בידוד של RNA כולל מ-Pseudomonas aeruginosa בתוך ביופילמים למדידת ביטוי גנים

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה לבידוד RNA מביופילמים של Pseudomonas aeruginosa הגדלים בשקופיות תא לריצוף תפוקה גבוהה.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa הוא פתוגן חיידקי אופורטוניסטי הגורם לזיהומים בדרכי הנשימה של חולי סיסטיק פיברוזיס (CF). P. aeruginosa ידוע ביכולתו ליצור ביופילמים המוגנים על ידי מטריצה של אקסופוליסכרידים. מטריצה זו מאפשרת למיקרואורגניזמים להיות עמידים יותר בפני גורמים חיצוניים, כולל טיפול אנטיביוטי. אחת השיטות הנפוצות ביותר לגידול ביופילם למחקר היא בלוחות מיקרוטיטר או בשקופיות תאיות. היתרון של מערכות אלו הוא בכך שהן מאפשרות בדיקה של תנאי גידול מרובים, אך החיסרון שלהן הוא שהן מייצרות כמויות מוגבלות של ביופילם למיצוי RNA. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד, כיצד לחלץ RNA כולל מכמויות קטנות של ביופילם באיכות ובכמות מספיקות לריצוף תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה מאפשר לחקור את ביטוי הגנים בתוך מערכות ביופילם אלה.

Introduction

רוב הזיהומים החיידקיים הכרוניים, כגון זיהומים ריאתיים בחולי סיסטיק פיברוזיס (CF) וזיהומים הקשורים לתותבות, מאופיינים בגדילה של אורגניזמים בתוך ביופילמים. ביופילמים¹ הם קהילות של חיידקים עטופים במטריצה המורכבת בעיקר מפוליסכרידים². חיידקים בתוך ביופילמים יכולים להיות איטיים, רדומים מבחינה מטבולית ובתנאים אנאירוביים והיפוקסיים. ביופילמים עמידים יותר לאנטיביוטיקה בשל גורמים כמו ירידה בחדירת אנטיביוטיקה, ביטוי מוגבר של משאבות פליטת תרופות וירידה בחלוקת התאים³. מסיבות אלה ואחרות, הם מעוררים עניין מחקרי רב.

על מנת לחקור במדויק זיהומים מתמשכים כגון זיהומים כרוניים של Pseudomonas aeruginosa בחולי CF, תנאי הגידול הנראים עם היווצרות ביופילם צריכים להשתקף במדויק במבחנה. שיטה נפוצה בעלת תפוקה גבוהה היא לגדל אותם בשקופיות תא או בלוחות מיקרוטיטר ולנטר את היווצרות הביופילם על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית⁴. ידוע כי מווסת מפתח במעבר מפלנקטוני, או צף חופשי, לאורח חיים חיידקי ביופילם הוא השליח המשני, cyclic-di-GMP⁵. רמות מחזוריות מוגברות של GMP מגבירות את הביטוי של גנים ספציפיים המקדמים צמיחת ביופילם. רנ"א רגולטורי קטן שאינו מקודד וחישת מניין ממלאים גם תפקידים חשובים בוויסות היווצרות ביופילם⁵. מדידת ביטוי גנים של ביופילם על ידי ריצוף RNA חיידקי שחולץ יכולה להיות מאתגרת. P. aeruginosa, למשל, מייצר שלושה אקסופוליסכרידים (Psl, Pel ואלגינט), המיוצרים בכמויות משמעותיות בביופילמים ^6,7. פוליסכרידים אלה יכולים להפריע למיצוי וטיהור RNA ולהוביל לתכשירים לא טהורים המכילים רמות נמוכות של mRNA⁸ חיידקי. ערכות מיצוי RNA זמינות מסחרית מסוגלות לייצר RNA באיכות גבוהה מתרביות חיידקים פלנקטוניות, אך עשויות שלא לעבוד טוב עם תרביות ביופילם ^9,10,11. ישנן כמה ערכות מיצוי רנ"א מסחריות שמתיימרות לעבוד עבור ביופילמים, שאחת מהן אנו משתמשים בשיטה זו.

