Gen Ekspresyonunun Ölçülmesi için Biyofilmler İçinde Pseudomonas aeruginosa'dan Toplam RNA İzolasyonu

Özet

Bu protokol, yüksek verimli dizileme için oda slaytlarında büyütülen Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerinden RNA'yı izole etmek için bir yöntem sunar.

Özet

Pseudomonas aeruginosa , kistik fibrozis (KF) hastalarının hava yollarında enfeksiyonlara neden olan fırsatçı bir bakteriyel patojendir. P. aeruginosa , bir ekzopolisakkarit matrisi tarafından korunan biyofilmler oluşturma yeteneği ile bilinir. Bu matris, mikroorganizmaların antibiyotik tedavisi de dahil olmak üzere dış etkenlere karşı daha dirençli olmasını sağlar. Araştırma için en yaygın biyofilm büyütme yöntemlerinden biri mikrotitre plakaları veya odacıklı slaytlardır. Bu sistemlerin avantajı, çoklu büyüme koşullarının test edilmesine izin vermeleridir, ancak dezavantajları, RNA ekstraksiyonu için sınırlı miktarda biyofilm üretmeleridir. Bu makalenin amacı, yüksek verimli dizileme için yeterli kalite ve miktardaki küçük miktarlarda biyofilmden toplam RNA'nın nasıl çıkarılacağına dair ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlamaktır. Bu protokol, bu biyofilm sistemleri içinde gen ekspresyonunun incelenmesine izin verir.

Giriş

Kistik fibrozis (KF) hastalarında akciğer enfeksiyonları ve protez ile ilişkili enfeksiyonlar gibi kronik bakteriyel enfeksiyonların çoğu, biyofilmler içindeki organizmaların büyümesi ile karakterizedir. Biyofilmler¹ , esas olarak polisakkaritler^2'den oluşan bir matris içinde yer alan bakteri topluluklarıdır. Biyofilmlerdeki bakteriler yavaş büyüyen, metabolik olarak uykuda ve anaerobik, hipoksik koşullarda olabilir. Biyofilmler, antibiyotik penetrasyonunun azalması, ilaç akış pompalarının ekspresyonunun artması ve hücre bölünmesinin azalması gibi faktörler nedeniyle antibiyotiklere daha dirençlidir³. Bu ve diğer nedenlerden dolayı, büyük bir araştırma ilgisi vardır.

KF hastalarında kronik Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonları gibi kalıcı enfeksiyonları doğru bir şekilde incelemek için, biyofilm oluşumu ile görülen büyüme koşullarının in vitro olarak doğru bir şekilde yansıtılması gerekir. Yaygın, yüksek verimli bir yöntem, bunları oda slaytlarında veya mikrotitre plakalarında büyütmek ve konfokal mikroskopi⁴ ile biyofilm oluşumunu izlemektir. Planktonik veya serbest yüzen bir biyofilm bakteri yaşam tarzına geçişte anahtar bir düzenleyicinin ikincil haberci olan döngüsel-di-GMP⁵ olduğu bilinmektedir. Artan döngüsel-di-GMP seviyeleri, biyofilm büyümesini destekleyen spesifik genlerin ekspresyonunu arttırır. Küçük kodlamayan düzenleyici RNA'lar ve çekirdek algılama da biyofilm oluşumunun düzenlenmesinde önemli roller oynar⁵. Ekstrakte edilmiş bakteriyel RNA'yı dizileyerek biyofilm gen ekspresyonunu ölçmek zor olabilir. Örneğin P. aeruginosa, biyofilmlerde önemli miktarlarda üretilen üç ekzopolisakkarit (Psl, Pel ve aljinat) üretir ^6,7. Bu polisakkaritler, RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılmasına müdahale edebilir ve bu da düşük seviyelerde bakteri mRNA⁸ içeren saf olmayan preparatlara yol açabilir. Ticari olarak temin edilebilen RNA ekstraksiyon kitleri, planktonik bakteri kültürlerinden yüksek kaliteli RNA üretebilir, ancak biyofilm kültürleri ^9,10,11 ile de çalışmayabilir. Biyofilmler için işe yaradığını iddia eden birkaç ticari RNA ekstraksiyon kiti vardır ve bunlardan birini bu yöntemle kullanırız.

