遺伝子発現測定のためのバイオフィルム内緑 膿菌 からのTotal RNAの単離

要約

このプロトコルは、チャンバースライドで成長した 緑膿菌バイオ フィルムからRNAを単離し、ハイスループットシーケンシングを行う方法を提示します。

要約

緑膿菌 は、嚢胞性線維症(CF)患者の気道に感染症を引き起こす日和見性細菌性病原体です。 緑膿菌は 、エキソ多糖のマトリックスによって保護されるバイオフィルムを形成する能力で知られています。このマトリックスにより、微生物は抗生物質治療などの外的要因に対してより回復力を持つことができます。研究用のバイオフィルム成長の最も一般的な方法の1つは、マイクロタイタープレートまたはチャンバースライドです。これらのシステムの利点は、複数の増殖条件を試験できることですが、欠点は、RNA抽出のためのバイオフィルムの生成量が限られていることです。この記事の目的は、ハイスループットシーケンシングに十分な品質と量の少量のバイオフィルムから全RNAを抽出する方法について、詳細なステップバイステップのプロトコルを提供することです。このプロトコルにより、これらのバイオフィルムシステム内での遺伝子発現の研究が可能になります。

概要

嚢胞性線維症(CF)患者の肺感染症やプロテーゼ関連感染症など、ほとんどの慢性細菌感染症は、バイオフィルム内の生物の増殖を特徴としています。バイオフィルム¹ は、主に多糖類²からなるマトリックスに包まれた細菌の群集である。バイオフィルム内の細菌は、成長が遅く、代謝的に休眠しており、嫌気性、低酸素状態にある可能性があります。バイオフィルムは、抗生物質の浸透性の低下、薬物排出ポンプの発現の増加、細胞分裂の減少などの要因により、抗生物質に対してより耐性があります³。これらの理由やその他の理由から、それらは非常に研究上の関心を集めています。

CF患者における慢性緑膿菌感染症などの持続性感染症を正確に研究するためには、バイオフィルム形成に見られる成長条件をin vitroで正確に反映する必要があります。一般的なハイスループットな方法は、チャンバースライドやマイクロタイタープレートでそれらを成長させ、共焦点顕微鏡⁴でバイオフィルム形成をモニターすることです。プランクトン性または自由浮遊性からバイオフィルム細菌生活への移行における主要な調節因子は、二次メッセンジャーである環状ジ^GMP5であることが知られています。サイクリックジGMPレベルが増加すると、バイオフィルムの成長を促進する特定の遺伝子の発現が増加します。また、低分子のノンコーディング制御RNAやクオラムセンシングも、バイオフィルム形成の制御に重要な役割を果たしています⁵。抽出された細菌RNAのシーケンシングによるバイオフィルム遺伝子発現の測定は困難な場合があります。例えば、P. aeruginosaは、3つのエキソ多糖類(Psl、Pelおよびアルギン酸塩)を産生し、これらはバイオフィルム^6,7において大量に産生される。これらの多糖類は、RNAの抽出と精製を妨害し、低レベルの細菌^mRNA8を含む不純な調製物につながる可能性があります。市販のRNA抽出キットは、プランクトン性細菌培養物から高品質のRNAを産生することができるが、バイオフィルム培養物ではうまく機能しない可能性がある^9,10,11。バイオフィルムに効くと謳っている市販のRNA抽出キットがいくつかあり、そのうちの1つをこの方法で使用しています。

この原稿では、チャンバスライドで緑膿菌のバイオフィルムを増殖させ、ハイスループットシーケンシング^12,13のための細菌mRNAを抽出する手順について説明します。CF患者の喀痰サンプルから採取した臨床分離株を利用して、これらの方法がさまざまな成長特性を持つ分離株に使用できることを実証します。以前の出版物と比較して、このプロトコルは、細菌のバイオフィルム遺伝子発現^11,14,15,16の研究においてより良い成功を可能にするために詳細に説明されています。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

