Isolierung von Gesamt-RNA aus Pseudomonas aeruginosa in Biofilmen zur Messung der Genexpression

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Isolierung von RNA aus Pseudomonas aeruginosa-Biofilmen vor, die in Kammerobjektträgern für die Hochdurchsatzsequenzierung gezüchtet wurden.

Zusammenfassung

Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer bakterieller Krankheitserreger, der Infektionen in den Atemwegen von Mukoviszidose-Patienten (CF) verursacht. P. aeruginosa ist bekannt für seine Fähigkeit, Biofilme zu bilden, die durch eine Matrix aus Exopolysacchariden geschützt sind. Diese Matrix ermöglicht es den Mikroorganismen, widerstandsfähiger gegen äußere Faktoren, einschließlich einer Antibiotikabehandlung, zu sein. Eine der gebräuchlichsten Methoden des Biofilmwachstums für die Forschung ist die Herstellung von Mikrotiterplatten oder Kammerobjektträgern. Der Vorteil dieser Systeme besteht darin, dass sie die Prüfung mehrerer Wachstumsbedingungen ermöglichen, aber ihr Nachteil ist, dass sie nur begrenzte Mengen an Biofilm für die RNA-Extraktion produzieren. Der Zweck dieses Artikels ist es, ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zu erstellen, wie Gesamt-RNA aus kleinen Mengen Biofilm von ausreichender Qualität und Quantität für die Hochdurchsatz-Sequenzierung extrahiert werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Genexpression innerhalb dieser Biofilmsysteme.

Einleitung

Die meisten chronischen bakteriellen Infektionen, wie z. B. Lungeninfektionen bei Mukoviszidose-Patienten (CF) und Protheseninfektionen, sind durch das Wachstum von Organismen in Biofilmen gekennzeichnet. Biofilme¹ sind Gemeinschaften von Bakterien, die in einer Matrix eingeschlossen sind, die hauptsächlich aus Polysacchariden² besteht. Bakterien in Biofilmen können langsam wachsen, metabolisch inaktiv sein und sich unter anaeroben, hypoxischen Bedingungen befinden. Biofilme sind resistenter gegen Antibiotika, was auf Faktoren wie eine verringerte Antibiotikapenetration, eine erhöhte Expression von Arzneimittelausflusspumpen und eine verminderte Zellteilung^{zurückzuführen ist 3}. Aus diesen und anderen Gründen sind sie von großem Forschungsinteresse.

Um persistierende Infektionen wie chronische Pseudomonas aeruginosa-Infektionen bei CF-Patienten genau untersuchen zu können, müssen die Wachstumsbedingungen, die bei der Biofilmbildung beobachtet werden, in vitro genau wiedergegeben werden. Eine gängige Methode mit hohem Durchsatz besteht darin, sie in Kammerobjektträgern oder Mikrotiterplatten zu züchten und die Biofilmbildung durch konfokale Mikroskopie^{zu überwachen 4}. Es ist bekannt, dass ein wichtiger Regulator beim Übergang von einer planktonischen oder freischwebenden zu einer biofilmbakteriellen Lebensweise der sekundäre Botenstoff cyclic-di-GMP⁵ ist. Erhöhte cyclische di-GMP-Spiegel erhöhen die Expression spezifischer Gene, die das Wachstum von Biofilmen fördern. Kleine nicht-kodierende regulatorische RNAs und Quorum Sensing spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Regulation der Biofilmbildung⁵. Die Messung der Biofilm-Genexpression durch Sequenzierung extrahierter bakterieller RNA kann eine Herausforderung darstellen. P. aeruginosa beispielsweise produziert drei Exopolysaccharide (Psl, Pel und Alginat), die in signifikanten Mengen in Biofilmen produziert werden ^6,7. Diese Polysaccharide können die RNA-Extraktion und -Reinigung beeinträchtigen, was zu unreinen Präparaten führt, die einen geringen Gehalt an bakterieller mRNA^{enthalten 8}. Kommerziell erhältliche RNA-Extraktionskits sind in der Lage, hochwertige RNA aus planktonischen Bakterienkulturen herzustellen, funktionieren aber möglicherweise nicht so gut mit Biofilmkulturen ^9,10,11. Es gibt einige kommerzielle RNA-Extraktionskits, die behaupten, für Biofilme zu funktionieren, von denen wir eines mit dieser Methode verwenden.