בכתב יד זה, אנו מתארים את ההליכים לגידול ביופילמים של P. aeruginosa בשקופיות תא וחילוץ mRNA חיידקי לריצוף תפוקה גבוהה^12,13. תוך שימוש בבידוד קליני שנאסף מדגימות כיח מחולי CF, אנו מדגימים כי ניתן להשתמש בשיטות אלה עבור מבודדים בעלי מאפייני גדילה משתנים. בהשוואה לפרסומים קודמים, פרוטוקול זה מתואר בפירוט כדי לאפשר הצלחה טובה יותר בחקר ביטוי גנים של ביופילם חיידקי 11,14,15,16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מועצת האתיקה של המחקר (REB) נדרשת לאיסוף ועיבוד דגימות כיח מנבדקים אנושיים. מחקר זה אושר על ידי בית החולים לילדים חולים (REB#1000019444). מועצת האתיקה של המחקר (REB) נדרשת לאסוף ולאחסן דגימות ליחה מנבדקים אנושיים. מחקרים אלה אושרו על ידי בית החולים לילדים חולים REB#1000058579.

1. היווצרות ביופילם

1. לגדל מבודדי Pseudomonas aeruginosa שהתקבלו מדגימות כיח של חולי CF ששימשו במחקר זה על צלחות אגר מרק לוריא (LB) באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   הערה: טכניקת פסים נכונה חשובה להשגת מושבות חיידקים בודדות. פסים תוך כדי סיבוב הצלחת ידללו את תאי החיידקים מספיק כדי שמושבות בודדות יוכלו לגדול.
   1. פס חיידקים באמצעות לולאת חיסון בתבנית זיגזג בקצה העליון של צלחת LB טרייה עד לכסות כ-1/4 מהצלחת.
   2. סובב את הצלחת בערך 60°. קח לולאת חיסון חדשה והעביר אותה פעם אחת דרך האזור המפוספס לאזור שני ונקי של הצלחת, תוך חזרה על דפוס הזיגזג.
   3. חזור על שלב 1.1.2 עם לולאה טרייה לאזור שלישי של הצלחת. החזר את המכסה והפוך את הצלחת בעת הנחתו בחממה.
2. השתמש בלולאת חיסון סטרילית כדי לבחור מושבת חיידקים בודדת מצלחת אגר (המכילה זן חיידקי יחיד) ולחסן צינור תרבית מלא ב-5 מ"ל של חומר LB סטרילי. באמצעות לולאה חדשה בכל פעם, חסנו שני צינורות תרבית נוספים מלאים ב-5 מ"ל של מדיה LB מאותה צלחת.
3. חזור על אותו הליך חיסון עבור זני החיידקים השונים. יש לגדל את התרביות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור בטמפרטורה של 220 סל"ד.
   הערה: כל צלחת אגר המכילה זן חיידקי בודד משמשת לחיסון 3 צינורות תרבית עצמאיים. שלושת הצינורות מייצגים שכפולים ביולוגיים בשלושה עותקים עבור זן אחד ומטופלים כדגימות נפרדות. זה שונה משכפולים טכניים שהיו כרוכים בחילוץ RNA 3 פעמים מצינור תרבית יחיד.
4. הכן דילול של 1:100 של תרביות הלילה על ידי העברת 50 מיקרוליטר של תרבית לילה לתוך צינור תרבית חדש המכיל 4.95 מ"ל של מדיה חדשה של LB.
5. גדל את התרביות המדוללות למשך 3 שעות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-220 סל"ד או עד שה-OD₆₀₀ הוא 0.1 ומעלה. מדוד את צפיפות התאים בספקטרופוטומטר ב-OD₆₀₀.
6. בצינור מיקרופוגה חדש של 1.7 מ"ל, כוונן את ה-OD₆₀₀ ל-0.1 (שלב יומן מוקדם) בנפח כולל של 1.5 מ"ל עם LB טרי.
7. מערבבים בעדינות על ידי היפוך. העבירו 300 מיקרוליטר מכל תרבית מותאמת ל-4 בארות של מגלשת תא של 8 בארות כדי להגיע ל-2 דגימות שונות לכל שקופית (איור 1).
8. הנח את המגלשות, ללא הפרעה, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה למשך 24 שעות. כדי למנוע אידוי, הניחו את השקופיות על גבי מגבת נייר לחה במגש פלסטיק קטן.