研究倫理委員会(REB)は、ヒト被験者からの喀痰サンプルの収集と処理に必要です。この研究は、Hospital for Sick Children(REB#1000019444)によって承認されました。研究倫理委員会(REB)は、ヒトを対象とする喀痰サンプルを収集し、保存することが義務付けられています。これらの研究は、Hospital for Sick Children REB#1000058579によって承認されました。

1.バイオフィルム形成

1. この研究で使用したCF患者の喀痰サンプルから得られた 緑膿菌 分離株を、37°Cのインキュベーター内のLuria Broth(LB)寒天プレートで一晩育てます。
   注:適切なストリーキング技術は、単一の細菌コロニーを得るために重要です。プレートを回転させながらストリーキングをすると、バクテリア細胞が十分に希釈され、単一のコロニーが成長できるようになります。
   1. 新鮮なLBプレートの上端にジグザグパターンの接種ループを使用して、プレートの約1/4が覆われるまでストリークバクテリア。
   2. プレートを約60°回転させます。新しい接種ループを取り、それを縞模様の領域に一度通し、プレートの2番目のきれいな領域に通し、ジグザグパターンを繰り返します。
   3. 手順1.1.2を繰り返し、プレートの3番目の領域に新しいループを入れます。インキュベーターに入れるときは、蓋を元に戻し、プレートを反転させます。
2. 滅菌接種ループを使用して、寒天プレート(単一の細菌株を含む)から単一の細菌コロニーを取り出し、5 mLの滅菌LB培地を充填した培養チューブに接種します。毎回新しいループを使用して、同じプレートから5 mLのLB培地を充填した2本の培養チューブを追加で接種します。
3. 異なる細菌株に対して同じ接種手順を繰り返します。培養物を37°Cで一晩培養し、220RPMで振とうします。
   注:1つの細菌株を含む各寒天プレートは、3つの独立した培養チューブを接種するために使用されます。3本のチューブは、1つの菌株の生物学的複製を三重に表し、別々のサンプルとして扱われます。これは、1本の培養チューブからRNAを3回抽出するテクニカルリピートとは異なります。
4. 50 μLのオーバーナイトカルチャーを4.95 mLの新しいLB培地を含む新しい培養チューブに移すことにより、オーバーナイト培養液を1:100希釈液で調製します。
5. 希釈した培養物を37°Cでさらに3時間、220 RPMで振とうするか、OD₆₀₀ が0.1以上になるまで培養します。OD₆₀₀の分光光度計で細胞密度を測定します。
6. 新しい1.7 mLマイクロチューブで、OD₆₀₀ を0.1(初期対数期)に調整し、新鮮なLBで総容量1.5 mLにします。
7. 反転させてやさしく混ぜます。調整した各培養物300μLを8ウェルチャンバースライドの4ウェルに移し、スライドごとに2つの異なるサンプルが得られます(図1)。
8. スライドをそのまま、37°Cのインキュベーターに24時間一晩置きます。蒸発を防ぐために、広告の上にスライドを置きますamp 小さなプラスチックトレイのペーパータオル。

2. バイオフィルムの回復

注:各スライドガラスには、8つの別々のウェルが含まれています。1つのサンプルは、プールされるバイオフィルムを備えた4つのウェルで構成されています¹⁷。この抽出プロトコルは、1つのサンプル(4つのウェル)を対象としており、バイオフィルムは一度に2つのウェルから回収されます。RNA抽出は、ビーズビーティングステップとカラムベースのクリーンアップを含む市販のRNA抽出キットを使用して実行されます。試薬の調製については、製造元の指示に従ってください。

