Aislamiento de ARN total de Pseudomonas aeruginosa dentro de biofilms para medir la expresión génica

Resumen

Este protocolo presenta un método para aislar el ARN de las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa cultivadas en portaobjetos de cámara para la secuenciación de alto rendimiento.

Resumen

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno bacteriano oportunista que causa infecciones en las vías respiratorias de los pacientes con fibrosis quística (FQ). P. aeruginosa es conocida por su capacidad para formar biopelículas que están protegidas por una matriz de exopolisacáridos. Esta matriz permite que los microorganismos sean más resistentes a los factores externos, incluido el tratamiento con antibióticos. Uno de los métodos más comunes de crecimiento de biopelículas para la investigación es en placas de microtitulación o portaobjetos con cámara. La ventaja de estos sistemas es que permiten probar múltiples condiciones de crecimiento, pero su desventaja es que producen cantidades limitadas de biopelícula para la extracción de ARN. El propósito de este artículo es proporcionar un protocolo detallado, paso a paso, sobre cómo extraer ARN total de pequeñas cantidades de biopelícula de calidad y cantidad suficientes para una secuenciación de alto rendimiento. Este protocolo permite el estudio de la expresión génica dentro de estos sistemas de biopelículas.

Introducción

La mayoría de las infecciones bacterianas crónicas, como las infecciones pulmonares en pacientes con fibrosis quística (FQ) y las infecciones relacionadas con prótesis, se caracterizan por el crecimiento de microorganismos dentro de biopelículas. Las biopelículas¹ son comunidades de bacterias encerradas en una matriz compuesta principalmente por polisacáridos². Las bacterias dentro de las biopelículas pueden ser de crecimiento lento, metabólicamente inactivas y en condiciones anaeróbicas e hipóxicas. Las biopelículas son más resistentes a los antibióticos debido a factores como la disminución de la penetración de los antibióticos, el aumento de la expresión de las bombas de eflujo de fármacos y la disminución de la división celular³. Por estas y otras razones, son de gran interés para la investigación.

Con el fin de estudiar con precisión las infecciones persistentes, como las infecciones crónicas por Pseudomonas aeruginosa, en pacientes con FQ, las condiciones de crecimiento observadas con la formación de biopelículas deben reflejarse con precisión in vitro. Un método común y de alto rendimiento es cultivarlos en portaobjetos de cámara o placas de microtitulación y monitorear la formación de biopelícula mediante microscopía confocal⁴. Se sabe que un regulador clave en la transición de un estilo de vida bacteriano planctónico, o de flotación libre, a biofilm es el mensajero secundario, el di-GMP⁵ cíclico. El aumento de los niveles cíclicos de di-GMP aumenta la expresión de genes específicos que promueven el crecimiento de la biopelícula. Los pequeños ARN reguladores no codificantes y la detección de quórum también desempeñan un papel importante en la regulación de la formación de biopelículas⁵. La medición de la expresión génica de la biopelícula mediante la secuenciación del ARN bacteriano extraído puede ser un desafío. P. aeruginosa, por ejemplo, produce tres exopolisacáridos (Psl, Pel y alginato), que se producen en cantidades significativas en biopelículas ^6,7. Estos polisacáridos pueden interferir con la extracción y purificación del ARN, lo que da lugar a preparaciones impuras que contienen bajos niveles de ARNm bacteriano⁸. Los kits de extracción de ARN disponibles en el mercado son capaces de producir ARN de alta calidad a partir de cultivos de bacterias planctónicas, pero pueden no funcionar tan bien con cultivos de biopelícula ^9,10,11. Hay algunos kits comerciales de extracción de ARN que afirman funcionar para biopelículas, uno de los cuales usamos con este método.

En este manuscrito, describimos los procedimientos para el cultivo de biopelículas de P. aeruginosa en portaobjetos de cámara y la extracción de ARNm bacteriano para la secuenciación de alto rendimiento^12,13. Utilizando aislados clínicos recolectados de muestras de esputo de pacientes con FQ, demostramos que estos métodos se pueden usar para aislados con diferentes características de crecimiento. En comparación con publicaciones previas, este protocolo se describe en detalle para permitir un mayor éxito en el estudio de la expresión génica de la biopelícula bacteriana 11,14,15,16.

