使用微生物滴培养系统（MMC）的自动微生物培养和适应性进化

摘要

该协议描述了如何使用微生物滴培养系统（MMC）进行自动微生物培养和适应性进化。MMC可以自动连续地培养和分培养微生物，并在线监测其生长，具有相对较高的通量和良好的并行化性，减少了劳动力和试剂消耗。

摘要

传统的微生物培养方法通常操作繁琐，通量低，效率低，消耗大量劳动力和试剂。此外，近年来开发的基于微孔板的高通量培养方法由于其溶解氧低，混合物不良以及严重的蒸发和热效应，微生物生长状况较差，实验平行化程度低。由于微液滴的诸多优点，如体积小、通量高、可控性强等，液滴基微流控技术可以克服这些问题，已应用于多种高通量微生物培养、筛选、进化的研究。然而，大多数先前的研究仍处于实验室建设和应用阶段。一些关键问题，如操作要求高，施工难度高，缺乏自动化集成技术，限制了液滴微流控技术在微生物研究中的广泛应用。在这里，基于液滴微流技术成功开发了一种自动化微生物微滴培养系统（MMC），实现了微生物液滴培养过程中所需的接种、培养、在线监测、亚培养、分选、取样等功能的集成。以野生型大肠杆菌MG1655和甲醇必需大肠杆菌菌株（MeSV2.2）为例，详细介绍了如何使用MMC进行自动化和相对高通量的微生物培养和适应性进化。该方法操作简便，消耗的人工和试剂少，实验通量高，数据并行度好，与常规培养方法相比具有很大的优势。它为科研人员开展相关微生物研究提供了一个低成本、操作友好、结果可靠的实验平台。

引言

微生物培养是微生物科学研究和工业应用的重要基础，广泛应用于微生物的分离、鉴定、重建、筛选和进化^1，2，3。传统的微生物培养方法主要采用试管、摇瓶、实心板作为培养容器，结合振荡培养箱、分光光度计、酶标仪等设备进行微生物培养、检测和筛选。但是，这些方法存在许多问题，例如操作繁琐，通量低，效率低，消耗大量劳动力和试剂。近年来开发的高通量培养方法主要基于微孔板。但微孔板溶解氧水平低，混合性能差，蒸发和热效应严重，往往导致微生物生长状态和实验平行化不良^{4，5，6，7};另一方面，它需要配备昂贵的设备，如液体处理工作站和酶标仪，以实现自动化培养和过程检测^8，9。

作为微流控技术的一个重要分支，液滴微流体近年来在传统的连续流微流体系统的基础上发展起来。它是一种离散流动微流体技术，它使用两个不混溶的液相（通常是油 - 水）来产生分散的微液滴并在其上运行¹⁰。由于微液滴具有体积小、比表面积大、内部传质率高、区室化不造成交叉污染等特点，以及液滴可控性强、通量高的优点，因此应用液滴微流控技术应用于微生物高通量培养、筛选和进化等已有多种研究¹¹.然而，仍有一系列关键问题需要使液滴微流控技术普及和广泛应用。首先，液滴微流体的操作繁琐复杂，对操作人员的技术要求很高。其次，液滴微流控技术结合了光学、机械和电气元件，需要与生物技术应用场景相关联。如果没有多学科协作，单个实验室或团队就很难建立高效的液滴微流体控制系统。第三，由于微液滴体积小（从皮升（pL）到微升（μL）），对于一些基本的微生物操作，如亚培养、分选、取样，实现液滴的精确自动化控制和实时在线检测需要很大的难度，并且难以构建一体化设备系统¹²。

为了解决上述问题，基于液滴微流控技术成功开发了一种全自动微生物微滴培养系统（MMC^）。MMC由四个功能模块组成:液滴识别模块、液滴光谱检测模块、微流控芯片模块和采样模块。通过所有模块的系统集成和控制，准确建立包括液滴生成、培养、测量（光密度（OD）和荧光）、分裂、融合、分选在内的自动化操作系统，实现微生物液滴培养过程中所需的接种、培养、监测、分培养、分选、采样等功能的集成。MMC可容纳多达200个2-3μL体积的重复液滴培养单元，相当于200个摇瓶培养单元。微滴培养系统可以满足微生物生长过程中无污染、溶解氧、混合、质能交换的要求，通过生长曲线测量、自适应进化、单因子多级分析、代谢物研究与分析（基于荧光检测）等多种集成功能，满足微生物研究的各种需求^13，14。

