2018 Model	WayWe	719574198463	For cooling water continuously Part number:8
ALAZCO 2 Soft-Grip Handle Heavy-Duty Tile Grout Brush	ALAZCO	B06W2FT5V5	Tank Cleaning Part number:9
Ammonia Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	33D	For water testing Part number:10
Apex system WiFi	Neptune Systems	Local Dealer	System connection for off site monitoring Part number:11
API Aquarium Test Kit	Amazon	B001EUE808	For water testing Part number:12
API Copper Test Kit	Amazon	B0006JDWH8	For water testing Part number:13
Aqua Ultraviolet Classic UV 25 Watt Series Units	Aqua Ultraviolet	A00028	For removing bacteria leaving sump system Part number:14
AquaClear 50 Foam Filter Inserts, 3 pack	Aquaclear	A1394	Food Tank Carbon Filter Inserts Part number:15
Aqueon QuietFlow LED PRO Aquarium Power Filter 30	Aqueon	100106082	Food tank filtering units Part number:16
Auto Top Off Kit (ATK) (Each includes 1 FMM module, 2 optical sensors and 1 float)	Neptune Systems	Local Dealer	For freshwater tank Part number:17
Automatic top off from RODI (LLC)	Neptune Systems	Local Dealer	From water storage to octopus tanks Part number:18
Banded Trochus Snail	LiveAquaria	CN-112080	For algae bin Part number:19
Chaetomorpha Algae, Aquacultured	LiveAquaria	BVJ-76354	For algae bin Part number:20
Clams - Live, Hard Shell, Cherrystone, Wild, USA Dozen	Fulton Fish Market	N/A	Live food Part number:21
Classic Sea Salt Mix - Tropic Marin	Bulk Reef Supply	211813	Salt for tank water Part number:22
Clear Masterkleer Soft PVC Plastic Tubing, for Air and Water, 3/4" ID, 1" OD	McMaster	5233K71	Cleaning tool Part number:23
Continuum Aquablade-P Acrylic Safe Algae Scraper W/ Plastic Blade - 15 Inch	Marine Depot	4C31001	Cleaning tool Part number:24
Copper Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	65L	For water testing Part number:25
Curve Refugium CREE LED Aquarium Light	Eshopps	6500K	Algae bin light Part number:26
Eheim 1262 return pumps	EHEIM	1250219	Pump for storage tanks Part number:27
Eshopps R-100 Refugium Sump GEN 3	Eshopps	15000	Sump system Part number:28
Ethyl Alcohol, 200 Proof	Sigma-Aldrich	64-17-5	Anesthesia Part number:29
Extech DO600 ExStik II Dissolved Oxygen Meter	Extech	DO600	Oxygen measurement Part number:30
Fiddler Crabs; live; dozen	NORTHEAST BRINE SHRIMP	N/A	Live food Part number:31
Filter Cartridges	Aqueon	100106087	Food tank filters Part number:32
Florida Crushed Coral Dry Sand - CaribSea	Bulk Reef Supply	212959	Sediment for bottom of tank Part number:33
FMM module	Neptune Systems	Local Dealer	Controller for apex system Part number:34
Fritz-Zyme TurboStart 900 - Fritz	Bulk Reef Supply	213036	Bacteria start Part number:35
Hand Operated Drum Pump, Siphon, Basic Pump with Spout, For Container Type Bucket, Pail	Grainger	38Y789	Water Hand Pump Part number:36
High pH Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	27	For water testing Part number:37
Imagitarium Fine Mesh Net for Shrimp	Petco	2580993	Shrimp and fish transfer net Part number:38
Leak Detection Kit (LDK) - Includes FMM module plus 2 ALD sensors	Neptune Systems	Local Dealer	Placed on floor to detect water Part number:39
Lee`S Algae Scrubber Pad Jumbo - Glass	Marine Depot	LE12007	Cleaning tool Part number:40
Live rocks	Preuss Pets	Local Dealer	Habitat for octopus Part number:41
Long Bottle Cleaning Brush 17" Extra Long	Haomaomao	B07FS7J7PN	Tank Cleaning Part number:42
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M1028-100ML	Euthanasia Part number:43
Magnetic Probe Rack	Neptune Systems	Local Dealer	For holding apex sensor probes Part number:44
Marine Ghost Shrimp	NORTHEAST BRINE SHRIMP	N/A	Live food Part number:45
Marineland C-Series Canister Carbon Bags Filter Media, 2 count	Chewy	98331	For elevated copper levels Part number:46
Nitra-Zorb Bag	Aquarium Pharmaceuticals	AP2213	Absorbs nitrogen compounds Part number:47
Nitrate Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	LR1800	For water testing Part number:48