2. שחזור ביופילם

הערה: כל מגלשת זכוכית מכילה שמונה בארות נפרדות. דגימה אחת מורכבת מארבע בארות עם ביופילמים שיאוגדו¹⁷. פרוטוקול מיצוי זה מיועד לדגימה אחת (4 בארות) שבה הביופילמים נשאבים מ-2 בארות בכל פעם. מיצוי RNA מבוצע באמצעות ערכת מיצוי RNA מסחרית הכוללת שלב הכאת חרוזים וניקוי מבוסס עמודות, עם שינויים. עקוב אחר הוראות היצרן להכנת ריאגנטים.

1. במכסה זרימה למינרית, הסר לאט את המדיה מ-2 מתוך 4 בארות באמצעות קצה פיפטה. הטה את המגלשה בזווית של 45 מעלות והוציא את המדיה החוצה מהפינה התחתונה של הבארות כדי למנוע ניתוק של הביופילמים.
2. תוך שמירה על המגלשה מוטה, שטפו את תאי הפלנקטון על ידי פיפטינג עדין של 300 מיקרוליטר מים נטולי RNase לפינה התחתונה של שתי הבארות המרוקנות. הסר את המים על ידי פיפטינג בעדינות החוצה, כמתואר בשלב 2.1. חזור על שלב הכביסה והסר כמה שיותר מים.
3. הוסף 300 מיקרוליטר של מגיב הגנת RNA (ראה טבלת חומרים) לכל אחת משתי הבארות המרוקנות עם ביופילמים בבסיסן. הנח את מגלשת התא על צלחת זכוכית כדי למנוע את שבירת הבארות, ולאחר מכן גרד את הביופילמים ב-2 הבארות בעזרת מרית מתכת סטרילית קטנה ונטולת נוקלאז כדי להשעות מחדש את חיידקי הביופילם. הניחו לשבת עד שהביופילמים יתאוששו מ-2 הבארות הנותרות שלא נגעו בהן מאותה דגימה.
   הערה: תוספת של מגיב הגנת RNA מבטיחה את יציבות דגימות הביופילם בבארות המגורדות בטמפרטורת הסביבה תוך עיבוד שתי הבארות הנותרות של אותה דגימה. מגיב הגנת ה-RNA משבית תאים ומנטרל נוקלאזות וגורמים זיהומיים, וכתוצאה מכך משמר את ה-RNA.
4. כדי לשחזר ביופילמים מ-2 הבארות הנותרות עבור דגימה (תזכורת: דגימה אחת מורכבת מ-4 בארות), הסר את מדיית ה-LB מ-2 הבארות החדשות הנותרות באותו אופן כמתואר בשלב 2.1. חזור על שלב 2.2 כדי לשטוף את התאים הפלנקטוניים במים נטולי RNase משתי הבארות החדשות, כמו קודם.
5. חזור לשתי הבארות הראשונות עם ביופילמים מגורדים במגיב הגנה, שנוצר בסוף שלב 2.3, ולאט לאט לערבב את 300 מיקרוליטר של ביופילם מושעה מחדש מבאר אחת מגורדת, בניסיון לא ליצור יותר מדי בועות.
   1. העבירו את כל התכולה מהבאר לאחת הבארות שנשטפו לאחרונה והתרוקנו. מערבבים ומעבירים 300 מיקרוליטר של ביופילם מושעה מחדש מהבאר השנייה שנגרדה בבאר הנותרת, שנשטפה לאחרונה, מרוקנת.
      הערה: במקום להוסיף מגיב הגנת RNA חדש ל-2 הבארות שנשטפו לאחרונה עם ביופילמים, העבירו את הביופילמים שכבר גרדו בעבר לבארות הטריות הללו. זה ישמור על נפח הדגימה המשולב נמוך מספיק כדי לעמוד בדרישות הקלט עבור ערכת מיצוי ה-RNA המסחרית. ראה איור 1 לסכמה.
6. חזור על גירוד הביופילמים בבארות החדשות כמו בשלב 2.3, על ידי הנחת מגלשת התא על צלחת זכוכית וגירוד הביופילמים ב-2 הבארות החדשות עם מרית מתכת סטרילית קטנה ונטולת נוקלאז כדי להשעות מחדש את חיידקי הביופילם.
7. שלב את כל הביופילם המושעה מחדש מ-2 הבארות החדשות לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה יחיד נטול RNase וקשר נמוך בנפח 1.5 מ"ל. מדוד את עוצמת הקול, שצריכה להיות ~500 - 600 מיקרוליטר בסך הכל.
   הערה: תרחיף הביופילם המשולב מזוג הבארות החדשות השני הזה יכיל את כל חומר הביופילם מ-4 הבארות המקוריות של דגימה.

