从生物膜内的 铜绿假单胞 菌中分离总 RNA 以测量基因表达

摘要

该方案提出了一种从腔室载玻片中生长的 铜绿假单胞 菌生物膜中分离 RNA 以进行高通量测序的方法。

摘要

铜绿假单胞 菌是一种机会性细菌病原体，可引起囊性纤维化 （CF） 患者的气道感染。 铜绿假单 胞菌以其形成受胞外多糖基质保护的生物膜的能力而闻名。这种基质使微生物对外部因素（包括抗生素治疗）更具弹性。用于研究的生物膜生长最常见的方法之一是在微量滴定板或腔室载玻片中。这些系统的优点是它们允许测试多种生长条件，但它们的缺点是它们产生有限量的生物膜用于 RNA 提取。本文的目的是提供详细的分步方案，说明如何从少量质量和数量足够高的生物膜中提取总 RNA，以进行高通量测序。该协议允许研究这些生物膜系统内的基因表达。

引言

大多数慢性细菌感染，例如囊性纤维化 （CF） 患者的肺部感染和假体相关感染，其特征是生物膜内生物体的生长。生物膜¹ 是包裹在主要由多糖² 组成的基质中的细菌群落。生物膜内的细菌可以缓慢生长、代谢休眠，并且在厌氧、缺氧条件下。由于抗生素渗透性降低、药物外排泵表达增加和细胞分裂减少等因素，生物膜对抗生素的耐药性更强³。由于这些和其他原因，它们具有极大的研究兴趣。

为了准确研究 CF 患者的慢性铜绿假单胞菌感染等持续感染，需要在体外准确反映生物膜形成的生长条件。一种常见的高通量方法是在腔室载玻片或微量滴定板中培养它们，并通过共聚焦显微镜监测生物膜的形成⁴。众所周知，从浮游或自由漂浮到生物膜细菌生活方式转变的关键调节因子是第二信使 cyclic-di-GMP⁵。cyclic-di-GMP 水平升高会增加促进生物膜生长的特定基因的表达。小的非编码调节 RNA 和群体感应在生物膜形成的调节中也起着重要作用⁵。通过对提取的细菌 RNA 进行测序来测量生物膜基因表达可能具有挑战性。例如，铜绿假单胞菌产生三种胞外多糖（Psl、Pel 和藻酸盐），它们在生物膜中大量产生 ^6,7。这些多糖会干扰 RNA 提取和纯化，导致制备物含低水平细菌 mRNA⁸。市售的 RNA 提取试剂盒能够从浮游细菌培养物中产生高质量的 RNA，但可能无法很好地与生物膜培养物配合使用 ^9,10,11。有一些商业 RNA 提取试剂盒声称适用于生物膜，其中一种我们与这种方法一起使用。

在本手稿中，我们描述了在腔室载玻片中培养铜绿假单胞菌生物膜和提取细菌 mRNA 以进行高通量测序的程序^12,13。利用从 CF 患者痰液样本中收集的临床分离株，我们证明这些方法可用于具有不同生长特征的分离株。与以前的出版物相比，详细描述了该协议，以便在研究细菌生物膜基因表达方面取得更大的成功 11,14,15,16。

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研究方案

研究伦理委员会 （REB） 是收集和处理人类受试者痰液样本所必需的。这项研究得到了病童医院 （REB#1000019444） 的批准。研究伦理委员会 （REB） 需要收集和储存人类受试者的痰液样本。这些研究得到了病童医院 REB#1000058579 的批准。