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Protocolo

El Comité de Ética de la Investigación (REB) es necesario para la recolección y el procesamiento de muestras de esputo de sujetos humanos. Este estudio fue aprobado por el Hospital for Sick Children (REB#1000019444). El Comité de Ética en Investigación (REB, por sus siglas en inglés) está obligado a recolectar y almacenar muestras de esputo de sujetos humanos. Estos estudios fueron aprobados por el Hospital para Niños Enfermos REB#1000058579.

1. Formación de biopelículas

1. Cultive aislados de Pseudomonas aeruginosa obtenidos de las muestras de esputo de pacientes con FQ utilizados en este estudio en placas de agar Luria Broth (LB) en una incubadora a 37 °C durante la noche.
   NOTA: La técnica de rayado adecuada es importante para obtener colonias bacterianas individuales. Las rayas mientras se gira la placa diluirán las células bacterianas lo suficiente como para que puedan crecer colonias individuales.
   1. Raye las bacterias usando un circuito de inoculación en un patrón en zig-zag en el extremo superior de una placa LB fresca hasta que se cubra aproximadamente 1/4 de la placa.
   2. Gire la placa unos 60°. Tome un nuevo circuito de inoculación y páselo una vez a través del área rayada y en una segunda área limpia de la placa, repitiendo el patrón en zig-zag.
   3. Repita el paso 1.1.2 con un bucle nuevo en una tercera área del plato. Vuelva a colocar la tapa e invierta la placa cuando la coloque en la incubadora.
2. Utilice un asa de inoculación estéril para seleccionar una sola colonia bacteriana de una placa de agar (que contenga una sola cepa bacteriana) e inocule un tubo de cultivo lleno de 5 mL de medio LB estéril. Usando un nuevo bucle cada vez, inocule dos tubos de cultivo adicionales llenos con 5 mL de medio LB de la misma placa.
3. Repita el mismo procedimiento de inoculación para las diferentes cepas bacterianas. Cultive los cultivos durante la noche a 37 °C con agitación a 220 RPM.
   NOTA: Cada placa de agar que contiene una sola cepa bacteriana se utiliza para inocular 3 tubos de cultivo independientes. Los tres tubos representan réplicas biológicas por triplicado para una cepa y se tratan como muestras separadas. Esto es diferente de las réplicas técnicas que implicarían extraer ARN 3 veces de un solo tubo de cultivo.
4. Prepare diluciones 1:100 de los cultivos durante la noche transfiriendo 50 μL de un cultivo nocturno a un nuevo tubo de cultivo que contenga 4,95 mL de nuevos medios LB.
5. Cultive los cultivos diluidos durante otras 3 h a 37 °C agitando a 220 RPM o hasta que el diámetro exterior de₆₀₀ sea de 0,1 o más. Mida las densidades de celdas en un espectrofotómetro a OD₆₀₀.
6. En un nuevo tubo de microfuga de 1,7 mL, ajuste el OD₆₀₀ a 0,1 (fase logarítmica temprana) en un volumen total de 1,5 mL con LB fresco.
7. Mezclar suavemente por inversión. Transfiera 300 μL de cada cultivo ajustado a 4 pocillos de un portaobjetos de una cámara de 8 pocillos para obtener 2 muestras diferentes por portaobjetos (Figura 1).
8. Coloque los portaobjetos, sin tocarlos, en una incubadora a 37 °C durante la noche durante 24 h. Para evitar la evaporación, coloque los portaobjetos encima de una toalla de papel húmeda en una pequeña bandeja de plástico.

2. Recuperación de biofilm

NOTA: Cada portaobjetos de vidrio contiene ocho pocillos separados. Una sola muestra consta de cuatro pozos con biopelículas que se agruparán¹⁷. Este protocolo de extracción es para 1 muestra (4 pocillos) donde las biopelículas se recuperan de 2 pocillos a la vez. Las extracciones de ARN se realizan utilizando un kit de extracción de ARN comercial que incluye un paso de batido de perlas y una limpieza basada en columnas, con modificaciones. Siga las instrucciones del fabricante para la preparación de reactivos.