1. 層流フードで、ピペットチップを使用して、4つのウェルのうち2つからメディアをゆっくりと取り出します。スライドを45°の角度で傾け、バイオフィルムの剥離を防ぐために、ウェルの下部の角から培地をピペットで取り出します。
2. スライドを傾けたまま、空になった2つのウェルの底隅に300 μLのRNaseを含まない水を静かにピペッティングして、プランクトン細胞を洗い流します。手順2.1で説明したように、水を静かにピペッティングして水を取り除きます。できるだけ多くの水を取り除き、洗浄手順を繰り返します。
3. 300 μLのRNA保護試薬( 材料表を参照)を、バイオフィルムを基部に持つ2つの空になったウェルのそれぞれに加えます。チャンバースライドをガラス板に載せてウェルが壊れないようにし、2つのウェルのバイオフィルムをヌクレアーゼフリーの滅菌金属ヘラでこすり落とし、バイオフィルム細菌を再懸濁します。バイオフィルムが同じサンプルから残っている2つの手つかずのウェルから回収されるまで、座ってみましょう。
   注:RNA保護試薬を添加すると、同じサンプルの残りの2つのウェルを処理しながら、掻き取ったウェル内のバイオフィルムサンプルの周囲温度での安定性が保証されます。RNA保護試薬は、細胞を溶解し、ヌクレアーゼや感染性病原体を不活性化することで、RNAの保存につながります。
4. サンプルの残りの 2 つのウェルからバイオフィルムを回収するには (注意: 1 つのサンプルは 4 つのウェルで構成されています)、ステップ 2.1 で説明したのと同じ方法で、残りの 2 つの新しいウェルから LB メディアを取り出します。ステップ2.2を繰り返して、以前と同様に、両方の新しいウェルからRNaseを含まない水でプランクトン細胞を洗い流します。
5. ステップ2.3の最後に生成された保護試薬に掻き取りされたバイオフィルムがある最初の2つのウェルに戻り、掻き取った 1つの ウェルから300μLの再懸濁バイオフィルムをゆっくりとピペットで混合し、気泡が多すぎないようにします。
   1. ウェルからすべての内容物を、新しく洗浄して空にしたウェルの 1つ に移します。2番目に掻き取ったウェルから再懸濁したバイオフィルム300μLを、残りのウェルに新たに洗浄し、空にしたバイオフィルムに混合して移します。
      注:バイオフィルムで新たに洗浄した2つのウェルに新しいRNA保護試薬を追加する代わりに、すでに保護試薬に掻き取ったバイオフィルムをこれらの新しく洗浄したウェルに移します。これにより、組み合わせたサンプル量を十分に低く抑え、市販のRNA抽出キットのインプット要件を満たすことができます。図 1 の概略図を参照してください。
6. ステップ2.3と同様に、チャンバースライドをガラス板に置き、ヌクレアーゼフリーの滅菌金属ヘラで2つの新しいウェルのバイオフィルムを掻き取り、バイオフィルム細菌を再懸濁することにより、新しいウェルのバイオフィルムのスクレイピングを繰り返します。
7. 2つの新しいウェルから再懸濁した バイオフィルムをすべて 、RNaseフリーで低結合の1.5 mLマイクロ遠心チューブに結合します。容量を測定します(合計で~500 - 600 μL)。
   注:この2番目の新しいウェルのペアから結合されたバイオフィルム懸濁液には、サンプルの元の4つのウェルからのすべてのバイオフィルム材料が含まれます。

3. Total RNAの単離と品質評価

注:RNA抽出は、バイオフィルムに効くと主張する市販のRNA抽出キットを使用して行われます。個々のコンポーネントは、可能であれば 、材料表に含まれています。各精製ステップの背後にあるメカニズムについては、可能な限り説明します。