3. בידוד RNA כולל והערכת איכות

הערה: מיצוי RNA מתבצע באמצעות ערכת מיצוי RNA מסחרית המתיימרת לעבוד על ביופילמים. הרכיבים הבודדים כלולים בטבלת החומרים, במידת האפשר. הסברים על המנגנונים מאחורי כל שלב טיהור ניתנים במידת האפשר.

1. הוסף מספיק ריאגנט להגנת RNA כדי לסכם 750 מיקרוליטר בצינור. העבירו את כל הנפח לצינור ליזה מכה חרוזים של 2 מ"ל המכיל חרוזים של 0.1 ו-0.5 מ"מ (ראה טבלת חומרים). מקציפים 2 1/2 דקות במקצף חרוזים במהירות מרבית.
   הערה: השילוב של חרוזים בצפיפות גבוהה של 0.1 מ"מ ו-0.5 מ"מ בתוספת ערבוב מהיר על מקצף חרוזים מבטיח הומוגניזציה יסודית של דפנות התאים המיקרוביאליים.
2. צנטריפוגה ב 16,000 x גרם למשך דקה אחת לכדור החרוזים. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש, תוך מזעור העברת כל החרוזים, מה שיקל על שלב 3.3. מדוד את עוצמת הקול.
3. הוסף נפח שווה של מאגר ליזה RNA (~450 מיקרוליטר) וערבב היטב. העבירו עד 800 מיקרוליטר של דגימה, הימנעו מהעברת חרוזים כלשהם, לעמוד סיליקה בצינור איסוף וצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 30 שניות. שמור את הזרימה מכיוון שהיא מכילה את ה-RNA בזמן שה-DNA קשור לעמודה.
   הערה: מאגר הליזה של RNA מכיל גואנידיניום תיוציאנט ואת חומר הניקוי N-lauroylsarcosine לתאי ליז. גואנידיניום תיוציאנט הוא חומר כאוטרופי שגם משבית נוקלאזות, ובנוכחות סיליקה, שנמצא בעמוד הספין, מקדם את קשירת ה- DNA לסיליקה¹⁸. היעדר אתנול מאפשר קשירה מועדפת של DNA ולא RNA לעמודת ספין הסיליקה¹⁹. מטרת שלב 3.3 היא לקשור ולהסיר DNA גנומי. אנו רוצים לשמור על ה-RNA, הכלול בחלק הזרימה.
4. אם נותרה דגימה נוספת, העבירו את העמודה לצינור איסוף חדש וטענו מחדש עם שאר הדגימה. צנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 30 שניות. שמור על הזרימה עם ה-RNA ושלב עם ה-aliquot הראשון.
5. מדוד את נפח הזרימה המשולב והוסף נפח שווה של 100% אתנול וערבב היטב. העבירו עד 800 מיקרוליטר מהתמיסה לעמודת ספין סיליקה שנייה חדשה בצינור איסוף וצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 30 שניות. השליכו את הזרימה.
   הערה: הוספת אתנול לתמיסת המלח הכאוטרופית המכילה את ה-RNA משפרת את קשירת ה-RNA לעמודת ספין הסיליקה¹⁹.
6. עבור פתרונות > 800 μL, טען מחדש את עמודת הספין והצנטריפוגה עד לסיבוב התמיסה כולה. השליכו את הזרימה לאחר כל סיבוב.
7. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמוד ולצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 30 שניות כדי להסיר חלק מהמלחים. השליכו את הזרימה.
