Выделение общей РНК из Pseudomonas aeruginosa в биопленках для измерения экспрессии генов

Резюме

В этом протоколе представлен метод выделения РНК из биопленок Pseudomonas aeruginosa, выращенных в камерных предметных стеклах, для высокопроизводительного секвенирования.

Аннотация

Pseudomonas aeruginosa является условно-патогенным микроорганизмом, вызывающим инфекции дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом (МВ). P. aeruginosa известна своей способностью образовывать биопленки, которые защищены матрицей экзополисахаридов. Эта матрица позволяет микроорганизмам быть более устойчивыми к внешним факторам, в том числе к лечению антибиотиками. Одним из наиболее распространенных методов выращивания биопленки для исследований является микротитровка или камерные предметные стекла. Преимущество этих систем заключается в том, что они позволяют тестировать различные условия роста, но их недостаток заключается в том, что они производят ограниченное количество биопленки для экстракции РНК. Цель данной статьи – предоставить подробный, пошаговый протокол о том, как извлечь общую РНК из небольших количеств биопленки достаточного качества и количества для высокопроизводительного секвенирования. Этот протокол позволяет изучать экспрессию генов в этих биопленочных системах.

Введение

Большинство хронических бактериальных инфекций, таких как легочные инфекции у пациентов с муковисцидозом (МВ) и инфекции, связанные с протезированием, характеризуются ростом микроорганизмов внутри биопленок. Биопленки¹ представляют собой сообщества бактерий, заключенные в матрицу, состоящую преимущественно из полисахаридов². Бактерии в биопленках могут быть медленно растущими, метаболически спящими, а также находиться в анаэробных, гипоксических условиях. Биопленки более устойчивы к антибиотикам из-за таких факторов, как снижение проникновения антибиотиков, повышенная экспрессия насосов для оттока лекарств и^{снижение деления} клеток3. По этим и другим причинам они представляют большой исследовательский интерес.

Для точного изучения персистирующих инфекций, таких как хроническая инфекция Pseudomonas aeruginosa у пациентов с муковисцидозом, условия роста, наблюдаемые при образовании биопленки, должны быть точно отражены in vitro. Распространенным методом с высокой пропускной способностью является выращивание их в камерных предметных стеклах или микротитровых планшетах и мониторинг образования биопленки с помощью конфокальной^{микроскопии}. Известно, что ключевым регулятором при переходе от планктонного, или свободноплавающего, к биопленочному бактериальному образу жизни является вторичный мессенджер, cyclic-di-GMP⁵. Повышенный уровень cyclic-di-GMP увеличивает экспрессию специфических генов, способствующих росту биопленки. Малые некодирующие регуляторные РНК и чувство кворума также играют важную роль в регуляции образования биопленки⁵. Измерение экспрессии генов биопленки путем секвенирования экстрагированной бактериальной РНК может быть сложной задачей. P. aeruginosa, например, продуцирует три экзополисахарида (Psl, Pel и альгинат), которые в значительных количествах продуцируются в биопленках ^6,7. Эти полисахариды могут препятствовать экстракции и очистке РНК, что приводит к получению нечистых препаратов, содержащих низкие уровни бактериальной мРНК⁸. Коммерчески доступные наборы для экстракции РНК способны производить высококачественную РНК из планктонных бактериальных культур, но могут не работать так же хорошо с культурами биопленки ^9,10,11. Существует несколько коммерческих наборов для экстракции РНК, которые утверждают, что работают для биопленок, один из которых мы используем с этим методом.

В данной рукописи мы описываем процедуры выращивания биопленок P. aeruginosa в предметных стеклах камеры и экстракции бактериальной мРНК для высокопроизводительного секвенирования^12,13. Используя клинические изоляты, собранные из образцов мокроты пациентов с муковисцидозом, мы демонстрируем, что эти методы могут быть использованы для изолятов с различными характеристиками роста. По сравнению с предыдущими публикациями, этот протокол подробно описан для достижения большего успеха в изучении экспрессии бактериальных биопленочных генов 11,14,15,16.