1. チューブ内に合計750μLのRNA保護試薬を十分に加えます。0.1 mmおよび0.5 mmのビーズが入った2 mLのビーズビート溶解チューブに全容量を移します( 材料の表を参照)。ビーズビーターで最高速度で2分半叩きます。
   注:0.1 mmと0.5 mmの高密度ビーズの組み合わせとビーズビーターでの高速混合により、微生物細胞壁の徹底的な均質化が保証されます。
2. 16,000 x g で1分間遠心分離し、ビーズをペレット化します。上清を新しい微量遠心チューブに移し、ビーズの移し替えを最小限に抑えます。これにより、ステップ3.3が容易になります。音量を測定します。
3. 等量のRNA溶解バッファー(~450 μL)を添加し、よく混合します。ビーズの移し替えを避けながら、最大800 μLのサンプルをコレクションチューブ内のシリカカラムに移し、16,000 x g で30秒間遠心分離します。フロースルーにはRNAが含まれており、DNAはカラムに結合しているため、フロースルーを保存します。
   注:RNA溶解バッファーには、細胞を溶解するためのチオシアン酸グアニジンと界面活性剤N-ラウロイルサルコシンが含まれています。チオシアン酸グアニジニウムは、ヌクレアーゼを不活性化し、スピンカラムに見られるシリカの存在下で、DNAのシリカへの結合を促進するカオトロピック剤^である18。エタノールの不在は、シリカスピンカラム¹⁹へのRNAではなくDNAの優先的な結合を可能にする。ステップ3.3の目的は、ゲノムDNAを結合して除去することです。フロースルー部分に含まれるRNAを保持したいのです。
4. さらにサンプルが残っている場合は、カラムを新しい収集チューブに移し、残りのサンプルと一緒に再ロードします。16,000 x g で30秒間遠心分離します。RNAとのフロースルーを維持し、最初のアリコートと結合します。
5. 複合フロースルー体積を測定し、等量の100%エタノールを加えてよく混合します。最大800 μLの溶液をコレクションチューブ内の新しい2番目のシリカスピンカラムに移し、16,000 x g で30秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
   注:RNAを含有するカオトロピック塩溶液へのエタノールの添加は、シリカスピンカラム¹⁹へのRNAの結合を増強する。
6. 800 μL>溶液の場合は、スピンカラムを再ロードし、溶液全体が遠心分離されるまで遠心分離します。各スピンの後にフロースルーを捨てます。
7. 400 μL の洗浄バッファーをカラムに加え、16,000 x g で 30 秒間遠心分離して、一部の塩分を除去します。フロースルーを破棄します。
8. DNase I反応混合物を製造元の指示に従って調製し、インカラムDNase処理を実施して残留DNAを除去します。
9. 凍結乾燥したDNase Iを275 μLのRNaseフリー水に再懸濁して、1 U/μL溶液を作ります。穏やかに反転させて混ぜます。
10. 希釈したDNase I5 μLと付属のDNase消化バッファー75 μLを組み合わせます。反転させてやさしく混ぜます。
11. 調製した溶液80 μLをカラムマトリックスに直接加えます。室温で20分間インキュベートします。
12. 400 μL の RNA 調製バッファーをカラムに加え、16,000 x g で 30 秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
13. 700 μL の RNA 洗浄バッファーをカラムに加え、遠心分離を繰り返します。フロースルーを破棄します。
14. 400 μL の RNA 洗浄バッファーを添加し、カラムを 2 分間遠心分離して、残留バッファーを完全に除去します。
    注:カラムの不純物を除去するには、2つの異なる洗浄ステップがあります。調製バッファーには、残留タンパク質を除去するために、エタノールと混合した弱なカオトロピック塩が含まれています。次に、洗浄バッファーを使用して、塩分を除去するためのエタノール洗浄を行います。RNA19,20の効率的な溶出を可能にするために、残っているエタノールを除去する必要があります。
15. カラムを新しい低結合の微量遠心チューブに慎重に移します。
16. 50 μL の RNase フリー水を直接カラムマトリックスに加え、5 分間インキュベートします。16,000 x gで1分間遠心分離し、RNAを溶出します。
17. PCR阻害剤を除去するための追加のクリーンアップを行うには、PCR阻害剤フィルターを新しい収集チューブに入れます。付属の阻害剤調製液600 μLを加えます( 材料表を参照)。
18. 8,000 x gで3分間遠心分離し、フィルターを洗浄します。洗浄したフィルターを新しい低結合微量遠心チューブに移します。
19. ステップ3.13で溶出したRNAを洗浄したフィルターに移し、16,000 x gで3分間遠心分離します。
    注:RNAはすぐに使用することも、-80°Cで保存することもできます。
20. 高感度蛍光測定システム²¹を用いてRNAの濃度を決定する。
    注:これらのシステムでは、目的のターゲットに特異的な溶液中の少量のRNAを高感度に定量できます。
    1. RNAの品質の尺度であるRIN(RNA完全性番号)を提供できる自動電気泳動システムを使用して、RNAの品質を評価します^22,23。