Bu el yazmasında, P. aeruginosa biyofilmlerinin oda slaytlarında büyütülmesi ve yüksek verimli dizileme^12,13 için bakteriyel mRNA'nın çıkarılması için prosedürleri açıklıyoruz. KF'li hastalardan alınan balgam örneklerinden toplanan klinik izolatları kullanarak, bu yöntemlerin farklı büyüme özelliklerine sahip izolatlar için kullanılabileceğini gösterdik. Önceki yayınlarla karşılaştırıldığında, bu protokol, bakteriyel biyofilm gen ekspresyonunun^{incelenmesinde} daha iyi başarı sağlamak için ayrıntılı olarak açıklanmıştır 11,14,15,16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

İnsan deneklerden balgam örneklerinin toplanması ve işlenmesi için Araştırma Etik Kurulu (REB) gereklidir. Bu çalışma Hasta Çocuklar Hastanesi (REB#1000019444) tarafından onaylanmıştır. Araştırma Etik Kurulu (REB) insan deneklerden balgam örneği toplamak ve saklamak zorundadır. Bu çalışmalar Hasta Çocuklar Hastanesi REB # 1000058579 tarafından onaylanmıştır.

1. Biyofilm oluşumu

1. Bu çalışmada kullanılan KF hastalarının balgam örneklerinden elde edilen Pseudomonas aeruginosa izolatlarını gece boyunca 37 °C inkübatörde Luria Broth (LB) agar plakaları üzerinde büyütün.
   NOT: Tek bakteri kolonileri elde etmek için uygun çizgi tekniği önemlidir. Plakayı döndürürken çizgilenmek, bakteri hücrelerini yeterince seyreltir, böylece tek koloniler büyüyebilir.
   1. Plakanın yaklaşık 1 / 4'ü kaplanana kadar taze bir LB plakasının üst ucunda zikzak şeklinde bir aşılama döngüsü kullanarak bakterileri çizgileyin.
   2. Plakayı yaklaşık 60° döndürün. Yeni bir aşılama döngüsü alın ve zikzak desenini tekrarlayarak çizgili alandan bir kez ve plakanın ikinci, temiz bir alanına geçirin.
   3. Adım 1.1.2'yi plakanın üçüncü bir alanına yeni bir halka ile tekrarlayın. Kuluçka makinesine yerleştirirken kapağı değiştirin ve plakayı ters çevirin.
2. Bir agar plakasından (tek bir bakteri suşu içeren) tek bir bakteri kolonisi seçmek için steril bir aşılama halkası kullanın ve 5 mL steril LB ortamı ile doldurulmuş bir kültür tüpünü aşılayın. Her seferinde yeni bir döngü kullanarak, aynı plakadan 5 mL LB ortamı ile doldurulmuş iki ek kültür tüpünü aşılayın.
3. Farklı bakteri suşları için aynı aşılama prosedürünü tekrarlayın. Kültürleri gece boyunca 37 ° C'de 220 RPM'de çalkalayarak büyütün.
   NOT: Tek bir bakteri suşu içeren her agar plakası, 3 bağımsız kültür tüpünü aşılamak için kullanılır. Üç tüp, bir suş için üç kopya halinde biyolojik kopyaları temsil eder ve ayrı numuneler olarak muamele edilir. Bu, RNA'nın tek bir kültür tüpünden 3 kez çıkarılmasını gerektiren teknik kopyalardan farklıdır.
4. 50 μL'lik bir gece kültürünü 4.95 mL yeni LB ortamı içeren yeni bir kültür tüpüne aktararak gece boyunca kültürlerin 1:100 dilüsyonunu hazırlayın.
5. Seyreltilmiş kültürleri 37 ° C'de 220 RPM'de çalkalayarak veya OD₆₀₀ 0.1 veya daha yüksek olana kadar 3 saat daha büyütün. OD_600'de bir spektrofotometrede hücre yoğunluklarını ölçün.
6. 1.7 mL'lik yeni bir mikrofüj tüpünde, taze LB ile toplam 1.5 mL hacimde OD_600'ü 0.1 ila 0.1 (erken log fazı) ayarlayın.
7. Ters çevirerek hafifçe karıştırın. Ayarlanmış her kültürün 300 μL'sini, slayt başına 2 farklı numune elde etmek için 8 oyuklu bir oda slaytının 4 oyuğuna aktarın (Şekil 1).
8. Slaytları rahatsız edilmeden gece boyunca 24 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için, slaytları küçük bir plastik tepsiye nemli bir kağıt havlunun üzerine yerleştirin.