протокол

Совет по этике научных исследований (REB) необходим для сбора и обработки образцов мокроты у людей. Это исследование было одобрено Больницей для больных детей (REB#1000019444). Совет по этике научных исследований (REB) обязан собирать и хранить образцы мокроты у людей. Эти исследования были одобрены Больницей для больных детей РЭБ#1000058579.

1. Образование биопленки

1. Выращивайте изоляты Pseudomonas aeruginosa, полученные из образцов мокроты пациентов с муковисцидозом, использованных в этом исследовании, на агаровых планшетах Luria Broth (LB) в инкубаторе при температуре 37 °C в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная техника полос важна для получения одиночных бактериальных колоний. Полосы при вращении пластины разбавят клетки бактерий настолько, что могут расти отдельные колонии.
   1. Разбивайте бактерии с помощью петли инокуляции зигзагообразно на верхнем конце свежей пластины LB, пока не будет покрыта примерно 1/4 пластины.
   2. Поверните пластину примерно на 60°. Возьмите новую петлю прививки и пропустите ее один раз через участок с полосами и во второй, чистый участок пластины, повторяя зигзагообразную схему.
   3. Повторите шаг 1.1.2 со свежей петлей в третью область тарелки. Установите на место крышку и переверните пластину при помещении в инкубатор.
2. Используйте стерильную инокуляционную петлю, чтобы выбрать одну бактериальную колонию из агаровой пластины (содержащей один штамм бактерии) и инокулировать культуральную пробирку, заполненную 5 мл стерильной среды LB. Используя каждый раз новую петлю, инокулируйте две дополнительные культуральные пробирки, заполненные 5 мл LB среды, из той же пластины.
3. Повторите ту же процедуру инокуляции для разных штаммов бактерий. Выращивайте культуры в течение ночи при температуре 37 °C с встряхиванием при 220 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая агаровая пластина, содержащая один штамм бактерий, используется для инокуляции 3 независимых пробирок для культивирования. Три пробирки представляют собой биологические реплики в трех экземплярах для одного штамма и обрабатываются как отдельные образцы. Это отличается от технических репликаций, которые повлекли бы за собой экстракцию РНК 3 раза из одной культуральной пробирки.
4. Приготовьте разведение ночных культур в соотношении 1:100, перенеся 50 мкл ночной культуры в новую культуральную пробирку, содержащую 4,95 мл новой LB-среды.
5. Разведенные культуры выращивают еще 3 ч при 37 °C с встряхиванием при 220 об/мин или до тех пор, пока наружный диаметр₆₀₀ не составит 0,1 или выше. Измерьте плотность ячеек на спектрофотометре при наружном диаметре₆₀₀.
6. В новой пробирке для микрофуги объемом 1,7 мл отрегулируйте наружный диаметр₆₀₀ до 0,1 (ранняя фаза логарифма) в общем объеме 1,5 мл с помощью свежего LB.
7. Аккуратно перемешайте методом инверсии. Перенесите 300 μL каждой отрегулированной культуры в 4 лунки 8-луночного предметного стекла, чтобы получить 2 разных образца на предметное стекло (Рисунок 1).
8. Поместите предметные стекла в холодильник с температурой 37 °C на ночь на 24 часа. Чтобы предотвратить испарение, поместите предметные стекла на верхнюю часть влажного бумажного полотенца в небольшой пластиковый лоток.

2. Восстановление биопленки

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое предметное стекло содержит восемь отдельных лунок. Один образец состоит из четырех лунок с биопленками, которые будут объединены^{в 17}. Этот протокол экстракции предназначен для 1 образца (4 лунок), где биопленки извлекаются из 2 лунок за раз. Экстракция РНК выполняется с использованием коммерческого набора для экстракции РНК, который включает в себя этап взбивания шариков и очистку в колонке с модификациями. Следуйте инструкциям производителя по приготовлению реагентов.