在这里，该协议详细介绍了如何使用MMC进行自动化和微生物培养以及适应性进化（图1）。以野生型大肠杆菌MG1655为例，以生长曲线测量和甲醇必需的大肠杆菌菌株MesV2.2¹⁵为例，证明了MMC的适应性进化。开发了MMC的操作软件，使操作非常简单明了。在整个过程中，用户需要准备初始细菌溶液，设置MMC的条件，然后将细菌溶液和相关试剂注入MMC。随后，MMC将自动执行液滴生成，识别和编号，培养和自适应进化等操作。它还将以高时间分辨率对液滴进行在线检测（OD和荧光），并在软件中显示相关数据（可以导出）。操作员可以根据结果随时停止培养过程，并提取目标液滴以进行后续实验。MMC操作简便，消耗的劳动力和试剂少，实验通量相对较高，数据并行度好，与常规培养方法相比具有显著优势。它为研究人员进行相关的微生物研究提供了一个低成本，操作友好且强大的实验平台。

研究方案

1. 仪器和软件安装

1. 选择清洁无菌环境（如洁净工作台）作为MMC的专用永久空间。在空间中稳定地安装MMC。
   注意:使MMC远离强电场，磁场和强热辐射源的干扰。避免剧烈振动影响光学检测元件。向MMC提供AC220 V，50 HZ的电源。有关 MMC 的详细信息，请参阅 材料表 和 MMC^{16 的网站}。
2. 从 MMC.zip 文件安装操作软件
   注意:请与作者联系以获取 MMC.zip文件。
   1. 创建一个专用文件夹并将 zip 文件保存在其中。
   2. 创建另一个专用文件夹作为"安装目录"。解压缩 MMC.zip并将文件保存在新文件夹中。
      注:计算机配置最好满足:（1）Windows 7 64位操作系统或更高版本;（2） CPU:i5以上;（3）内存:4GB以上;（4）硬盘:300GB以上（转速大于7200转/分或固态硬盘）。

2. 准备工作

1. 连接注射器针头（内径为0.41 mm，外径为0.71 mm），快速接头A和试剂瓶（图2C），并在121°C下高压灭菌15分钟。
   注意:灭菌期间，请略微拧下试剂瓶的盖子。每次可以再准备几个试剂瓶以供使用。
2. 使用 0.22 μm 聚偏二氟乙烯 （PVDF） 过滤器过滤 MMC 油。提前将微流控芯片（图2B）和MMC油放入洁净工作台中，并在使用前通过紫外线照射对其进行灭菌30分钟。
   注:有关快速接头A、试剂瓶、MMC油和微流控芯片的详细信息，请参阅 材料表。
3. 安装微流控芯片
   1. 打开操作室的门（图2A）并提起光纤探头。
   2. 将电场孔与电场针对齐，并将芯片轻轻放在芯片基座上。然后将两根定位柱插入定位孔中，放下光纤探头（图2D）。
   3. 根据位置号（C5-O5、C4-O4、C6-O6、C2-O2、CF-OF、C1-O1、C3-O3）将片上的快速连接器A连接到MMC的相应端口。然后关闭手术室的门。
4. 补充油瓶中的MMC油（至约80毫升），并在使用前清空废液瓶中的废液。
   注意:废液通常是有机废物。处置时请参考地区法律法规，可能会根据实验设置而有所变化。