1. 生物膜形成

1. 在 37 °C 培养箱中，在 Luria 肉汤 （LB） 琼脂平板上培养从本研究中使用的 CF 患者痰液样本中获得的铜 绿假单胞 菌分离株过夜。
   注意：正确的划线技术对于获得单个细菌菌落很重要。旋转板时划线会充分稀释细菌细胞，以便单个菌落可以生长。
   1. 在新鲜 LB 板的顶端使用锯齿形图案的接种环对细菌进行划线，直到覆盖板的约 1/4。
   2. 将板旋转约 60°。取一个新的接种环，将其穿过条纹区域一次，然后进入板的第二个干净区域，重复锯齿形图案。
   3. 重复步骤 1.1.2 将新循环放入板的第三个区域。放入培养箱时，请装回盖子并倒置板。
2. 使用无菌接种环从琼脂平板（包含单个细菌菌株）中挑选单个细菌菌落，并接种装有 5 mL 无菌 LB 培养基的培养管。每次使用新定量环，接种两个额外的培养管，其中填充有来自同一板的 5 mL LB 培养基。
3. 对不同的细菌菌株重复相同的接种程序。将培养物在 37 °C 下以 220 RPM 振荡过夜。
   注意：每个含有单个细菌菌株的琼脂板用于接种 3 个独立的培养管。这三个试管代表一个菌株的生物学重复，一式三份，并作为单独的样品处理。这与技术重复不同，后者需要从单个培养管中提取 RNA 3 次。
4. 通过将 50 μL 过夜培养物转移到含有 4.95 mL 新 LB 培养基的新培养管中，制备 1：100 稀释的过夜培养物。
5. 将稀释的培养物在 37 °C 下再培养 3 小时，以 220 RPM 摇动或直到 OD₆₀₀ 为 0.1 或更高。在分光光度计上以 OD₆₀₀ 测量细胞密度。
6. 在新的 1.7 mL 微量离心管中，用新鲜 LB 将 OD₆₀₀ 调整至 0.1（早期对数期），总体积为 1.5 mL。
7. 倒置轻轻混合。将 300 μL 每种调整后的培养物转移到 8 孔室载玻片的 4 个孔中，最终每张载玻片有 2 个不同的样品（图 1）。
8. 将载玻片置于 37 °C 培养箱中过夜，不受干扰 24 小时。为防止蒸发，请将玻片放在小塑料托盘中的湿纸巾顶部。

2. 生物膜回收

注：每个载玻片包含八个独立的孔。单个样品由四个带有生物膜的孔组成，这些孔将被合并¹⁷.该提取方案适用于 1 个样品（4 个孔），其中生物膜一次从 2 个孔中回收。使用市售 RNA 提取试剂盒进行 RNA 提取，该试剂盒包括磁珠打纬步骤和基于柱的纯化，并进行了修饰。按照制造商的说明进行试剂制备。

1. 在层流罩中，使用移液器吸头从 4 个孔中的 2 个孔中缓慢去除培养基。将载玻片倾斜 45° 角，并从孔的底角吸出培养基，以防止生物膜脱落。
2. 保持载玻片倾斜，将 300 μL 不含 RNase 的水轻轻移液到两个空井的底角，洗掉浮游细胞。如步骤 2.1 中所述，轻轻移出水，将其移出。重复洗涤步骤，尽可能多地去除水。
3. 将 300 μL RNA 保护试剂（参见 材料表）添加到两个空孔中，其底部有生物膜。将腔室载玻片放在玻璃板上以防止孔破裂，然后用小的、无核酸酶的无菌金属刮刀刮擦 2 个孔中的生物膜，以重新悬浮生物膜细菌。静置，直到从同一样品中剩余的 2 个未触及的孔中回收生物膜。
   注：添加 RNA 保护试剂可确保在处理同一样品的其余两个孔时，刮取孔中生物膜样品在环境温度下的稳定性。RNA 保护试剂裂解细胞并灭活核酸酶和感染因子，从而保存 RNA。
4. 要从样品的剩余 2 个孔中回收生物膜（提醒：一个样品由 4 个孔组成），请按照步骤 2.1 中描述的相同方式从剩余的 2 个新孔中去除 LB 培养基。像以前一样，重复步骤 2.2 用不含 RNase 的水从两个新孔中洗掉浮游细胞。
5. 回到前 2 个孔，在步骤 2.3 结束时生成的保护试剂中刮取生物膜，然后缓慢移液以混合来自 一个 刮取的井的 300 μL 重新悬浮的生物膜，尽量不要产生太多气泡。
   1. 将井中的所有内容物转移到新清洗、清空的井 中 。将第二个刮得好的井中的 300 μL 重新悬浮的生物膜混合并转移到剩余的、新洗涤、清空的井中。
      注：不要向 2 个带有生物膜的新洗涤的孔中添加新的 RNA 保护试剂，而是将保护试剂中已有的先前刮下的生物膜转移到这些新洗涤的孔中。这将使组合样品体积保持足够低，以满足市售 RNA 提取试剂盒的起始量要求。原理图见 图 1 。
6. 如步骤 2.3 所示，将腔室载玻片放在玻璃板上，并用小的、无核酸酶的无菌金属刮刀刮擦 2 个新孔中的生物膜，以重新悬浮生物膜细菌。
7. 将 2 个新孔中 所有 重悬的生物膜合并到一个无 RNase、低结合力的 1.5 mL 微量离心管中。测量体积，总体积应为 ~500 - 600 μL。
   注：来自第二对新孔的混合生物膜悬浮液将包含来自样品原始 4 个孔的所有生物膜材料。