1. В ламинарном проточном колпаке медленно удалите среду из 2 из 4 лунок с помощью наконечника для дозатора. Наклоните предметное стекло под углом 45° и выведите фильтрующий материал из нижнего угла лунок, чтобы предотвратить отслоение биопленок.
2. Удерживая предметное стекло под наклоном, промойте планктонные клетки, осторожно набрав 300 мкл воды, не содержащей РНКазы, в нижний угол двух опорожненных лунок. Удалите воду, аккуратно отпиливая ее, как описано в шаге 2.1. Повторите этап промывки, удалив как можно больше воды.
3. Добавьте по 300 мкл реагента для защиты РНК (см. Таблицу материалов) в каждую из двух опорожненных лунок с биопленками на основании. Поместите предметное стекло камеры на стеклянную пластину, чтобы предотвратить разрушение лунок, а затем соскребите биопленки в 2 лунках с помощью небольшого, не содержащего нуклеаз, стерильного металлического шпателя, чтобы повторно суспендировать биопленочные бактерии. Дайте постоять до тех пор, пока биопленки не будут извлечены из 2 оставшихся нетронутых лунок из того же образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление реагента для защиты РНК обеспечивает стабильность образцов биопленки в очищенных лунках при температуре окружающей среды при обработке остальных двух лунок того же образца. Реагент защиты РНК лизирует клетки и инактивирует нуклеазы и инфекционные агенты, что приводит к сохранению РНК.
4. Чтобы извлечь биопленки из оставшихся 2 лунок для образца (напоминаем: один образец состоит из 4 лунок), удалите LB среду из 2 оставшихся новых лунок таким же образом, как описано в шаге 2.1. Повторите шаг 2.2, чтобы смыть планктонные клетки водой без РНКазы из обеих новых скважин, как и раньше.
5. Вернитесь к первым 2 лункам со соскобленными биопленками в защитном реагенте, полученном в конце шага 2.3, и медленно пипеткой перемешайте 300 мкл ресуспендированной биопленки из одной соскобленной лунки, стараясь не создавать слишком много пузырьков.
   1. Переложите все содержимое из колодца в одну из только что вымытых, опустошенных лунок. Смешайте и перенесите 300 мкл ресуспендированной биопленки из второй соскобленной лунки в оставшуюся, только что промытую, опорожненную лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо добавления нового реагента для защиты РНК в 2 вновь промытые лунки с биопленками, перенесите ранее соскобленные биопленки, уже находящиеся в защитном реагенте, в эти свежепромытые лунки. Это позволит сохранить объединенный объем образца на достаточно низком уровне, чтобы удовлетворить требования к входным данным для коммерческого набора для экстракции РНК. Схема приведена на рисунке 1 .
6. Повторите соскоб биопленок в новых лунках, как в шаге 2.3, поместив предметное стекло камеры на стеклянную пластину и соскоблив биопленки в 2 новых лунках с помощью небольшого, не содержащего нуклеаз, стерильного металлического шпателя для повторного суспендирования биопленочных бактерий.
7. Объедините всю ресуспендированную биопленку из 2 новых лунок в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл объемом 1,5 мл без РНКазы с низким уровнем связывания. Измерьте объем, который должен составлять ~500 - 600 μL всего.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Комбинированная биопленочная суспензия из этой второй пары новых лунок будет содержать весь биопленочный материал из исходных 4 лунок образца.

3. Полное выделение РНК и оценка качества

ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция РНК осуществляется с помощью коммерческого набора для экстракции РНК, который, как утверждается, работает на биопленках. По возможности отдельные компоненты включены в Таблицу материалов. По возможности даются пояснения о механизмах, лежащих в основе каждого этапа очистки.