In diesem Manuskript beschreiben wir die Verfahren zur Züchtung von P. aeruginosa-Biofilmen in Objektträgern und zur Extraktion bakterieller mRNA für die Hochdurchsatzsequenzierung^12,13. Anhand klinischer Isolate, die aus Sputumproben von CF-Patienten entnommen wurden, zeigen wir, dass diese Methoden für Isolate mit unterschiedlichen Wachstumseigenschaften verwendet werden können. Im Vergleich zu früheren Veröffentlichungen wird dieses Protokoll detailliert beschrieben, um einen besseren Erfolg bei der Untersuchung der Genexpression von bakteriellen Biofilmen zu ermöglichen 11,14,15,16.

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Protokoll

Das Research Ethics Board (REB) ist für die Entnahme und Verarbeitung von Sputumproben von menschlichen Probanden erforderlich. Diese Studie wurde vom Hospital for Sick Children (REB#1000019444) genehmigt. Das Research Ethics Board (REB) ist verpflichtet, Sputumproben von menschlichen Probanden zu sammeln und zu lagern. Diese Studien wurden vom Krankenhaus für kranke Kinder REB#1000058579 genehmigt.

1. Bildung von Biofilmen

1. Pseudomonas aeruginosa-Isolate aus den Sputumproben von CF-Patienten, die in dieser Studie verwendet wurden, auf Agarplatten aus Luria-Bouillon (LB) in einem 37 °C heißen Inkubator über Nacht züchten.
   HINWEIS: Die richtige Streifentechnik ist wichtig, um einzelne Bakterienkolonien zu erhalten. Durch das Drehen der Platte werden die Bakterienzellen ausreichend verdünnt, so dass einzelne Kolonien wachsen können.
   1. Streifen Sie die Bakterien mit einer Impfschlaufe in einem Zick-Zack-Muster am oberen Ende einer frischen LB-Platte, bis etwa 1/4 der Platte bedeckt ist.
   2. Drehen Sie die Platte um ca. 60°. Nehmen Sie eine neue Impfschlaufe und führen Sie sie einmal durch den gestreiften Bereich und in einen zweiten, sauberen Bereich der Platte, wobei Sie das Zick-Zack-Muster wiederholen.
   3. Wiederholen Sie Schritt 1.1.2 mit einer frischen Schlaufe in einen dritten Bereich der Platte. Setzen Sie den Deckel wieder auf und drehen Sie die Platte um, wenn Sie sie in den Inkubator stellen.
2. Verwenden Sie eine sterile Impfschlaufe, um eine einzelne Bakterienkolonie aus einer Agarplatte (die einen einzelnen Bakterienstamm enthält) zu entnehmen, und inokulieren Sie ein Kulturröhrchen, das mit 5 ml sterilem LB-Medium gefüllt ist. Beimpfen Sie jedes Mal eine neue Schlaufe mit zwei zusätzlichen Kulturröhrchen, die mit 5 mL LB-Medien von derselben Platte gefüllt sind.
3. Wiederholen Sie den gleichen Impfvorgang für die verschiedenen Bakterienstämme. Züchten Sie die Kulturen über Nacht bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 220 U/min.
   HINWEIS: Jede Agarplatte, die einen einzelnen Bakterienstamm enthält, wird zur Beimpfung von 3 unabhängigen Kulturröhrchen verwendet. Die drei Röhrchen stellen biologische Replikate in dreifacher Ausfertigung für einen Stamm dar und werden als separate Proben behandelt. Dies unterscheidet sich von technischen Replikaten, bei denen RNA 3 Mal aus einem einzigen Kulturröhrchen extrahiert werden müsste.
4. Bereiten Sie 1:100-Verdünnungen der Übernachtkulturen vor, indem Sie 50 μl einer Übernachtkultur in ein neues Kulturröhrchen mit 4,95 ml neuem LB-Medium überführen.
5. Wachsen Sie die verdünnten Kulturen weitere 3 Stunden bei 37 °C unter Schütteln bei 220 U/min oder bis der OD₆₀₀ 0,1 oder höher ist. Messen Sie die Zelldichten mit einem Spektralphotometer bei OD₆₀₀.
6. In einem neuen 1,7-ml-Mikrofugenröhrchen stellen Sie den OD₆₀₀ auf 0,1 (frühe logarithmische Phase) in einem Gesamtvolumen von 1,5 mL mit frischem LB ein.
7. Vorsichtig durch Inversion mischen. Übertragen Sie 300 μl jeder angepassten Kultur in 4 Vertiefungen eines 8-Well-Kammerobjektträgers, um am Ende 2 verschiedene Proben pro Objektträger zu erhalten (Abbildung 1).
8. Legen Sie die Objektträger ungestört über Nacht für 24 Stunden in einen 37 °C heißen Inkubator. Um Verdunstung zu verhindern, legen Sie die Objektträger auf ein feuchtes Papiertuch in eine kleine Plastikschale.