3. 总 RNA 分离和质量评估

注意：RNA 提取是使用声称适用于生物膜的商业 RNA 提取试剂盒进行的。如果可能，各个组件都包含在 材料表中。如果可能，将解释每个纯化步骤背后的机制。

1. 加入足够的 RNA 保护试剂，使试管中总共 750 μL。将整个体积转移到含有 0.1 和 0.5 mm 珠子的 2 mL 珠子打浆裂解管中（参见 材料表）。在打珠器中以最大速度搅拌 2 1/2 分钟。
   注：0.1 mm 和 0.5 mm 高密度微珠的组合加上微珠打浆机上的高速混合，可确保微生物细胞壁的彻底均质化。
2. 以 16,000 x g 离心 1 分钟以沉淀珠子。将上清液转移到新的微量离心管中，最大限度地减少任何珠子的转移，这将使步骤 3.3 更容易。测量音量。
3. 加入等体积的 RNA 裂解缓冲液 （~450 μL） 并充分混合。将多达 800 μL 的样品转移至收集管中的硅胶柱中，避免转移任何珠子，并以 16,000 x g 离心 30 秒。保存流出液，因为它含有 RNA，而 DNA 与色谱柱结合。
   注：RNA 裂解缓冲液含有硫氰酸胍和去污剂 N-月桂酰肌氨酸，用于裂解细胞。硫氰酸鸟苷是一种离液剂，也可使核酸酶失活，并且在离心柱中发现的二氧化硅存在下，可促进 DNA 与二氧化硅的结合¹⁸。由于不含乙醇，因此 DNA 优先结合 DNA，而不是 RNA 与硅胶离心柱¹⁹。步骤 3.3 的目的是结合和去除基因组 DNA。我们想保留包含在流通部分的 RNA。
4. 如果剩余更多样品，请将色谱柱转移到新的收集管中，然后重新装入其余样品。以 16,000 x g 离心 30 秒。保持 RNA 的流出液，并与第一等分试样混合。
5. 测量组合流通体积，加入等体积的 100% 乙醇并充分混合。将多达 800 μL 的溶液转移到收集管中新的第二个硅胶离心柱中，并以 16,000 x g 离心 30 秒。丢弃流出物。
   注：向含有 RNA 的离液盐溶液中添加乙醇可增强 RNA 与硅胶离心柱¹⁹ 的结合。
6. 对于 > 800 μL 的溶液，重新加载离心柱并离心，直到整个溶液离心。每次离心后丢弃流通液。
7. 向色谱柱中加入 400 μL 洗涤缓冲液，并以 16,000 x g 离心 30 秒以去除一些盐。丢弃流出物。
8. 根据制造商的说明制备 DNase I 反应混合物，并进行柱内 DNase 处理以去除任何残留的 DNA。
9. 将冻干的 DNase I 重悬于 275 μL 不含 RNase 的水中，制成 1 U/μL 溶液。轻轻倒置混合。
10. 将 5 μL 稀释的 DNase I 与 75 μL 提供的 DNase 消化缓冲液混合。倒置轻轻混合。
11. 将 80 μL 制备好的溶液直接添加到柱基质上。在室温下孵育 20 分钟。
12. 向色谱柱中加入 400 μL RNA 制备缓冲液，并以 16,000 x g 离心 30 秒。丢弃流出物。
13. 向色谱柱中加入 700 μL RNA 洗涤缓冲液并重复离心。丢弃流出物。
14. 加入 400 μL RNA 洗涤缓冲液，将色谱柱离心 2 分钟，以完全去除任何残留缓冲液。
    注：有 2 种不同的清洗步骤可去除色谱柱上的杂质。制备缓冲液含有与乙醇混合的弱离液盐，以去除残留蛋白质。接下来，使用洗涤缓冲液进行乙醇洗涤以去除盐分。必须去除任何残留的乙醇，以便高效洗脱 RNA^19,20。
15. 小心地将色谱柱转移到新的低结合微量离心管中。
16. 将 50 μL 不含 RNase 的水直接加入柱基质中，并孵育 5 分钟。以 16,000 x g 离心 1 分钟以洗脱 RNA。
17. 如需进一步纯化以去除 PCR 抑制剂，请将 PCR 抑制剂过滤器放入新的收集管中。加入 600 μL 提供的抑制剂制备溶液（参见 材料表）。
18. 以 8,000 x g 离心 3 分钟以洗涤过滤器。将洗涤后的过滤器转移到新的低结合微量离心管中。
19. 将步骤 3.13 中洗脱的 RNA 转移到洗涤的过滤器中，并以 16,000 x g 离心 3 分钟。
    注：RNA 可立即使用或储存在 -80 °C 下。
20. 使用高灵敏度荧光系统测定 RNA 的浓度²¹.
    注：这些系统允许对目标靶标特异性溶液中的少量 RNA 进行灵敏定量。
    1. 使用可提供 RIN（RNA 完整性值）的自动电泳系统评估 RNA 的质量，该系统是衡量 RNA 质量的指标^22,23。