8. הכן את תערובת התגובה של DNase I בהתאם להוראות היצרן ובצע את הטיפול ב-DNase בעמודה כדי להסיר שאריות DNA.
9. השעו מחדש את ה-DNase I הליופילי ב-275 מיקרוליטר של מים נטולי RNase כדי ליצור תמיסה של 1 U/μL. מערבבים על ידי היפוך עדין.
10. שלב 5 מיקרוליטר של DNase I מדולל עם 75 מיקרוליטר של מאגר העיכול של DNase המסופק. מערבבים בעדינות על ידי היפוך.
11. הוסף 80 מיקרוליטר מהתמיסה המוכנה ישירות על מטריצת העמודה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
12. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר הכנת RNA לעמודה ולצנטריפוגה ב-16,000 x g למשך 30 שניות. השליכו את הזרימה.
13. הוסף 700 מיקרוליטר של מאגר שטיפת RNA לעמודה וחזור על הצנטריפוגה. השליכו את הזרימה.
14. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר שטיפת RNA וצנטריפוגה את העמודה למשך 2 דקות כדי להסיר לחלוטין כל מאגר שיורי.
    הערה: ישנם 2 שלבי כביסה שונים להסרת זיהומים על העמוד. מאגר ההכנה מכיל מלח כאוטרופי חלש מעורבב עם אתנול על מנת להסיר שאריות חלבונים. לאחר מכן, מאגר הכביסה משמש לביצוע שטיפות אתנול להסרת מלחים. יש להסיר את כל האתנול שנותר כדי לאפשר פליטה יעילה של ה-RNA^19,20.
15. העבירו בזהירות את העמוד לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בעל קשירה נמוכה.
16. הוסף 50 מיקרוליטר מים נטולי RNase ישירות למטריצת העמודה ודגירה למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך דקה אחת כדי לחסל את ה-RNA.
17. לניקוי נוסף להסרת מעכבי PCR, הנח מסנן מעכב PCR בצינור איסוף חדש. הוסף 600 מיקרוליטר מתמיסת ההכנה למעכב המסופקת (ראה טבלת חומרים).
18. צנטריפוגה ב-8,000 x גרם למשך 3 דקות לשטיפת המסנן. העבירו את המסנן השטוף לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בעל קשירה נמוכה.
19. העבירו את ה-RNA המנומק משלב 3.13 למסנן השטוף, וצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 3 דקות.
    הערה: ניתן להשתמש ב-RNA באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
20. קבע את ריכוז ה-RNA באמצעות מערכת פלואורומטרית ברגישות גבוהה²¹.
    הערה: מערכות אלו מאפשרות כימות רגיש של כמות קטנה של RNA בתמיסה הספציפית ליעד המבוקש.
    1. העריכו את איכות ה-RNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית שיכולה לספק RIN (מספר שלמות RNA), שהוא מדד לאיכות RNA ^22,23.