2. Rückgewinnung von Biofilmen

HINWEIS: Jeder Objektträger enthält acht separate Vertiefungen. Eine einzelne Probe besteht aus vier Vertiefungen mit Biofilmen, die^{gepoolt werden 17}. Dieses Extraktionsprotokoll gilt für 1 Probe (4 Vertiefungen), bei denen die Biofilme aus jeweils 2 Vertiefungen gewonnen werden. RNA-Extraktionen werden mit einem kommerziellen RNA-Extraktionskit durchgeführt, das einen Schritt zum Verschlagen von Kügelchen und eine säulenbasierte Reinigung mit Modifikationen umfasst. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Herstellung des Reagenzes.

1. Entfernen Sie in einer Laminar-Flow-Haube das Medium langsam mit einer Pipettenspitze aus 2 von 4 Vertiefungen. Kippen Sie den Objektträger in einem Winkel von 45° und pipetieren Sie das Medium aus der unteren Ecke der Wells, um ein Ablösen der Biofilme zu verhindern.
2. Halten Sie den Objektträger gekippt und waschen Sie die Planktonzellen ab, indem Sie vorsichtig 300 μl RNase-freies Wasser in die untere Ecke der beiden geleerten Vertiefungen pipettieren. Entfernen Sie das Wasser, indem Sie es vorsichtig herauspipettieren, wie in Schritt 2.1 beschrieben. Wiederholen Sie den Waschschritt und entfernen Sie so viel Wasser wie möglich.
3. Geben Sie 300 μl eines RNA-Schutzreagenzes (siehe Materialtabelle) in jede der beiden entleerten Vertiefungen mit Biofilmen an der Basis. Legen Sie den Kammerschieber auf eine Glasplatte, um ein Brechen der Vertiefungen zu verhindern, und kratzen Sie dann die Biofilme in den 2 Vertiefungen mit einem kleinen, nukleasefreien, sterilen Metallspatel ab, um die Biofilmbakterien wieder zu suspendieren. Lassen Sie es ruhen, bis die Biofilme aus den 2 verbleibenden unberührten Vertiefungen derselben Probe gewonnen wurden.
   HINWEIS: Die Zugabe eines RNA-Schutzreagenzes gewährleistet die Stabilität der Biofilmproben in den abgeschabten Wells bei Umgebungstemperatur, während die verbleibenden zwei Wells derselben Probe verarbeitet werden. Das RNA-Schutzreagenz lysiert Zellen und inaktiviert Nukleasen und Infektionserreger, was zu einer Konservierung der RNA führt.
4. Um Biofilme aus den verbleibenden 2 Vertiefungen für eine Probe zu gewinnen (zur Erinnerung: Eine Probe besteht aus 4 Vertiefungen), entfernen Sie das LB-Medium aus den 2 verbleibenden neuen Vertiefungen auf die gleiche Weise wie in Schritt 2.1 beschrieben. Wiederholen Sie Schritt 2.2, um die Planktonzellen wie zuvor mit RNase-freiem Wasser aus beiden neuen Vertiefungen abzuwaschen.
5. Gehen Sie zurück zu den ersten 2 Vertiefungen mit den abgekratzten Biofilmen im Schutzreagenz, die am Ende von Schritt 2.3 erzeugt wurden, und pipettieren Sie langsam, um die 300 μl des resuspendierten Biofilms aus einer abgekratzten Vertiefung zu mischen, wobei Sie versuchen, nicht zu viele Blasen zu erzeugen.
   1. Füllen Sie den gesamten Inhalt aus der Vertiefung in eine der frisch gewaschenen, geleerten Vertiefungen. Mischen Sie und übertragen Sie 300 μl resuspendierten Biofilm aus der zweiten Mulde in die verbleibende, frisch gewaschene und entleerte Mulde.
      HINWEIS: Anstatt den 2 neu gewaschenen Vertiefungen mit Biofilmen neues RNA-Schutzreagenz hinzuzufügen, übertragen Sie die zuvor abgekratzten Biofilme, die sich bereits im Schutzreagenz befinden, in diese frisch gewaschenen Vertiefungen. Dadurch wird das kombinierte Probenvolumen klein genug gehalten, um die Eingabeanforderungen für das kommerzielle RNA-Extraktionskit zu erfüllen. In Abbildung 1 finden Sie ein Schema.
6. Wiederholen Sie das Schaben der Biofilme in den neuen Vertiefungen wie in Schritt 2.3, indem Sie den Kammerobjektträger auf eine Glasplatte legen und die Biofilme in den 2 neuen Vertiefungen mit einem kleinen, nukleasefreien, sterilen Metallspatel abkratzen, um die Biofilmbakterien wieder zu suspendieren.
7. Kombinieren Sie den gesamten resuspendierten Biofilm aus den 2 neuen Wells in einem einzigen RNase-freien, 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung. Messen Sie das Volumen, das insgesamt ~500 - 600 μl betragen sollte.
   HINWEIS: Die kombinierte Biofilmsuspension aus diesem zweiten Paar neuer Vertiefungen enthält das gesamte Biofilmmaterial aus den ursprünglichen 4 Vertiefungen einer Probe.