1. Добавьте достаточное количество реагента для защиты РНК до 750 мкл в пробирке. Перенесите весь объем в трубку для взбивания шариков объемом 2 мл, содержащую шарики 0,1 и 0,5 мм (см. Таблицу материалов). Взбивать в течение 2 1/2 мин в бисерной машине на максимальной скорости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Комбинация гранул высокой плотности 0,1 мм и 0,5 мм в сочетании с высокоскоростным перемешиванием на бисере обеспечивает тщательную гомогенизацию стенок микробных клеток.
2. Центрифуга при 16 000 х г в течение 1 минуты для гранулирования гранул. Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку, минимизировав перенос любых шариков, что облегчит шаг 3.3. Измерьте объем.
3. Добавьте равный объем буфера для лизиса РНК (~450 μл) и хорошо перемешайте. Перенесите до 800 мкл образца, избегая переноса гранул, в колонку с кремнеземом в сборной пробирке и центрифугуйте при давлении 16 000 x g в течение 30 с. Сохраните проточный поток, так как он содержит РНК, в то время как ДНК привязана к столбцу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса РНК содержит тиоцианат гуанидиния и детергент N-лауроилсаркозин для лизирования клеток. Тиоцианат гуанидиния является хаотропным агентом, который также инактивирует нуклеазы и в присутствии диоксида кремния, обнаруженного в спиновой колонке, способствует связыванию ДНК с кремнеземом¹⁸. Отсутствие этанола обеспечивает преимущественное связывание ДНК, а не РНК со спин-колонкой¹⁹ кремнезема. Целью шага 3.3 является связывание и удаление геномной ДНК. Мы хотим сохранить РНК, которая содержится в проточной части.
4. Если осталось больше пробы, перенесите колонку в новую пробирку для сбора и загрузите ее вместе с остальной пробой. Центрифуга при 16 000 x g в течение 30 с. Сохраняем проточный с РНК и соединяем с первой аликвотой.
5. Измерьте общий объем проточного потока, добавьте равный объем 100 % этанола и хорошо перемешайте. Переведите до 800 μL раствора в новую, вторую спин-колонку из диоксида кремния в сборной пробирке и центрифуге при давлении 16 000 x g в течение 30 с. Откажитесь от проточного потока.
   Примечание: Добавление этанола в раствор хаотропной соли, содержащий РНК, усиливает связывание РНК со спин-колонкой¹⁹ диоксида кремния.
6. Для растворов объемом > 800 мкл перезагрузите спин-колонку и центрифугуйте до тех пор, пока весь раствор не будет пропущен. Отбрасывайте проточный поток после каждого спина.
7. Добавьте в колонку 400 мкл промывочного буфера и центрифугируйте при давлении 16 000 x g в течение 30 с, чтобы удалить часть солей. Откажитесь от проточного потока.
8. Приготовьте реакционную смесь ДНКазы I в соответствии с инструкциями производителя и проведите обработку ДНКазой в колонке для удаления остаточной ДНК.
9. Ресуспендируйте лиофилизированную ДНКазу I в 275 мкл воды, не содержащей РНКазы, с получением раствора 1 ед/мкл. Перемешайте путем легкой инверсии.
10. Смешайте 5 мкл разбавленной ДНКазы I с 75 мкл предоставленного буфера для расщепления ДНКазы. Аккуратно перемешайте методом инверсии.
11. Добавьте 80 мкл приготовленного раствора непосредственно в матрицу колонки. Выдерживать при комнатной температуре в течение 20 минут.
12. Добавьте в колонку 400 мкл буфера для подготовки РНК и центрифугируйте при 16 000 x g в течение 30 с. Откажитесь от проточного потока.
13. Добавьте в колонку 700 мкл промывочного буфера для РНК и повторите центрифугирование. Откажитесь от проточного потока.
14. Добавьте 400 μл буфера для промывки РНК и центрифугируйте колонку в течение 2 минут, чтобы полностью удалить остатки буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует 2 различных этапа промывки для удаления загрязнений с колонны. Подготовительный буфер содержит слабую хаотропную соль, смешанную с этанолом, для удаления остаточных белков. Далее промывочный буфер используется для выполнения промывки этанолом для удаления солей. Любой оставшийся этанол должен быть удален для обеспечения эффективного элюирования РНК^19,20.
15. Осторожно переложите колонку в новую микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания.
16. Добавьте 50 мкл воды, не содержащей РНКазы, непосредственно в матрицу колонки и инкубируйте в течение 5 минут. Центрифугируйте при давлении 16 000 x g в течение 1 минуты для элюирования РНК.
17. Для дополнительной очистки для удаления ингибиторов ПЦР поместите фильтр ингибитора ПЦР в новую пробирку для сбора. Добавьте 600 мкл предоставленного раствора для приготовления ингибитора (см. Таблицу материалов).
18. Центрифуга при 8 000 х г в течение 3 мин для промывки фильтра. Переложите промытый фильтр в новую микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания.
19. Перенесите элюированную РНК из шага 3.13 в промытый фильтр и центрифугируйте при 16 000 x g в течение 3 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РНК можно использовать немедленно или хранить при температуре -80 °C.
20. Определение концентрации РНК с помощью высокочувствительной флуориметрической системы²¹.
    Примечание: Эти системы позволяют проводить чувствительное количественное определение небольшого количества РНК в растворе, специфичном для интересующей мишени.
    1. Оцените качество РНК с помощью автоматизированной системы электрофореза, которая может предоставить RIN (число целостности РНК), которое является мерой качества РНК^22,23.