4. דלדול RNA ריבוזומלי וריצוף תפוקה גבוהה

1. הגש RNA למרכז לניתוח אבולוציה ותפקוד גנום (CAGEF) במרכז הגנום באוניברסיטת טורונטו (טורונטו, קנדה) (https://www.cagef.utoronto.ca/) לדלדול rRNA חיידקי והכנת ספריית RNA כיוונית RNA (ראה טבלת חומרים).
   הערה: דלדול rRNA חיידקי מכוון ל-5S, 16S ו-23S rRNAs להסרה²⁴.
2. לדלל rRNA באמצעות ערכת דלדול חיידקי rRNA מסחרית. עקוב אחר הפרוטוקול להזנת 10 ננוגרם - 1 מיקרוגרם RNA כולל שלם או מפורק חלקית.
3. בנה ספריות ריצוף RNA באמצעות ערכת הכנת ספריית RNA כיוונית עם אינדקסים שונים המצורפים לכל ספרייה.
4. אסוף כמויות שוות ערך של כל ספריית RNA ובצע רצף תפוקה גבוה עם קריאות קצה זוגיות של 100 בסיסים²⁵.

5. הערכת איכות של קריאות רצף

הערה: בדוק את איכות קריאות הרצף באמצעות התוכנית הזמינה בחינם, FastQC²⁶, הזמינה דרך פלטפורמת הקוד הפתוח החינמית, Galaxy²⁷.

1. עבור אל https://usegalaxy.org/. לחץ על תפריט התחברות או הרשמה והיכנס עם אישורים או צור חשבון.
2. לחץ על הקישור העלה נתונים בפינה השמאלית העליונה של הדף, תחת תפריט כלים, והעלה את קבצי הרצף fastq.gz. המתן עד ששמות הקבצים יופיעו בצד ימין של הדף, תחת החלונית History.
3. בחר בקרת איכות FASTQ בתפריט כלים כדי לחשוף רשימה של תוכניות. בחר FastQC, שיאכלס את הפאנל האמצעי של המסך.
4. תחת נתוני קריאה קצרים מההיסטוריה הנוכחית שלך, בחר את קבצי fastq.gz שהועלו מהתפריט הנפתח.
5. בחר Execute כדי להפעיל את התוכנית.
6. הצג את התוצאות בחלונית History (טבלה 2).
   הערה: להוראות מפורטות יותר על אופן השימוש ב-Galaxy, בקרו בדף התמיכה בכתובת https://galaxyproject.org/support/.

6. מיפוי קריאות רצף

הערה: רשום צינור בסיסי לחיתוך מתאם ומיפוי קריאה עבור נתוני RNA-seq. רצפי המתאמים נחתכים מהקריאות באמצעות Trimmomatic²⁸. הקריאות החתוכות ממופות לגנום הייחוס P. aeruginosa PAO1 (NC_002516.2), שהתקבל מ-NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)²⁹באמצעות BWA³⁰ ו-Samtools³¹. לשם הפשטות, זוג קריאות נקרא PA_1.fq ו-PA_2.fq; קובץ הקריאה של המתאם שיש לחתוך נקרא adapter.fa; ורצף הייחוס PAO1 נקרא PAO1.fasta. כל הכלים הם קוד פתוח ופועלים בסביבת UNIX/LINUX. מומלץ בחום להכיר את היסודות של UNIX/LINUX על מנת לבצע פקודות אלה.

1. פתח חלון ב-UNIX/LINUX.
2. התקן את Java, Trimmomatic, BWA ו-Samtools.
3. נווט אל התיקיה שבה נמצא trimmomatic-0.39.jar הקובץ.
4. חתוך את כל רצפי המתאמים מהקריאות על-ידי הקלדת הפקודה:
   Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adapters.fa
   הערה: רק רצפי מתאמים מוסרים. הקריאות לא קוצצו לאיכות³².
5. העבר את קובץ ההפניה PAO1.fasta לאותה תיקיה.
6. צור אינדקס של ההפניה באמצעות BWA עם הפקודה:
   מדד Bwa PA01.fasta
7. מפה את הקריאות הזוגיות לגנום הייחוס על ידי הקלדת 4 הפקודות הבאות. הקלד כל פקודה לאחר סיום הפקודה הקודמת.
   Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
   Samtools view -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
   Samtools sort PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
   אינדקס Samtools PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
8. הצג את סטטיסטיקת המיפוי על-ידי הקלדת הפקודה:
   Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
   הערה: השורה^{השלישית} של הסטטיסטיקה מדווחת על שיעור הקריאות הממופות לגנום הייחוס.
9. חשב את עומק הקריאה הממוצע ואת רוחב הכיסוי עם 2 הפקודות הבאות³³, בהתאמה:
   Samtools עומק -A PA_R1R2_sorted.bam | awk '{C++; s+=$3}END{print s/c}'
   Samtools עומק -A PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) total+=1}END{print (total/c)*100}'