2. Biyofilm geri kazanımı

NOT: Her cam kaydırak sekiz ayrı kuyu içerir. Tek bir numune, havuzlanacak biyofilmlere sahip dört kuyudan oluşur¹⁷. Bu ekstraksiyon protokolü, biyofilmlerin bir seferde 2 kuyudan geri kazanıldığı 1 numune (4 kuyucuk) içindir. RNA ekstraksiyonları, bir boncuk çırpma adımı ve modifikasyonlarla birlikte sütun bazlı bir temizleme içeren ticari bir RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Reaktif hazırlama için üreticinin talimatlarını izleyin.

1. Laminer akış başlığında, bir pipet ucu kullanarak ortamı 4 kuyudan 2'sinden yavaşça çıkarın. Slaytı 45°'lik bir açıyla eğin ve biyofilmlerin ayrılmasını önlemek için ortamı kuyucukların alt köşesinden pipetleyin.
2. Slaytı eğik tutarak, boşaltılan iki kuyunun alt köşesine 300 μL RNaz içermeyen suyu nazikçe pipetleyerek planktonik hücreleri yıkayın. Suyu, adım 2.1'de açıklandığı gibi nazikçe pipetleyerek çıkarın. Mümkün olduğunca fazla su alarak yıkama adımını tekrarlayın.
3. Tabanlarında biyofilm bulunan iki boşaltılmış kuyucuğun her birine 300 μL'lik bir RNA koruma reaktifi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Kuyucukların kırılmasını önlemek için hazne sürgüsünü bir cam plaka üzerine yerleştirin ve ardından biyofilm bakterilerini yeniden süspanse etmek için 2 kuyucuktaki biyofilmleri küçük, nükleaz içermeyen, steril bir metal spatula ile kazıyın. Aynı numuneden kalan 2 dokunulmamış kuyudan biyofilmler geri kazanılana kadar bekletin.
   NOT: Bir RNA koruma reaktifinin eklenmesi, aynı numunenin kalan iki kuyusunu işlerken, kazınmış oyuklardaki biyofilm numunelerinin ortam sıcaklığında stabilitesini sağlar. RNA koruma reaktifi, hücreleri parçalar ve nükleazları ve bulaşıcı ajanları etkisiz hale getirerek RNA'nın korunmasına neden olur.
4. Bir numune için kalan 2 kuyucuktan biyofilmleri geri kazanmak için (hatırlatma: bir numune 4 kuyudan oluşur), LB ortamını kalan 2 yeni kuyudan adım 2.1'de açıklandığı gibi çıkarın. Planktonik hücreleri, daha önce olduğu gibi her iki yeni kuyudan RNaz içermeyen su ile yıkamak için adım 2.2'yi tekrarlayın.
5. Adım 2.3'ün sonunda oluşturulan koruma reaktifinde kazınmış biyofilmler ile ilk 2 oyuğa geri dönün ve çok fazla kabarcık oluşturmamaya çalışarak 300 μL yeniden süspanse edilmiş biyofilmi kazınmış bir kuyudan karıştırmak için yavaşça pipetleyin.
   1. Kuyudaki tüm içeriği yeni yıkanmış, boşaltılmış kuyulardan birine aktarın. İkinci kazınmış kuyudan 300 μL yeniden süspanse edilmiş biyofilmi kalan, yeni yıkanmış, boşaltılmış kuyuya karıştırın ve aktarın.
      NOT: Biyofilmlerle yeni yıkanmış 2 kuyucuğa yeni RNA koruma reaktifi eklemek yerine, halihazırda koruma reaktifi içinde bulunan önceden kazınmış biyofilmleri bu yeni yıkanmış kuyucuklara aktarın. Bu, birleşik numune hacmini, ticari RNA ekstraksiyon kiti için giriş gereksinimlerini karşılayacak kadar düşük tutacaktır. Şematik için Şekil 1'e bakın.
6. Biyofilm bakterilerini yeniden süspanse etmek için hazne sürgüsünü bir cam plaka üzerine yerleştirerek ve biyofilmleri 2 yeni kuyucukta küçük, nükleaz içermeyen, steril bir metal spatula ile kazıyarak biyofilmleri adım 2.3'teki gibi yeni kuyucuklarda kazıyarak tekrarlayın.
7. 2 yeni kuyudan gelen tüm yeniden süspanse edilmiş biyofilmi tek bir RNaz içermeyen, düşük bağlı, 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. Toplam ~ 500 - 600 μL olması gereken hacmi ölçün.
   NOT: Bu ikinci yeni kuyu çiftinden elde edilen birleşik biyofilm süspansiyonu, bir numunenin orijinal 4 kuyusundan gelen tüm biyofilm malzemesini içerecektir.