4. 核糖体 RNA 耗竭和高通量测序

1. 将 RNA 提交给多伦多大学（加拿大多伦多）（https://www.cagef.utoronto.ca/）的基因组进化和功能分析中心 （CAGEF） 基因组中心，用于细菌 rRNA 耗竭和 RNA 定向文库制备（参见材料表）。
   注：细菌 rRNA 耗竭靶向 5S、16S 和 23S rRNA 以去除²⁴。
2. 使用市售 rRNA 细菌去除试剂盒去除 rRNA。按照方案输入 10 ng - 1 μg 完整或部分降解的总 RNA。
3. 使用 RNA 定向文库制备试剂盒构建 RNA 测序文库，每个文库连接不同的索引。
4. 汇集等摩尔量的每个 RNA 文库，并使用 100 个碱基的双端读数²⁵ 进行高通量测序。

5. 测序读长的质量评估

注意：使用免费提供的程序 FastQC²⁶ 检查测序读数的质量，该程序可通过免费的开源平台 Galaxy²⁷ 获得。

1. 转到 https://usegalaxy.org/。单击 Login 或 Register 菜单，然后使用凭据登录或创建帐户。
2. 单击页面左上角的 Upload Data 链接，在 Tools 菜单下，然后上传fastq.gz排序文件。等待文件名出现在页面右侧的 History 面板下。
3. 在“工具”菜单下选择“FASTQ 质量控制”以显示程序列表。选择 FastQC，这将填充屏幕的中间面板。
4. 在 Short read data from your current history （从当前历史记录中短读数据） 下，从下拉菜单中选择上传的 fastq.gz 文件。
5. 选择 Execute （执行 ） 以运行程序。
6. 在 History 面板下查看结果（表 2）。
   注意：有关如何使用 Galaxy 的更多详细说明，请访问 https://galaxyproject.org/support/ 的支持页面。

6. 测序读长的映射

注意：列出的是 RNA-seq 数据的接头修剪和读取映射的基本管道。使用 Trimmomatic²⁸ 从读数中修剪接头序列。修剪的读数映射到铜绿假单胞菌 PAO1 参考基因组 （NC_002516.2），使用 BWA³⁰ 和 Samtools³¹ 从 NCBI （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）²⁹获得。为简单起见，一对读取称为 PA_1.fq 和 PA_2.fq;要修剪的适配器读取文件称为 adapter.fa;PAO1 参考序列称为 PAO1.fasta。所有工具都是开源的，并在 UNIX/LINUX 环境中运行。强烈建议您熟悉 UNIX/LINUX 的基础知识，以便执行这些命令。