1. En una campana de flujo laminar, retire lentamente los medios de 2 de los 4 pocillos con una punta de pipeta. Incline la corredera en un ángulo de 45° y pipetee el medio desde la esquina inferior de los pocillos para evitar el desprendimiento de las biopelículas.
2. Manteniendo el portaobjetos inclinado, lave las células planctónicas pipeteando suavemente 300 μL de agua libre de RNasa en la esquina inferior de los dos pocillos vacíos. Retire el agua pipeteándola suavemente, como se describe en el paso 2.1. Repita el paso de lavado eliminando la mayor cantidad de agua posible.
3. Añadir 300 μL de un reactivo de protección de ARN (ver Tabla de Materiales) a cada uno de los dos pocillos vaciados con biofilms en su base. Coloque el portaobjetos de la cámara en una placa de vidrio para evitar que los pocillos se rompan, y luego raspe las biopelículas en los 2 pocillos con una pequeña espátula de metal estéril y libre de nucleasas para volver a suspender las bacterias del biofilm. Deje reposar hasta que se recuperen las biopelículas de los 2 pozos intactos restantes de la misma muestra.
   NOTA: La adición de un reactivo de protección de ARN garantiza la estabilidad de las muestras de biopelícula en los pocillos raspados a temperatura ambiente mientras se procesan los dos pocillos restantes de la misma muestra. El reactivo de protección del ARN lisa las células e inactiva las nucleasas y los agentes infecciosos, lo que da lugar a la conservación del ARN.
4. Para recuperar biopelículas de los 2 pocillos restantes para una muestra (recordatorio: una muestra se compone de 4 pocillos), retire el medio LB de los 2 pocillos nuevos restantes de la misma manera que se describe en el paso 2.1. Repita el paso 2.2 para lavar las células planctónicas con agua libre de RNasa de ambos pozos nuevos, como antes.
5. Vuelva a los 2 primeros pocillos con biopelículas raspadas en el reactivo de protección, generado al final del paso 2.3, y pipetee lentamente para mezclar los 300 μL de biopelícula resuspendida de un pocillo raspado, tratando de no crear demasiadas burbujas.
   1. Transfiera todo el contenido del pozo a uno de los pozos recién lavados y vaciados. Mezcle y transfiera 300 μL de biofilm resuspendido del segundo pocillo raspado en el pocillo restante, recién lavado y vaciado.
      NOTA: En lugar de agregar un nuevo reactivo de protección de ARN a los 2 pocillos recién lavados con biopelículas, transfiera las biopelículas previamente raspadas que ya están en el reactivo de protección a estos pocillos recién lavados. Esto mantendrá el volumen de muestra combinado lo suficientemente bajo como para cumplir con los requisitos de entrada para el kit comercial de extracción de ARN. Consulte la Figura 1 para ver un esquema.
6. Repita el raspado de las biopelículas en los nuevos pocillos como en el paso 2.3, colocando el portaobjetos de la cámara sobre una placa de vidrio y raspando las biopelículas en los 2 nuevos pocillos con una pequeña espátula de metal estéril y libre de nucleasas para volver a suspender las bacterias de la biopelícula.
7. Combine toda la biopelícula resuspendida de los 2 nuevos pocillos en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL libre de RNasa, de baja unión. Mida el volumen, que debe ser de ~500 a 600 μL en total.
   NOTA: La suspensión combinada de la biopelícula de este segundo par de pocillos nuevos contendrá todo el material de la biopelícula de los 4 pocillos originales de una muestra.

3. Aislamiento de ARN total y evaluación de la calidad

NOTA: La extracción de ARN se realiza utilizando un kit de extracción de ARN comercial que afirma funcionar en biopelículas. Los componentes individuales se incluyen en la Tabla de Materiales, si es posible. Siempre que sea posible, se proporcionan explicaciones de los mecanismos detrás de cada paso de purificación.