3. Toplam RNA izolasyonu ve kalite değerlendirmesi

NOT: RNA ekstraksiyonu, biyofilmler üzerinde çalıştığını iddia eden ticari bir RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Münferit bileşenler, mümkünse Malzeme Tablosuna dahil edilmiştir. Her bir saflaştırma adımının arkasındaki mekanizmaların açıklamaları mümkün olduğunda sağlanır.

1. Tüpte toplam 750 μL'ye yetecek kadar RNA koruma reaktifi ekleyin. Tüm hacmi 0,1 ve 0,5 mm boncuklar içeren 2 mL'lik bir boncuk çırpma lizis tüpüne aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız). Bir boncuk çırpıcıda maksimum hızda 2 1/2 dakika çırpın.
   NOT: 0,1 mm ve 0,5 mm yüksek yoğunluklu boncukların yanı sıra bir boncuk çırpıcı üzerinde yüksek hızlı karıştırma kombinasyonu, mikrobiyal hücre duvarlarının tam homojenizasyonunu sağlar.
2. Boncukları peletlemek için 16.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, böylece herhangi bir boncuk transferini en aza indirin, bu da adım 3.3'ü kolaylaştıracaktır. Sesi ölçün.
3. Eşit hacimde RNA lizis tamponu (~ 450 μL) ekleyin ve iyice karıştırın. 800 μL'ye kadar numuneyi, herhangi bir boncuk transferinden kaçınarak, bir toplama tüpündeki bir silika kolonuna aktarın ve 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. DNA sütuna bağlıyken RNA'yı içerdiği için akışı kaydedin.
   NOT: RNA lizis tamponu, hücreleri parçalamak için guanidinyum tiyosiyanat ve deterjan N-lauroylsarcosine içerir. Guanidinyum tiyosiyanat, aynı zamanda nükleazları inaktive eden ve spin kolonunda bulunan silika varlığında DNA'nın silika^18'e bağlanmasını destekleyen kaotropik bir ajandır. Etanolün yokluğu, RNA'nın değil, DNA'nın silika spin-kolonuna¹⁹ tercihli bağlanmasına izin verir. Adım 3.3'ün amacı, genomik DNA'yı bağlamak ve çıkarmaktır. Akış kısmında bulunan RNA'yı korumak istiyoruz.
4. Daha fazla numune kalırsa, sütunu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve numunenin geri kalanıyla yeniden yükleyin. 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. RNA ile akışı koruyun ve ilk alikot ile birleştirin.
5. Kombine akış hacmini ölçün ve eşit hacimde %100 etanol ekleyin ve iyice karıştırın. 800 μL'ye kadar çözeltiyi bir toplama tüpündeki yeni, ikinci bir silika spin kolonuna aktarın ve 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
   NOT: RNA'yı içeren kaotropik tuz çözeltisine etanol ilavesi, RNA'nın silika spin-kolonuna¹⁹ bağlanmasını arttırır.
6. 800 μL>lik çözeltiler için, döndürme kolonunu yeniden yükleyin ve tüm çözelti döndürülene kadar santrifüjleyin. Her dönüşten sonra akışı atın.