4. リボソームRNAの枯渇とハイスループットシーケンシング

1. トロント大学(カナダ、トロント)のCentre for the Analysis of Genome Evolution and Function(CAGEF)ゲノムセンター(https://www.cagef.utoronto.ca/)にRNAを登録し、細菌のrRNAの枯渇とRNA指向性ライブラリーの調製を行います(資料表を参照)。
   注:細菌のrRNAの枯渇は、5S、16S、および23SのrRNAを標的とし、除去されます²⁴。
2. 市販のrRNA細菌枯渇キットを使用してrRNAを枯渇させます。10 ng - 1 μgの無傷または部分的に分解された全RNAを入力するためのプロトコルに従ってください。
3. 各ライブラリに異なるインデックスが付加されたRNA指向性ライブラリ調製キットを使用して、RNAシーケンシングライブラリを構築します。
4. 各RNAライブラリーの等モル量をプールし、100塩基対末端リード²⁵でハイスループットシーケンシングを実行する。

5. シーケンシングリードの品質評価

注:無料のオープンソースプラットフォームであるGalaxy²⁷から入手できる無料のプログラムFastQC²⁶を使用して、シーケンシングリードの品質を確認してください。

1. https://usegalaxy.org/ に移動します。[ログイン]または[登録 ]メニューをクリックし、資格情報でログインするか、アカウントを作成します。
2. ページの左上にある[ツール]メニューの下にある[ データのアップロード ]リンクをクリックし、fastq.gzシーケンシングファイルをアップロードします。ファイル名がページ右側の[履歴]パネルの下に表示されるのを待ちます。
3. [ツール]メニューの[FASTQ品質管理]を選択して、プログラムのリストを表示します。FastQCを選択すると、画面の中央パネルに表示されます。
4. [ 現在の履歴からデータを読み取る] で、プルダウン メニューからアップロードした fastq.gz ファイルを選択します。
5. [実行] を選択してプログラムを実行します。
6. [History]パネルで結果を表示します(表2)。
   注:Galaxyの使用方法の詳細については、https://galaxyproject.org/support/ のサポートページを参照してください。

6. シーケンシングリードのマッピング

注:リストされているのは、RNA-seqデータのアダプタートリミングとリードマッピングの基本的なパイプラインです。アダプターシーケンスは、Trimmomatic²⁸を使用してリードからトリミングされます。トリミングされたリードは、BWA³⁰およびSamtools³¹を使用してNCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)²⁹から得られた緑膿菌PAO1参照ゲノム(NC_002516.2)にマッピングされます。わかりやすくするために、読み取りのペアは PA_1.fq と PA_2.fq と呼ばれます。トリミングされるアダプタ読み取りファイルの名前は adapter.fa;PAO1 参照配列は PAO1.fasta と呼ばれます。すべてのツールはオープンソースであり、UNIX / LINUX環境で実行されます。これらのコマンドを実行するには、UNIX/LINUX の基本をよく理解しておくことを強くお勧めします。