1. Agregue suficiente reactivo de protección de ARN hasta un total de 750 μL en el tubo. Transfiera todo el volumen a un tubo de lisis para batir perlas de 2 mL que contenga perlas de 0,1 y 0,5 mm (consulte la tabla de materiales). Batir durante 2 1/2 min en un batidor de cuentas a máxima velocidad.
   NOTA: La combinación de perlas de alta densidad de 0,1 mm y 0,5 mm más la mezcla a alta velocidad en un batidor de perlas garantiza una homogeneización completa de las paredes celulares microbianas.
2. Centrifugar a 16.000 x g durante 1 min para pellet las perlas. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga, minimizando la transferencia de cualquier perla, lo que facilitará el paso 3.3. Mide el volumen.
3. Agregue un volumen igual de tampón de lisis de ARN (~ 450 μL) y mezcle bien. Transfiera hasta 800 μL de muestra, evitando la transferencia de perlas, a una columna de sílice en un tubo de recolección y centrifuga a 16.000 x g durante 30 s. Guarde el flujo a través, ya que contiene el ARN mientras el ADN está unido a la columna.
   NOTA: El tampón de lisis de ARN contiene tiocianato de guanidinio y el detergente N-lauroylsarcosina para lisar las células. El tiocianato de guanidinio es un agente caotrópico que también inactiva las nucleasas y, en presencia de sílice, que se encuentra en la columna de espín, promueve la unión del ADN a la sílice¹⁸. La ausencia de etanol permite la unión preferencial del ADN y no del ARN a la columna de espín de sílice¹⁹. El propósito del paso 3.3 es unirse y eliminar el ADN genómico. Queremos retener el ARN, que está contenido en la parte de flujo.
4. Si queda más muestra, transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección y vuelva a cargarla con el resto de la muestra. Centrífuga a 16.000 x g durante 30 s. Mantenga el flujo con el ARN y combine con la primera alícuota.
5. Mida el volumen de flujo combinado y agregue un volumen igual de etanol al 100 % y mezcle bien. Transfiera hasta 800 μL de la solución a una nueva segunda columna de centrifugación de sílice en un tubo de recolección y centrifuga a 16.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo continuo.
   NOTA: La adición de etanol a la solución salina caotrópica que contiene el ARN mejora la unión del ARN a la columna de espín de sílice¹⁹.
6. Para soluciones > 800 μL, vuelva a cargar la columna de centrifugación y la centrífuga hasta que se haya centrifugado toda la solución. Descarta el flujo después de cada giro.
7. Añadir 400 μL de tampón de lavado a la columna y centrifugar a 16.000 x g durante 30 s para eliminar algunas de las sales. Deseche el flujo continuo.
8. Prepare la mezcla de reacción de DNasa I de acuerdo con las instrucciones del fabricante y lleve a cabo el tratamiento con DNasa en columna para eliminar cualquier ADN residual.
9. Vuelva a suspender la DNasa I liofilizada en 275 μL de agua libre de RNasa para hacer una solución de 1 U/μL. Mezclar por inversión suave.
10. Combine 5 μL de DNasa I diluida con 75 μL del tampón de digestión de DNasa proporcionado. Mezclar suavemente por inversión.
11. Añadir 80 μL de la solución preparada directamente sobre la matriz de columna. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
12. Añada 400 μL de tampón de preparación de ARN a la columna y centrifugue a 16.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo continuo.
13. Añadir 700 μL de tampón de lavado de ARN a la columna y repetir la centrifugación. Deseche el flujo continuo.
14. Agregue 400 μL de tampón de lavado de ARN y centrifugue la columna durante 2 minutos para eliminar completamente cualquier tampón residual.
    NOTA: Hay 2 pasos de lavado diferentes para eliminar las impurezas de la columna. El tampón de preparación contiene una sal caotrópica débil mezclada con etanol para eliminar las proteínas residuales. A continuación, el tampón de lavado se utiliza para realizar lavados con etanol para eliminar las sales. Cualquier resto de etanol debe eliminarse para permitir una elución eficiente del ARN^19,20.
15. Transfiera con cuidado la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja fijación.
16. Añadir 50 μL de agua libre de RNasa directamente a la matriz de la columna e incubar durante 5 min. Centrifugar a 16.000 x g durante 1 min para eluir el ARN.
17. Para una limpieza adicional para eliminar los inhibidores de PCR, coloque un filtro de inhibidor de PCR en un nuevo tubo de recolección. Agregue 600 μL de la solución de preparación del inhibidor provista (consulte la Tabla de materiales).
18. Centrifugar a 8.000 x g durante 3 min para lavar el filtro. Transfiera el filtro lavado a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja fijación.
19. Transfiera el ARN eluido del paso 3.13 al filtro lavado y centrifugue a 16.000 x g durante 3 minutos.
    NOTA: El ARN puede utilizarse inmediatamente o almacenarse a -80 °C.
20. Determinar la concentración del ARN utilizando un sistema fluorométrico de alta sensibilidad²¹.
    NOTA: Estos sistemas permiten la cuantificación sensible de una pequeña cantidad de ARN en solución que es específica para el objetivo de interés.
    1. Evaluar la calidad del ARN utilizando un sistema de electroforesis automatizado que puede proporcionar un RIN (número de integridad del ARN), que es una medida de la calidad del ARN^22,23.