1. 在 UNIX/LINUX 中打开一个窗口。
2. 安装 Java、Trimmomatic、BWA 和 Samtools。
3. 导航到文件trimmomatic-0.39.jar所在的文件夹。
4. 通过键入命令从读取中修剪掉任何适配器序列：
   Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP：adapters.fa
   注意： 仅删除适配器序列。读取尚未针对质量³² 进行修剪。
5. 将 PAO1.fasta 参考文件移动到同一文件夹中。
6. 使用 BWA 和命令为引用编制索引：
   Bwa 指数 PA01.fasta
7. 通过键入以下 4 个命令，将配对的读数映射到参考基因组。在前一个命令完成后键入每个命令。
   Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
   Samtools 视图 -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
   Samtools 排序 PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
   Samtools 索引 PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
8. 通过键入命令查看映射统计信息：
   Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
   注意：统计数据的^第 3 行报告了映射到参考基因组的读数的比例。
9. 分别使用以下 2 个命令³³ 计算平均读取深度和覆盖范围广度：
   SAMToos深度 -A PA_R1R2_sorted.bam |awk '{c++;s+=$3}END{print s/c}'
   SAMTories 深度 -A PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam |awk '{c++; if（$3>0） total+=1}END{print （total/c）*100}'

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结果

该方法的一般概述如图 1 所示。我们之前使用 8 孔室载玻片来生长铜绿假单胞菌生物膜并将它们暴露于抗生素中，然后在不同时间点通过共聚焦显微镜检查它们^12,13。该方法可用于直接从该系统中生长的生物膜中提取总 RNA，以研究处理后的基因表达变化。该方案已针对铜绿假单胞菌进行了优?...

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讨论

从 17 种不同的细菌生物膜样品中成功提取总 RNA，一式三份，总共得到 51 个样品。将 49 个 RNA 文库合并并成功测序。总体而言，这验证了我们的质量标准，成功率为 96%，尽管超过一半的样品被认为丰度较低且质量欠佳 34,35,36,37。

意义
该 RN...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Automated electrophoresis of biomolecules
Agilent RNA 6000 pico kit	Agilent	5067-1513	High sensitivity RNA electrophoresis chip to generate a RIN
DNA/RNA Lysis Buffer	Zymo Research	D7001-1-50	A guanidinium thiocyanate and N-Lauroylsarcosine-based lysis buffer sold as part of a nucleic acid purification kit
DNA/RNA Prep Buffer	Zymo Research	D7010-2-10	A guanidine HCl and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNA/RNA Shield	Zymo Research	R1100-50	DNA and RNA preservation/protection reagent
DNA/RNA Wash Buffer	Zymo Research	D7010-3-6	A salt and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNBSEQ G-400RS	MGI	G-400RS	High throughput sequencer
MGIEasy RNA Directional Library Prep Set	MGI	1000006386	Generate libraries for MGI high-throughput sequencing platforms from total RNA.
Mini-Beadbeater-96	BioSpec	1001	A high energy, high throughput cell disrupter
NEBNext rRNA Depletion Kit (bacteria)	New England Biolabs	E7850X	Efficient and specific depletion of bacterial rRNA (5S, 16S, 23S)
Nunc Lab-Tek II chamber slide system	Thermo Fisher Scientific	154534	8-well chamber slide with removable wells
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33238	Fluorometer for DNA, RNA and proteins
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32852	High sensitivity fluorometric assay to measure RNA concentration
Spin-Away Filters	Zymo Research	C1006-50-F	Silica-based spin column primarily used to bind or remove genomic DNA
Sterile inoculation loops, 1 uL	Sarstedt	86.1567.050	Sterile, disposable inoculation loops for manipulation of microorganisms
ZR BashingBead Lysis tubes	Zymo Research	S6003-50	2 mL tubes containing 0.1 and 0.5 mm bead lysis matrix for homogenizing biological samples
Zymo Spin IIICG Columns	Zymo Research	C1006-50-G	Silica-based spin column for purification of DNA and RNA
Zymo-Spin III-HRC Filters	Zymo Research	C1058-50	Remove inhibitors such as polyphenolic compounds, humic/fulvic acids, tannins, melanin, etc.
Zymobiomics DNA/RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2002	DNA and RNA dual extraction kit
Zymobiomics HRC Prep solution	Zymo Research	D4300-7-30	To be used with Zymo-Spin III-HRC Filters to remove PCR inhibitors