3. Vollständige RNA-Isolierung und Qualitätsbewertung

HINWEIS: Die RNA-Extraktion wird mit einem kommerziellen RNA-Extraktionskit durchgeführt, das angeblich auf Biofilmen funktioniert. Die einzelnen Komponenten werden, wenn möglich, in die Werkstofftabelle aufgenommen. Wenn möglich, werden die Mechanismen hinter den einzelnen Reinigungsschritten erläutert.

1. Fügen Sie genügend RNA-Schutzreagenz hinzu, um insgesamt 750 μl in das Röhrchen zu geben. Übertragen Sie das gesamte Volumen in ein 2-ml-Bead-Beating-Lyseröhrchen mit 0,1 und 0,5 mm Kügelchen (siehe Materialtabelle). 2 1/2 min in einem Rührbesen bei maximaler Geschwindigkeit schlagen.
   HINWEIS: Die Kombination aus 0,1 mm und 0,5 mm Kügelchen mit hoher Dichte und Hochgeschwindigkeitsmischung auf einem Perlrührer gewährleistet eine gründliche Homogenisierung der mikrobiellen Zellwände.
2. Zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 16.000 x g , um die Kügelchen zu pelletieren. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, wodurch die Übertragung von Kügelchen minimiert wird, was Schritt 3.3 erleichtert. Messen Sie die Lautstärke.
3. Fügen Sie ein gleiches Volumen RNA-Lysepuffer (~450 μl) hinzu und mischen Sie gut. Übertragen Sie bis zu 800 μl Probe in eine Kieselsäuresäule in einem Sammelröhrchen und zentrifugieren Sie sie 30 s lang bei 16.000 x g . Bewahren Sie den Durchfluss auf, da er die RNA enthält, während die DNA an die Säule gebunden ist.
   HINWEIS: Der RNA-Lysepuffer enthält Guanidiniumthiocyanat und das Detergens N-Lauroylsarcosin zur Lyse von Zellen. Guanidiniumthiocyanat ist ein chaotropes Mittel, das auch Nukleasen inaktiviert und in Gegenwart von Kieselsäure, die in der Spin-Säule vorkommt, die Bindung der DNA an die Kieselsäure^{fördert 18}. Das Fehlen von Ethanol ermöglicht eine bevorzugte Bindung von DNA und nicht von RNA an die Siliziumdioxid-Spin-Säule¹⁹. Der Zweck von Schritt 3.3 besteht darin, genomische DNA zu binden und zu entfernen. Wir wollen die RNA erhalten, die im Durchflussteil enthalten ist.
4. Wenn noch mehr Probe übrig ist, füllen Sie die Säule in ein neues Entnahmeröhrchen und laden Sie sie mit dem Rest der Probe neu. Zentrifugieren Sie bei 16.000 x g für 30 s. Halten Sie den Durchfluss mit der RNA aufrecht und kombinieren Sie mit dem ersten Aliquot.
5. Messen Sie das kombinierte Durchflussvolumen, fügen Sie ein gleiches Volumen von 100 % Ethanol hinzu und mischen Sie gut. Bis zu 800 μl der Lösung in eine neue, zweite Siliziumdioxid-Spin-Säule in einem Sammelröhrchen überführen und bei 16.000 x g für 30 s zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
   HINWEIS: Die Zugabe von Ethanol zu der chaotropen Salzlösung, die die RNA enthält, verbessert die Bindung der RNA an die Siliziumdioxid-Spin-Säule¹⁹.
6. Bei Lösungen > 800 μl laden Sie die Spin-Säule neu und zentrifugieren Sie, bis die gesamte Lösung durchgedreht ist. Verwerfen Sie den Durchfluss nach jeder Drehung.