1. UNIX/LINUXでウィンドウを開きます。
2. Java、Trimmomatic、BWA、Samtoolsをインストールします。
3. ファイルtrimmomatic-0.39.jarが存在するフォルダに移動します。
4. 次のコマンドを入力して、読み取りからアダプター シーケンスをトリミングします。
   Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adapters.fa
   注: アダプター シーケンスのみが削除されます。読み取りは品質³² のためにトリミングされていません。
5. PAO1.fasta 参照ファイルを同じフォルダに移動します。
6. 次のコマンドで、BWA を使用して参照のインデックスを作成します。
   BwaインデックスPA01.fasta
7. ペアの読み取りを参照ゲノムにマッピングするには、次の 4 つのコマンドを入力します。前のコマンドが終了した後に、各コマンドを入力します。
   Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
   サムツールズビュー -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
   サムツール ソート PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
   SamtoolsインデックスPA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
8. マッピング統計を表示するには、次のコマンドを入力します。
   Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
   注:統計の^3行目 は、参照ゲノムにマッピングされるリードの割合を報告します。
9. 平均読み取り深度とカバレッジの幅を、それぞれ以下の2つのコマンド³³で計算する。
   samtools depth -a PA_R1R2_sorted.bam |awk '{c ++;s+=$3}END{print s/c}'
   samtools depth -a PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam |awk '{c++; if($3>0) total+=1}END{print (total/c)*100}'

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

このメソッドの一般的な概要を図 1 に示します。我々は以前、8ウェルチャンバースライドを使用して緑膿菌のバイオフィルムを増殖させ、それらを抗生物質に曝露した後、異なる時点で共焦点顕微鏡でそれらを調べていた^12,13。この方法は、このシステムで成長したバイオフィルムから直接ト?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

17種類の細菌バイオフィルムサンプルからトータルRNAを三重に抽出し、合計51のサンプルが得られます。49のRNAライブラリーがプールされ、成功裏に配列決定されました。全体として、これは、サンプルの半分以上が存在量が少なく、最適ではない品質であると考えられているにもかかわらず、96%の成功率で私たちの品質基準を検証しています34,35,36,37。^<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Automated electrophoresis of biomolecules
Agilent RNA 6000 pico kit	Agilent	5067-1513	High sensitivity RNA electrophoresis chip to generate a RIN
DNA/RNA Lysis Buffer	Zymo Research	D7001-1-50	A guanidinium thiocyanate and N-Lauroylsarcosine-based lysis buffer sold as part of a nucleic acid purification kit
DNA/RNA Prep Buffer	Zymo Research	D7010-2-10	A guanidine HCl and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNA/RNA Shield	Zymo Research	R1100-50	DNA and RNA preservation/protection reagent
DNA/RNA Wash Buffer	Zymo Research	D7010-3-6	A salt and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNBSEQ G-400RS	MGI	G-400RS	High throughput sequencer
MGIEasy RNA Directional Library Prep Set	MGI	1000006386	Generate libraries for MGI high-throughput sequencing platforms from total RNA.
Mini-Beadbeater-96	BioSpec	1001	A high energy, high throughput cell disrupter
NEBNext rRNA Depletion Kit (bacteria)	New England Biolabs	E7850X	Efficient and specific depletion of bacterial rRNA (5S, 16S, 23S)
Nunc Lab-Tek II chamber slide system	Thermo Fisher Scientific	154534	8-well chamber slide with removable wells
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33238	Fluorometer for DNA, RNA and proteins
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32852	High sensitivity fluorometric assay to measure RNA concentration
Spin-Away Filters	Zymo Research	C1006-50-F	Silica-based spin column primarily used to bind or remove genomic DNA
Sterile inoculation loops, 1 uL	Sarstedt	86.1567.050	Sterile, disposable inoculation loops for manipulation of microorganisms
ZR BashingBead Lysis tubes	Zymo Research	S6003-50	2 mL tubes containing 0.1 and 0.5 mm bead lysis matrix for homogenizing biological samples
Zymo Spin IIICG Columns	Zymo Research	C1006-50-G	Silica-based spin column for purification of DNA and RNA
Zymo-Spin III-HRC Filters	Zymo Research	C1058-50	Remove inhibitors such as polyphenolic compounds, humic/fulvic acids, tannins, melanin, etc.
Zymobiomics DNA/RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2002	DNA and RNA dual extraction kit
Zymobiomics HRC Prep solution	Zymo Research	D4300-7-30	To be used with Zymo-Spin III-HRC Filters to remove PCR inhibitors