7. Kolona 400 μL yıkama tamponu ekleyin ve tuzların bir kısmını çıkarmak için 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
8. DNaz I reaksiyon karışımını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve kalıntı DNA'yı çıkarmak için kolon içi DNaz işlemini gerçekleştirin.
9. 1 U / μL'lik bir çözelti yapmak için liyofilize DNaz I'i 275 μL RNaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. Hafifçe ters çevirerek karıştırın.
10. 5 μL seyreltilmiş DNaz I'i sağlanan 75 μL DNaz sindirim tamponu ile birleştirin. Ters çevirerek hafifçe karıştırın.
11. Hazırlanan çözeltinin 80 μL'sini doğrudan kolon matrisinin üzerine ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
12. Kolona 400 μL RNA hazırlık tamponu ekleyin ve 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
13. Kolona 700 μL RNA yıkama tamponu ekleyin ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Akışı atın.
14. 400 μL RNA yıkama tamponu ekleyin ve artık tamponu tamamen çıkarmak için sütunu 2 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Kolondaki yabancı maddeleri temizlemek için 2 farklı yıkama adımı vardır. Hazırlık tamponu, artık proteinleri uzaklaştırmak için etanol ile karıştırılmış zayıf bir kaotropik tuz içerir. Daha sonra, yıkama tamponu, tuzları uzaklaştırmak için etanol yıkamaları yapmak için kullanılır. RNA ^19,20'nin verimli bir şekilde elüsyonuna izin vermek için kalan etanol çıkarılmalıdır.
15. Kolonu dikkatlice yeni, düşük bağlamalı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
16. 50 μL RNaz içermeyen suyu doğrudan kolon matrisine ekleyin ve 5 dakika inkübe edin. RNA'yı elüte etmek için 1 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
17. PCR inhibitörlerini çıkarmak için ek temizlik için, yeni bir toplama tüpüne bir PCR inhibitör filtresi yerleştirin. Sağlanan inhibitör hazırlama çözeltisinden 600 μL ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
18. Filtreyi yıkamak için 8.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Yıkanmış filtreyi yeni bir düşük bağlamalı mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
19. Ayrıştırılan RNA'yı adım 3.13'ten yıkanmış filtreye aktarın ve 3 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: RNA hemen kullanılabilir veya -80 °C'de saklanabilir.
20. Yüksek hassasiyetli bir florometrik sistem²¹ kullanarak RNA'nın konsantrasyonunu belirleyin.
    NOT: Bu sistemler, ilgilenilen hedefe özgü çözeltide küçük bir miktar RNA'nın hassas bir şekilde ölçülmesine izin verir.
    1. RNA kalitesinin bir ölçüsü olan bir RIN (RNA bütünlük numarası) sağlayabilen otomatik bir elektroforez sistemi kullanarak RNA'nın kalitesini değerlendirin^22,23.