7. Geben Sie 400 μl Waschpuffer in die Säule und zentrifugieren Sie bei 16.000 x g für 30 s, um einen Teil der Salze zu entfernen. Verwerfen Sie den Durchfluss.
8. Bereiten Sie das DNase I-Reaktionsgemisch gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und führen Sie die DNase-Behandlung in der Säule durch, um alle DNA-Reste zu entfernen.
9. Resuspendieren Sie die lyophilisierte DNase I in 275 μl RNasefreiem Wasser, um eine Lösung von 1 U/μl herzustellen. Durch sanfte Umkehrung mischen.
10. Kombinieren Sie 5 μl verdünnte DNase I mit 75 μl des mitgelieferten DNase-Aufschlusspuffers. Vorsichtig durch Inversion mischen.
11. Geben Sie 80 μl der vorbereiteten Lösung direkt auf die Säulenmatrix. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
12. Geben Sie 400 μl RNA-Vorbereitungspuffer in die Säule und zentrifugieren Sie sie 30 s lang bei 16.000 x g . Verwerfen Sie den Durchfluss.
13. Geben Sie 700 μl RNA-Waschpuffer in die Säule und wiederholen Sie die Zentrifugation. Verwerfen Sie den Durchfluss.
14. Fügen Sie 400 μl RNA-Waschpuffer hinzu und zentrifugieren Sie die Säule 2 Minuten lang, um den restlichen Puffer vollständig zu entfernen.
    HINWEIS: Es gibt 2 verschiedene Waschschritte, um Verunreinigungen auf der Säule zu entfernen. Der Prep-Puffer enthält ein schwaches chaotropes Salz, das mit Ethanol gemischt wird, um Restproteine zu entfernen. Als nächstes wird der Waschpuffer verwendet, um Ethanolwäschen durchzuführen, um Salze zu entfernen. Jegliches verbleibende Ethanol muss entfernt werden, um eine effiziente Elution der RNA^19,20 zu ermöglichen.
15. Setzen Sie die Säule vorsichtig in ein neues, niedrig bindendes Mikrozentrifugenröhrchen um.
16. Geben Sie 50 μL RNase-freies Wasser direkt in die Säulenmatrix und inkubieren Sie es für 5 min. Zentrifugieren Sie 1 min lang bei 16.000 x g, um die RNA zu eluieren.
17. Für eine zusätzliche Reinigung zur Entfernung von PCR-Inhibitoren setzen Sie einen PCR-Inhibitor-Filter in ein neues Sammelröhrchen ein. Fügen Sie 600 μl der mitgelieferten Inhibitorvorbereitungslösung hinzu (siehe Materialtabelle).
18. Zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 8.000 x g, um den Filter zu waschen. Übertragen Sie den gewaschenen Filter in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung.
19. Übertragen Sie die eluierte RNA aus Schritt 3.13 in den gewaschenen Filter und zentrifugieren Sie sie 3 Minuten lang bei 16.000 x g.
    HINWEIS: Die RNA kann sofort verwendet oder bei -80 °C gelagert werden.
20. Die Konzentration der RNA ist mit einem hochempfindlichen fluorometrischen System²¹ zu bestimmen.
    HINWEIS: Diese Systeme ermöglichen die empfindliche Quantifizierung einer kleinen Menge RNA in Lösung, die spezifisch für das gewünschte Ziel ist.
    1. Beurteilen Sie die Qualität der RNA mit einem automatisierten Elektrophoresesystem, das eine RIN (RNA-Integritätszahl) liefern kann, die ein Maß für die RNA-Qualität ist^22,23.