4. Истощение рибосомной РНК и высокопроизводительное секвенирование

1. Подайте РНК в Центр анализа эволюции и функции генома (CAGEF) при Университете Торонто (Торонто, Канада) (https://www.cagef.utoronto.ca/) для истощения бактериальной рРНК и подготовки направленной библиотеки РНК (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Истощение бактериальной рРНК нацелено на удаление 5S, 16S и 23S рРНК²⁴.
2. Истощайте рРНК с помощью коммерческого набора для истощения бактериальных рРНК. Следуйте протоколу для ввода 10 нг - 1 мкг неповрежденной или частично деградированной общей РНК.
3. Создание библиотек секвенирования РНК с помощью набора для подготовки направленной библиотеки РНК с различными индексами, прикрепленными к каждой библиотеке.
4. Объедините эквимолярные количества каждой библиотеки РНК и выполните высокопроизводительное секвенирование с помощью 100 спаренных прочтений^{оснований 25}.

5. Оценка качества чтения секвенирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте качество чтения секвенирования с помощью бесплатной программы FastQC²⁶, доступной на бесплатной платформе с открытым исходным кодом Galaxy²⁷.

1. Перейдите в https://usegalaxy.org/. Нажмите на меню «Войти» или «Зарегистрироваться » и войдите в систему с учетными данными или создайте учетную запись.
2. Нажмите на ссылку «Загрузить данные » в левом верхнем углу страницы в меню «Инструменты» и загрузите файлы fastq.gz секвенирования. Подождите, пока имена файлов появятся в правой части страницы, под панелью «История».
3. Выберите «Контроль качества FASTQ» в меню «Инструменты», чтобы открыть список программ. Выберите FastQC, который заполнит среднюю панель экрана.
4. В разделе Короткие данные чтения из текущей истории выберите загруженные файлы fastq.gz в раскрывающемся меню.
5. Нажмите кнопку Выполнить , чтобы запустить программу.
6. Просмотрите результаты на панели «История» (Таблица 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробных инструкций по использованию Galaxy посетите страницу поддержки по адресу https://galaxyproject.org/support/.

6. Картирование прочтений секвенирования

ПРИМЕЧАНИЕ: В списке указан базовый конвейер для обрезки адаптеров и картирования чтения данных RNA-seq. Последовательности адаптеров обрезаются из операций чтения с помощью Trimmomatic²⁸. Обрезанные прочтения картируются с референсным геномом P. aeruginosa PAO1 (NC_002516.2), полученным из NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)²⁹с использованием BWA³⁰ и Samtools³¹. Для простоты пара операций чтения называется PA_1.fq и PA_2.fq; Файл чтения адаптера, подлежащий обрезке, называется adapter.fa; а референсная последовательность PAO1 называется PAO1.fasta. Все инструменты имеют открытый исходный код и работают в среде UNIX/LINUX. Настоятельно рекомендуется ознакомиться с основами UNIX/LINUX, чтобы выполнять эти команды.