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הסקירה הכללית של השיטה מוצגת באיור 1. בעבר השתמשנו במגלשות עם 8 בארות כדי לגדל ביופילמים של P. aeruginosa ולחשוף אותם לאנטיביוטיקה לפני שבדקנו אותם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בנקודות זמן שונות^12,13. ניתן להשתמש בשיטה זו כד...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

סה"כ RNA מופק בהצלחה מ-17 דגימות ביופילם חיידקיות שונות בשלוש עותקים, ומניב בסך הכל 51 דגימות. ארבעים ותשע ספריות ה-RNA מאוגדות ומרוצפות בהצלחה. בסך הכל, זה מאמת את קריטריוני האיכות שלנו עם שיעור הצלחה של 96% למרות שיותר ממחצית הדגימות נחשבות לשפע נמוך ובאיכות תת-או?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Automated electrophoresis of biomolecules
Agilent RNA 6000 pico kit	Agilent	5067-1513	High sensitivity RNA electrophoresis chip to generate a RIN
DNA/RNA Lysis Buffer	Zymo Research	D7001-1-50	A guanidinium thiocyanate and N-Lauroylsarcosine-based lysis buffer sold as part of a nucleic acid purification kit
DNA/RNA Prep Buffer	Zymo Research	D7010-2-10	A guanidine HCl and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNA/RNA Shield	Zymo Research	R1100-50	DNA and RNA preservation/protection reagent
DNA/RNA Wash Buffer	Zymo Research	D7010-3-6	A salt and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNBSEQ G-400RS	MGI	G-400RS	High throughput sequencer
MGIEasy RNA Directional Library Prep Set	MGI	1000006386	Generate libraries for MGI high-throughput sequencing platforms from total RNA.
Mini-Beadbeater-96	BioSpec	1001	A high energy, high throughput cell disrupter
NEBNext rRNA Depletion Kit (bacteria)	New England Biolabs	E7850X	Efficient and specific depletion of bacterial rRNA (5S, 16S, 23S)
Nunc Lab-Tek II chamber slide system	Thermo Fisher Scientific	154534	8-well chamber slide with removable wells
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33238	Fluorometer for DNA, RNA and proteins
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32852	High sensitivity fluorometric assay to measure RNA concentration
Spin-Away Filters	Zymo Research	C1006-50-F	Silica-based spin column primarily used to bind or remove genomic DNA
Sterile inoculation loops, 1 uL	Sarstedt	86.1567.050	Sterile, disposable inoculation loops for manipulation of microorganisms
ZR BashingBead Lysis tubes	Zymo Research	S6003-50	2 mL tubes containing 0.1 and 0.5 mm bead lysis matrix for homogenizing biological samples
Zymo Spin IIICG Columns	Zymo Research	C1006-50-G	Silica-based spin column for purification of DNA and RNA
Zymo-Spin III-HRC Filters	Zymo Research	C1058-50	Remove inhibitors such as polyphenolic compounds, humic/fulvic acids, tannins, melanin, etc.
Zymobiomics DNA/RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2002	DNA and RNA dual extraction kit
Zymobiomics HRC Prep solution	Zymo Research	D4300-7-30	To be used with Zymo-Spin III-HRC Filters to remove PCR inhibitors