4. Ribosomale RNA-Depletion und Hochdurchsatz-Sequenzierung

1. Senden Sie RNAs an das Genomzentrum des Centre for the Analysis of Genome Evolution and Function (CAGEF) an der University of Toronto (Toronto, Kanada) (https://www.cagef.utoronto.ca/) für die bakterielle rRNA-Depletion und die Erstellung einer RNA-Richtungsbibliothek (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die bakterielle rRNA-Depletion zielt auf die 5S-, 16S- und 23S-rRNAs zur Entfernung^{ab 24}.
2. Depletieren Sie rRNAs mit einem kommerziellen rRNA-Kit für bakterielle Depletion. Befolgen Sie das Protokoll für die Eingabe von 10 ng - 1 μg intakter oder teilweise abgebauter Gesamt-RNA.
3. Erstellen Sie RNA-Sequenzierungsbibliotheken mit einem RNA-Richtungsbibliotheksvorbereitungskit mit unterschiedlichen Indizes, die an jede Bibliothek angehängt sind.
4. Bündeln Sie äquimolare Mengen jeder RNA-Bibliothek und führen Sie eine Hochdurchsatz-Sequenzierung mit 100-Basen-Paired-End-Reads^{durch 25}.

5. Qualitätsbewertung von Sequenzierungs-Reads

HINWEIS : Überprüfen Sie die Qualität der Sequenzierungslesevorgänge mit dem frei verfügbaren Programm FastQC²⁶, das über die kostenlose Open-Source-Plattform Galaxy²⁷ verfügbar ist.

1. Gehen Sie zu https://usegalaxy.org/. Klicken Sie auf das Menü Anmelden oder Registrieren und melden Sie sich mit den Anmeldedaten an oder erstellen Sie ein Konto.
2. Klicken Sie oben links auf der Seite im Menü Extras auf den Link Daten hochladen und laden Sie die fastq.gz Sequenzierungsdateien hoch. Warten Sie, bis die Dateinamen auf der rechten Seite der Seite unter dem Bedienfeld "Verlauf" angezeigt werden.
3. Wählen Sie FASTQ Quality Control im Menü Extras, um eine Liste der Programme anzuzeigen. Wählen Sie FastQC aus, wodurch der mittlere Bereich des Bildschirms angezeigt wird.
4. Wählen Sie unter Kurze Lesedaten aus Ihrem aktuellen Verlauf die hochgeladenen fastq.gz Dateien aus dem Pulldown-Menü aus.
5. Wählen Sie Ausführen aus, um das Programm auszuführen.
6. Zeigen Sie die Ergebnisse im Bereich "Verlauf" an (Tabelle 2).
   HINWEIS: Ausführlichere Anweisungen zur Verwendung von Galaxy finden Sie auf der Support-Seite unter https://galaxyproject.org/support/.

6. Mapping von Sequenzierungs-Reads

HINWEIS : Aufgeführt ist eine grundlegende Pipeline für das Trimmen von Adaptern und das Lesemapping für RNA-seq-Daten. Adaptersequenzen werden mit Trimmomatic²⁸ aus den Lesevorgängen getrimmt. Die getrimmten Reads werden auf das PAO1-Referenzgenom von P. aeruginosa (NC_002516.2) abgebildet, das von NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)²⁹unter Verwendung von BWA³⁰ und Samtools³¹ gewonnen wurde. Der Einfachheit halber wird ein Lesezeichenpaar als PA_1.fq und PA_2.fq bezeichnet. Die Lesedatei des Adapters, die gekürzt werden soll, heißt adapter.fa. und die PAO1-Referenzsequenz heißt PAO1.fasta. Alle Tools sind Open Source und laufen in einer UNIX/LINUX-Umgebung. Es wird dringend empfohlen, dass Sie sich mit den Grundlagen von UNIX/LINUX vertraut machen, um diese Befehle auszuführen.