Nitrite Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	26	For water testing Part number:49
Pawfly 2 Inch Air Stones Cylinder 6 PCS Bubble Diffuser Airstones for Aquarium Fish Tank Pump Blue	Amazon	B076S56XWX	Aerate water Part number:50
Penn Plax Airline Tubing for Aquariums –Clear and Flexible Resists Kinking, 8 Feet Standard	Amazon	B0002563MM	Tubing for connecting air pump to air stone Part number:51
Plumbing with unions/valves plus 3/4" flex hose	Preuss Pets	Local Dealer	Water transport Part number:52
PM1 module	Neptune Systems	Local Dealer	Power control module for apex Part number:53
Protein skimmer	Reef Octopus	AC20284	Removes biowaste from system Part number:54
PVC Apex Mounting board, grommets, wire mounts	Neptune Systems	Local Dealer	Helps ensure organization for wires and tubing within system Part number:55
PVC Regular Cement and 4-Ounce NSF Purple Primer	Amazon	Oatey - 30246	For connecting PVC pipes Part number:56
RODI unit	Neptune Systems	Local Dealer	RO Water Part number:57
Salinity Probes	HANNA probes	HI98319	Measures salinity of water Part number:58
Seachem Pristine Aquarium Treatment	Seachem	1438	Provides bacteria that break down excess food, waste and detritus Part number:59
Seachem Stability Fish Tank Stabilizer	Seachem	116012607	Seachem Stability will rapidly and safely establish the aquarium biofilter in freshwater and marine systems Part number:60
Set of lexan tops	Preuss Pets	Local Dealer	Aquarium tank lids Part number:61
Set of Various extended length aquabus cables	Neptune Systems	Local Dealer	Cables for Apex system Part number:62
SLSON Aquarium Algae Scraper Double Sided Sponge Brush Cleaner Long Handle Fish Tank Scrubber for Glass Aquariums	Amazon	B07DC2TZCJ	Cleaning tool Part number:63
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 45 Degree Elbow Adapter, 3/4 Socket Female x 3/4 Socket Male	McMaster	4880K189	PVC pipe Part number:64
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 90 Degree Elbow Adapter, 1 Socket Female x 1 Socket Male	McMaster	4880K773	PVC pipe Part number:65
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Adapter, 1 Socket-Connect Female x 1 Barbed Male	McMaster	4880K415	PVC pipe Part number:66
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Straight Reducer, 2 Socket Female x 3/4 Socket Female	McMaster	4880K008	PVC pipe Part number:67
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Tee Connector, White, 1 Size Socket-Connect Female	McMaster	4880K43	PVC pipe Part number:68
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 1 Pipe Size, 10 Feet Long	McMaster	48925K13	PVC pipe Part number:69
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 3/4 Pipe Size, 5 Feet Long	McMaster	48925K92	PVC pipe Part number:70
Structural FRP Fiberglass Sheet, 48" Wide x 96" Long, 1/2" Thick	McMaster	8537K15	Table top material Part number:71
Structural FRP Fiberglass Square Tube, 10 Feet Long, 2" Wide x 2" High Outside, 1/8" Wall Thickness	McMaster	8548K33	Structural table material Part number:72
Tank Sediment	TopDawg Pet Supply	8479001207	Sediment for bottom of fiddler crab tank Part number:73
Temperature probe	Neptune Systems	Local Dealer	Temperature probe for tanks Part number:74
Tetra TetraMarine Large Saltwater Flakes for all Marine Fish	Amazon	B00025K0US	Fish, shrimp, and crab food Part number:75
Tetra Whisper Aquarium Air Pump for 10 gallon Aquariums	Petco	2335234	Air pump for smaller tanks Part number:76
Thick-Wall Through-Wall Pipe Fitting, for Water, PVC Connector, 1 Socket-Connect Female	McMaster	36895K843	PVC pipe Part number:77
Vectra s2 pump	Bulk Reef Supply	212141	Aquarium Pump Part number:78
Water Pump	TACKLIFE	GHWP1A	Pump for cleaning tanks Part number:79
Wyze Cam v2 1080p HD Indoor WiFi Smart Home Camera with Night Vision	Amazon	B076H3SRXG	DeepLabCut Recording Part number:80

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