4. Ribozomal RNA tükenmesi ve yüksek verimli dizileme

1. Bakteriyel rRNA tükenmesi ve RNA yönlü kütüphane hazırlığı için RNA'ları Toronto Üniversitesi'ndeki (Toronto, Kanada) (https://www.cagef.utoronto.ca/) Genom Evrimi ve İşlevi Analiz Merkezi (CAGEF) genom merkezine gönderin (bkz.
   NOT: Bakteriyel rRNA tükenmesi,^24'ün çıkarılması için 5S, 16S ve 23S rRNA'ları hedefler.
2. Ticari bir rRNA bakteri tükenme kiti kullanarak rRNA'ları tüketin. 10 ng - 1 μg bozulmamış veya kısmen bozulmuş toplam RNA girmek için protokolü izleyin.
3. Her kitaplığa bağlı farklı indekslere sahip bir RNA yönlü kitaplık hazırlık kiti kullanarak RNA dizileme kitaplıkları oluşturun.
4. Her RNA kütüphanesinin eşmolar miktarlarını bir araya getirin ve 100 baz çift uçlu okuma²⁵ ile yüksek verimli dizileme gerçekleştirin.

5. Sıralama okumalarının kalite değerlendirmesi

NOT : Ücretsiz, açık kaynaklı platform Galaxy²⁷ aracılığıyla ücretsiz olarak kullanılabilen FastQC²⁶ programını kullanarak sıralama okumalarının kalitesini kontrol edin.

1. https://usegalaxy.org/'a gidin. Giriş Yap veya Kaydol menüsüne tıklayın ve kimlik bilgileriyle giriş yapın veya bir hesap oluşturun.
2. Sayfanın sol üst köşesinde, Araçlar menüsü altında yer alan Veri Yükle bağlantısına tıklayın ve fastq.gz sıralama dosyalarını yükleyin. Dosya adlarının sayfanın sağ tarafında, Geçmiş panelinin altında görünmesini bekleyin.
3. Programların listesini görüntülemek için Araçlar menüsü altında FASTQ Kalite Kontrolü'nü seçin. Ekranın orta panelini dolduracak olan FastQC'yi seçin.
4. Mevcut geçmişinizden kısa okuma verileri altında, açılır menüden yüklenen fastq.gz dosyalarını seçin.
5. Programı çalıştırmak için Yürüt'ü seçin.
6. Sonuçları Geçmiş panelinin altında görüntüleyin (Tablo 2).
   NOT: Galaxy'nin nasıl kullanılacağı hakkında daha ayrıntılı talimatlar için https://galaxyproject.org/support/ adresindeki destek sayfasını ziyaret edin.

6. Sıralama okumalarının haritalanması

NOT : Listelenen, RNA-seq verileri için adaptör kırpma ve okuma eşlemesi için temel bir boru hattıdır. Adaptör dizileri, Trimmomatic²⁸ kullanılarak okumalardan kırpılır. Kırpılmış okumalar, BWA 30 ve Samtools 31 kullanılarak NCBI'den (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)^29'danelde edilen P. aeruginosa ^PAO1 referans genomuna (^NC_002516.2) eşlenir. Basitlik için, bir çift okuma PA_1.fq ve PA_2.fq olarak adlandırılır; Kırpılacak bağdaştırıcı okuma dosyasına adapter.fa adı verilir; ve PAO1 referans dizisi PAO1.fasta olarak adlandırılır. Tüm araçlar açık kaynak kodludur ve UNIX/LINUX ortamında çalışır. Bu komutları uygulamak için UNIX/LINUX'un temelleri hakkında bilgi sahibi olmanız şiddetle tavsiye edilir.

1. UNIX/LINUX'ta bir pencere açın.
2. Java, Trimmomatic, BWA ve Samtools'u yükleyin.
3. Dosyanın bulunduğu klasöre gidin trimmomatic-0.39.jar.
4. Şu komutu yazarak okumalardan tüm bağdaştırıcı dizilerini kesin:
   Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adapters.fa
   NOT: Yalnızca adaptör dizileri kaldırılır. Okumalar kalite için kırpılmamıştır³².
5. PAO1.fasta başvuru dosyasını aynı klasöre taşıyın.
6. BWA'yı kullanarak referansı şu komutla indeksleyin:
   Bwa endeksi PA01.fasta
7. Aşağıdaki 4 komutu yazarak eşleştirilmiş okumaları referans genomla eşleyin. Her komutu bir öncekinin işi bittikten sonra yazın.
   Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
   Samtools görünümü -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
   Samtools sıralama PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
   Samtools dizini PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
8. Şu komutu yazarak eşleme istatistiklerini görüntüleyin:
   Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
   NOT: İstatistiklerin 3^{. satırı} , referans genomla eşleşen okumaların oranını bildirir.
9. Sırasıyla aşağıdaki 2 komutla³³ ortalama okuma derinliğini ve kapsama alanını hesaplayın:
   Samtools Derinlik -A PA_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; s+=$3}END{print s/c}'
   Samtools Derinlik -A PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) total+=1}END{print (toplam/c)*100}'