1. Öffnen Sie ein Fenster unter UNIX/LINUX.
2. Installieren Sie Java, Trimmomatic, BWA und Samtools.
3. Navigieren Sie in den Ordner, in dem sich die Datei trimmomatic-0.39.jar.
4. Schneiden Sie alle Adaptersequenzen aus den Lesevorgängen ab, indem Sie den folgenden Befehl eingeben:
   Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adapter.fa
   HINWEIS: Es werden nur Adaptersequenzen entfernt. Die Lesevorgänge wurden nicht auf Qualität³² gekürzt.
5. Verschieben Sie die Referenzdatei PAO1.fasta in denselben Ordner.
6. Indexieren Sie die Referenz mit BWA mit dem Befehl:
   Bwa index PA01.fasta
7. Ordnen Sie die gepaarten Reads dem Referenzgenom zu, indem Sie die folgenden 4 Befehle eingeben. Geben Sie jeden Befehl ein, nachdem der vorherige abgeschlossen wurde.
   Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
   Samtools Ansicht -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
   Samtools sort PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
   Samtools index PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
8. Zeigen Sie die Zuordnungsstatistiken an, indem Sie den folgenden Befehl eingeben:
   Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
   HINWEIS: Die 3^. Zeile der Statistik gibt den Anteil der Reads an, die dem Referenzgenom zugeordnet sind.
9. Berechnen Sie die mittlere Lesetiefe und -breite der Abdeckung mit den folgenden 2 Befehlen³³:
   samtools depth -a PA_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; s+=$3}ENDE{Drucken s/c}'
   samtools depth -a PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) gesamt+=1}END{drucken (gesamt/c)*100}'

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Ergebnisse

Den allgemeinen Überblick über die Methode gibt es in Abbildung 1. Zuvor haben wir 8-Well-Objektträger verwendet, um P. aeruginosa-Biofilme zu züchten und sie Antibiotika auszusetzen, bevor wir sie dann mittels konfokaler Mikroskopie zu verschiedenen Zeitpunkten untersuchten^12,13. Mit dieser Methode kann Gesamt-RNA direkt aus Biofilmen extrahiert werden, die in diesem System gezüchtet w...

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Diskussion

Die Gesamt-RNA wurde erfolgreich aus 17 verschiedenen bakteriellen Biofilmproben in dreifacher Ausfertigung extrahiert, was insgesamt 51 Proben ergibt. Die neunundvierzig RNA-Bibliotheken werden gepoolt und erfolgreich sequenziert. Insgesamt bestätigt dies unsere Qualitätskriterien mit einer Erfolgsquote von 96 %, obwohl mehr als die Hälfte der Proben als gering und von suboptimaler Qualität eingestuft werden 34,35,36,37.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Automated electrophoresis of biomolecules
Agilent RNA 6000 pico kit	Agilent	5067-1513	High sensitivity RNA electrophoresis chip to generate a RIN
DNA/RNA Lysis Buffer	Zymo Research	D7001-1-50	A guanidinium thiocyanate and N-Lauroylsarcosine-based lysis buffer sold as part of a nucleic acid purification kit
DNA/RNA Prep Buffer	Zymo Research	D7010-2-10	A guanidine HCl and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNA/RNA Shield	Zymo Research	R1100-50	DNA and RNA preservation/protection reagent
DNA/RNA Wash Buffer	Zymo Research	D7010-3-6	A salt and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNBSEQ G-400RS	MGI	G-400RS	High throughput sequencer
MGIEasy RNA Directional Library Prep Set	MGI	1000006386	Generate libraries for MGI high-throughput sequencing platforms from total RNA.
Mini-Beadbeater-96	BioSpec	1001	A high energy, high throughput cell disrupter
NEBNext rRNA Depletion Kit (bacteria)	New England Biolabs	E7850X	Efficient and specific depletion of bacterial rRNA (5S, 16S, 23S)
Nunc Lab-Tek II chamber slide system	Thermo Fisher Scientific	154534	8-well chamber slide with removable wells
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33238	Fluorometer for DNA, RNA and proteins
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32852	High sensitivity fluorometric assay to measure RNA concentration
Spin-Away Filters	Zymo Research	C1006-50-F	Silica-based spin column primarily used to bind or remove genomic DNA
Sterile inoculation loops, 1 uL	Sarstedt	86.1567.050	Sterile, disposable inoculation loops for manipulation of microorganisms
ZR BashingBead Lysis tubes	Zymo Research	S6003-50	2 mL tubes containing 0.1 and 0.5 mm bead lysis matrix for homogenizing biological samples
Zymo Spin IIICG Columns	Zymo Research	C1006-50-G	Silica-based spin column for purification of DNA and RNA
Zymo-Spin III-HRC Filters	Zymo Research	C1058-50	Remove inhibitors such as polyphenolic compounds, humic/fulvic acids, tannins, melanin, etc.
Zymobiomics DNA/RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2002	DNA and RNA dual extraction kit
Zymobiomics HRC Prep solution	Zymo Research	D4300-7-30	To be used with Zymo-Spin III-HRC Filters to remove PCR inhibitors