4. Agotamiento de ARN ribosómico y secuenciación de alto rendimiento

1. Enviar ARN al Centro para el Análisis de la Evolución y la Función del Genoma (CAGEF) de la Universidad de Toronto (Toronto, Canadá) (https://www.cagef.utoronto.ca/) para la depleción del ARNr bacteriano y la preparación de la biblioteca direccional de ARN (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: La depleción bacteriana del ARNr se dirige a los ARNr 5S, 16S y 23S para su eliminación²⁴.
2. Agote los ARNr utilizando un kit comercial de depleción bacteriana de ARNr. Siga el protocolo para introducir de 10 ng a 1 μg de ARN total intacto o parcialmente degradado.
3. Construya bibliotecas de secuenciación de ARN utilizando un kit de preparación de bibliotecas direccionales de ARN con diferentes índices adjuntos a cada biblioteca.
4. Agrupe las cantidades equimolares de cada biblioteca de ARN y realice una secuenciación de alto rendimiento con lecturas de 100 bases en el extremo emparejado²⁵.

5. Evaluación de la calidad de las lecturas secuenciales

NOTA : Verifique la calidad de las lecturas de secuenciación utilizando el programa disponible gratuitamente, FastQC²⁶, disponible a través de la plataforma gratuita de código abierto, Galaxy²⁷.

1. Ir a https://usegalaxy.org/. Haga clic en el menú Iniciar sesión o Registrarse e inicie sesión con credenciales o cree una cuenta.
2. Haga clic en el enlace Cargar datos en la parte superior izquierda de la página, en el menú Herramientas, y cargue los archivos de secuenciación fastq.gz. Espere a que los nombres de los archivos aparezcan en el lado derecho de la página, en el panel Historial.
3. Seleccione Control de calidad de FASTQ en el menú Herramientas para mostrar una lista de programas. Seleccione FastQC, que llenará el panel central de la pantalla.
4. En Datos de lectura corta de su historial actual, seleccione los archivos de fastq.gz cargados en el menú desplegable.
5. Seleccione Ejecutar para ejecutar el programa.
6. Vea los resultados en el panel Historial (Tabla 2).
   NOTA: Para obtener instrucciones más detalladas sobre cómo usar Galaxy, visite la página de soporte en https://galaxyproject.org/support/.

6. Mapeo de lecturas de secuenciación

NOTA : Se enumera una tubería básica para el recorte de adaptadores y el mapeo de lectura para datos de secuenciación de ARN. Las secuencias de adaptador se recortan de las lecturas mediante Trimmomatic²⁸. Las lecturas recortadas se mapean con el genoma de referencia de P. aeruginosa PAO1 (NC_002516.2), obtenido de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)²⁹utilizando BWA³⁰ y Samtools³¹. Para simplificar, un par de lecturas se denominan PA_1.fq y PA_2.fq; El archivo de lectura del adaptador que se va a recortar se denomina adapter.fa; y la secuencia de referencia PAO1 se denomina PAO1.fasta. Todas las herramientas son de código abierto y se ejecutan en un entorno UNIX/LINUX. Se recomienda encarecidamente que se familiarice con los fundamentos de UNIX/LINUX para poder ejecutar estos comandos.