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yönteme genel bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Daha önce P. aeruginosa biyofilmlerini büyütmek için 8 oyuklu odacıklı slaytlar kullandık ve daha sonra bunları farklı zaman noktalarında konfokal mikroskopi ile incelemeden önce antibiyotiklere maruz bıraktık^12,13. Bu yöntem, tedavi sonrası gen ekspresyonu değişikliklerini incelemek için bu sistemde yetiştirilen biyofil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Toplam RNA, 17 farklı bakteriyel biyofilm örneğinden üç kopya halinde başarıyla ekstrakte edilir ve toplam 51 örnek elde edilir. Kırk dokuz RNA kütüphanesi bir araya getirilir ve başarılı bir şekilde dizilenir. Genel olarak, bu, numunelerin yarısından fazlasının düşük bolluk ve optimal kalitenin altında olduğu düşünülse de, kalite kriterlerimizi %96'lık bir başarı oranıyla doğrulamaktadır 34,35,36,37.^<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Automated electrophoresis of biomolecules
Agilent RNA 6000 pico kit	Agilent	5067-1513	High sensitivity RNA electrophoresis chip to generate a RIN
DNA/RNA Lysis Buffer	Zymo Research	D7001-1-50	A guanidinium thiocyanate and N-Lauroylsarcosine-based lysis buffer sold as part of a nucleic acid purification kit
DNA/RNA Prep Buffer	Zymo Research	D7010-2-10	A guanidine HCl and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNA/RNA Shield	Zymo Research	R1100-50	DNA and RNA preservation/protection reagent
DNA/RNA Wash Buffer	Zymo Research	D7010-3-6	A salt and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNBSEQ G-400RS	MGI	G-400RS	High throughput sequencer
MGIEasy RNA Directional Library Prep Set	MGI	1000006386	Generate libraries for MGI high-throughput sequencing platforms from total RNA.
Mini-Beadbeater-96	BioSpec	1001	A high energy, high throughput cell disrupter
NEBNext rRNA Depletion Kit (bacteria)	New England Biolabs	E7850X	Efficient and specific depletion of bacterial rRNA (5S, 16S, 23S)
Nunc Lab-Tek II chamber slide system	Thermo Fisher Scientific	154534	8-well chamber slide with removable wells
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33238	Fluorometer for DNA, RNA and proteins
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32852	High sensitivity fluorometric assay to measure RNA concentration
Spin-Away Filters	Zymo Research	C1006-50-F	Silica-based spin column primarily used to bind or remove genomic DNA
Sterile inoculation loops, 1 uL	Sarstedt	86.1567.050	Sterile, disposable inoculation loops for manipulation of microorganisms
ZR BashingBead Lysis tubes	Zymo Research	S6003-50	2 mL tubes containing 0.1 and 0.5 mm bead lysis matrix for homogenizing biological samples
Zymo Spin IIICG Columns	Zymo Research	C1006-50-G	Silica-based spin column for purification of DNA and RNA
Zymo-Spin III-HRC Filters	Zymo Research	C1058-50	Remove inhibitors such as polyphenolic compounds, humic/fulvic acids, tannins, melanin, etc.
Zymobiomics DNA/RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2002	DNA and RNA dual extraction kit
Zymobiomics HRC Prep solution	Zymo Research	D4300-7-30	To be used with Zymo-Spin III-HRC Filters to remove PCR inhibitors