1. Откройте окно в UNIX/LINUX.
2. Установите Java, Trimmomatic, BWA и Samtools.
3. Перейдите в папку, в которой находится файл trimmomatic-0.39.jar.
4. Отрежьте все последовательности адаптеров из операций чтения, введя команду:
   Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adapters.fa
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удаляются только последовательности адаптеров. Чтение не было обрезано по качеству³².
5. Переместите файл справочника PAO1.fasta в ту же папку.
6. Индексируйте ссылку с помощью BWA с помощью команды:
   Индекс Bwa PA01.fasta
7. Сопоставьте парные чтения с эталонным геномом, введя следующие 4 команды. Введите каждую команду после завершения предыдущей.
   Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
   Samtools view -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
   Samtools sort PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
   Индекс Samtools PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
8. Просмотрите статистику сопоставления, введя команду:
   Флагстат Samtools PA_R1R2_sorted.bam
   ПРИМЕЧАНИЕ:^3-я строка статистики показывает долю прочтений, которые соответствуют референсному геному.
9. Вычислите среднюю глубину чтения и ширину покрытия с помощью следующих 2 команд³³ соответственно:
   Samtools глубина -a PA_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; s+=$3}END{print s/c}'
   Глубина SamTools -а PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) total+=1}END{print (total/c)*100}'

Результаты

Общий обзор метода представлен на рисунке 1. Ранее мы использовали 8-луночные камерные стекла для выращивания биопленок P. aeruginosa и воздействия на них антибиотиков, а затем исследовали их с помощью конфокальной микроскопии в разных временных точках...

Обсуждение

Общая РНК была успешно экстрагирована из 17 различных образцов бактериальной биопленки в трех экземплярах, в результате чего был получен в общей сложности 51 образец. Сорок девять библиотек РНК объединены и успешно секвенированы. В целом, это подтверждает наши критери?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Automated electrophoresis of biomolecules
Agilent RNA 6000 pico kit	Agilent	5067-1513	High sensitivity RNA electrophoresis chip to generate a RIN
DNA/RNA Lysis Buffer	Zymo Research	D7001-1-50	A guanidinium thiocyanate and N-Lauroylsarcosine-based lysis buffer sold as part of a nucleic acid purification kit
DNA/RNA Prep Buffer	Zymo Research	D7010-2-10	A guanidine HCl and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNA/RNA Shield	Zymo Research	R1100-50	DNA and RNA preservation/protection reagent
DNA/RNA Wash Buffer	Zymo Research	D7010-3-6	A salt and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA
DNBSEQ G-400RS	MGI	G-400RS	High throughput sequencer
MGIEasy RNA Directional Library Prep Set	MGI	1000006386	Generate libraries for MGI high-throughput sequencing platforms from total RNA.
Mini-Beadbeater-96	BioSpec	1001	A high energy, high throughput cell disrupter
NEBNext rRNA Depletion Kit (bacteria)	New England Biolabs	E7850X	Efficient and specific depletion of bacterial rRNA (5S, 16S, 23S)
Nunc Lab-Tek II chamber slide system	Thermo Fisher Scientific	154534	8-well chamber slide with removable wells
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33238	Fluorometer for DNA, RNA and proteins
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32852	High sensitivity fluorometric assay to measure RNA concentration
Spin-Away Filters	Zymo Research	C1006-50-F	Silica-based spin column primarily used to bind or remove genomic DNA
Sterile inoculation loops, 1 uL	Sarstedt	86.1567.050	Sterile, disposable inoculation loops for manipulation of microorganisms
ZR BashingBead Lysis tubes	Zymo Research	S6003-50	2 mL tubes containing 0.1 and 0.5 mm bead lysis matrix for homogenizing biological samples
Zymo Spin IIICG Columns	Zymo Research	C1006-50-G	Silica-based spin column for purification of DNA and RNA
Zymo-Spin III-HRC Filters	Zymo Research	C1058-50	Remove inhibitors such as polyphenolic compounds, humic/fulvic acids, tannins, melanin, etc.
Zymobiomics DNA/RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2002	DNA and RNA dual extraction kit
Zymobiomics HRC Prep solution	Zymo Research	D4300-7-30	To be used with Zymo-Spin III-HRC Filters to remove PCR inhibitors