1. Abra una ventana en UNIX/LINUX.
2. Instala Java, Trimmomatic, BWA y Samtools.
3. Vaya a la carpeta donde reside el archivo trimmomatic-0.39.jar.
4. Recorte las secuencias de adaptador de las lecturas escribiendo el comando:
   Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adaptadores.fa
   NOTA: Solo se eliminan las secuencias de adaptador. Las lecturas no se han recortado para mejorar la calidad³².
5. Mueva el archivo de referencia PAO1.fasta a la misma carpeta.
6. Indexe la referencia mediante BWA con el comando:
   Índice Bwa PA01.fasta
7. Asigne las lecturas emparejadas al genoma de referencia escribiendo los siguientes 4 comandos. Escriba cada comando después de que haya finalizado el anterior.
   Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
   Samtools view -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
   Samtools ordena PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
   Índice de Samtools PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
8. Para ver las estadísticas de mapeo, escriba el comando:
   Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
   NOTA: La^3ª línea de las estadísticas informa de la proporción de las lecturas que se asignan al genoma de referencia.
9. Calcule la profundidad de lectura media y la amplitud de la cobertura con los siguientes 2 comandos³³, respectivamente:
   samtools depth -a PA_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; s+=$3}END{imprimir s/c}'
   samtools profundidad -a PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) total+=1}END{print (total/c)*100}'

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Resultados

La descripción general del método se muestra en la Figura 1. Anteriormente utilizamos portaobjetos de cámara de 8 pocillos para cultivar biopelículas de P. aeruginosa y exponerlas a antibióticos antes de examinarlas mediante microscopía confocal en diferentes puntos temporales^12,13. Este método se puede utilizar para extraer ARN total directamente de biopelículas cultivadas en este s...

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Discusión

El ARN total se extrae con éxito de 17 muestras diferentes de biopelícula bacteriana por triplicado, lo que produce un total de 51 muestras. Las cuarenta y nueve bibliotecas de ARN se agrupan y se secuencian con éxito. En general, esto valida nuestros criterios de calidad con una tasa de éxito del 96 %, a pesar de que más de la mitad de las muestras se consideran de baja abundancia y de calidad subóptima 34,35,36,37.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Automated electrophoresis of biomolecules
Agilent RNA 6000 pico kit	Agilent	5067-1513	High sensitivity RNA electrophoresis chip to generate a RIN
DNA/RNA Lysis Buffer	Zymo Research	D7001-1-50	A guanidinium thiocyanate and N-Lauroylsarcosine-based lysis buffer sold as part of a nucleic acid purification kit
DNA/RNA Prep Buffer	Zymo Research	D7010-2-10	A guanidine HCl and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNA/RNA Shield	Zymo Research	R1100-50	DNA and RNA preservation/protection reagent
DNA/RNA Wash Buffer	Zymo Research	D7010-3-6	A salt and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNBSEQ G-400RS	MGI	G-400RS	High throughput sequencer
MGIEasy RNA Directional Library Prep Set	MGI	1000006386	Generate libraries for MGI high-throughput sequencing platforms from total RNA.
Mini-Beadbeater-96	BioSpec	1001	A high energy, high throughput cell disrupter
NEBNext rRNA Depletion Kit (bacteria)	New England Biolabs	E7850X	Efficient and specific depletion of bacterial rRNA (5S, 16S, 23S)
Nunc Lab-Tek II chamber slide system	Thermo Fisher Scientific	154534	8-well chamber slide with removable wells
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33238	Fluorometer for DNA, RNA and proteins
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32852	High sensitivity fluorometric assay to measure RNA concentration
Spin-Away Filters	Zymo Research	C1006-50-F	Silica-based spin column primarily used to bind or remove genomic DNA
Sterile inoculation loops, 1 uL	Sarstedt	86.1567.050	Sterile, disposable inoculation loops for manipulation of microorganisms
ZR BashingBead Lysis tubes	Zymo Research	S6003-50	2 mL tubes containing 0.1 and 0.5 mm bead lysis matrix for homogenizing biological samples
Zymo Spin IIICG Columns	Zymo Research	C1006-50-G	Silica-based spin column for purification of DNA and RNA
Zymo-Spin III-HRC Filters	Zymo Research	C1058-50	Remove inhibitors such as polyphenolic compounds, humic/fulvic acids, tannins, melanin, etc.
Zymobiomics DNA/RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2002	DNA and RNA dual extraction kit
Zymobiomics HRC Prep solution	Zymo Research	D4300-7-30	To be used with Zymo-Spin III-HRC Filters to remove PCR inhibitors