3. MMC中的生长曲线测量

1. 初始细菌溶液的制备
   1. 按照相关的标准规定准备Luria-Bertani（LB）培养基并在121°C下高压灭菌15分钟。
      注意:LB培养基的成分:氯化钠（10克/升），酵母提取物（5克/升）和色蛋白（10克/升）。
   2. 从甘油原液中取出 大肠杆菌 MG1655菌株，并在50mL摇瓶中培养，其中10mL LB培养基在振荡培养箱（200rpm）中在37°C下培养5-8小时。
      注意:培养时间取决于特定的菌株。最好将菌株培养到对数周期/相位。
   3. 将培养的大 肠杆菌 MG1655溶液用新鲜培养基稀释至OD₆₀₀ 0.05-0.1，以获得初始细菌溶液（制备约10mL）。
2. 单击" 初始化 "以初始化 MMC。初始化界面出现后，将培养温度设置为37°C，将光电信号值设置为0.6（图3A）。初始化大约需要 20 分钟。
3. 在初始化期间打开紫外灯（波长 254 nm）。
4. 将初始细菌溶液和MMC油注入试剂瓶中。
   1. 取出洁净工作台上的灭菌试剂瓶，拧紧盖子。
   2. 使用10 mL无菌注射器从侧管的注射器针头中注入3-5 mL MMC油。缓慢倾斜和旋转试剂瓶，使油完全渗入内壁。
   3. 注入约5 mL初始细菌溶液，然后再次注入5-7 mL油，填充试剂瓶。
   4. 拉出独立的快速接头A，并将试剂瓶的快速接头A插入其快速接头B中以完成样品进样操作（图4A）。
5. 等待初始化结束，然后关闭紫外灯（波长254nm）。
6. 打开手术室的门，将试剂瓶放入金属浴中。
7. 拉出芯片的C2连接器和试剂瓶的快速连接器A。将试剂瓶的侧管连接器连接到 C2 连接器，将顶管连接器连接到 O2 连接器。然后关闭手术室的门。
8. 单击 生长曲线 ，选择生长曲线测量功能（图3A）。在参数设置界面中，输入 数字 为15，打开 OD检测 开关，将 波长 设置为600nm。单击" 开始" 以开始液滴生成。大约需要10分钟。
   注意:此处 ，数字 是指要生成的液滴数。 波长 是指要检测的OD的波长。根据实验要求设置 数字 （最大200）和 波长 （350-800nm）。
9. 当主界面上出现一个弹出窗口，提示"取出C2和O2之间的试剂瓶，然后在完成后点击确定按钮"时，打开操作室的门取出试剂瓶并连接C2和O2连接器。
10. 关闭门，单击弹出窗口中的 "确定 "按钮，自动培养液滴并检测OD值。
    注:当液滴通过光纤探头时，MMC检测外径值。因此，检测周期取决于生成的液滴数量。
11. 当生长曲线达到静止阶段时，单击" 数据导出 "按钮以导出 OD 数据。选择数据保存路径，以.csv格式导出栽培期间记录的OD值，可通过相应的软件（如Microsoft Excel）打开。然后使用映射软件（例如，EXCEL和Origin 9.0）绘制增长曲线。
    注意:在培养过程中，可以随时单击 "数据导出" 以导出所有当前液滴的OD数据。

4. MMC的适应性演进

1. 初始细菌溶液的制备
   1. 按照相关标准规定为MesV2.2准备特殊的液体介质和固体板，并在121°C高压灭菌15分钟。
      注:有关特殊介质的组件，请参阅 表1和 材料表。
   2. 使用实心板（直径= 90 mm）在37°C恒温培养箱中培养MesV2.27小时。然后选择一个独立的菌落，并将其在50mL摇瓶中培养，其中10mL特殊液体培养基在37°C振荡培养箱（200rpm）中72小时。
   3. 将培养的MesV2.2溶液用培养基稀释至OD₆₀₀为0.1-0.2（确保总体积不小于10mL），并继续在摇瓶中培养5小时，以获得初始细菌溶液。
      注意:MeSV2.2是甲醇必需 的大肠杆菌 菌株。特殊的液体介质中含有500 mmol/L甲醇，这对MesV2.2是一个强大的应力，导致生长非常缓慢。请注意，此处获得初始细菌溶液与步骤3.1中描述的不同。
2. 按照步骤 3.2、3.3 和 3.5 中的说明初始化 MMC。
3. 取出两个灭菌试剂瓶，其中一个用于初始细菌溶液，另一个用于新鲜培养基。如步骤3.4中所述，将初始细菌溶液（5 mL），新鲜培养基（12-15 mL）和MMC油注入试剂瓶中。
   注意:由于适应性进化是一个涉及多个子培养的长期过程，因此在MMC中储存尽可能多的新鲜培养基。在实验运行期间无法补充培养基。
4. 按照步骤 3.6 中的说明将两个试剂瓶安装到 MMC 中。将一个用于C2和O2连接器之间的初始细菌溶液，另一个用于C4和O4连接器之间的新鲜介质。
5. 单击 ALE 选择自适应进化的功能（图3B）。在参数设置界面中，打开 OD检测 开关。
6. 将 数字 设置为 50， 波长 设置为 600 nm， 浓度 设置为 0%， 键入 为时间， 参数 设置为 30 小时， 重复次数 设置为 99。单击" 开始" 以开始液滴生成。大约需要25分钟。
   注:此处，"浓度"是指适应性进化的化学因子的最大浓度。对于不同的液滴，可以在MMC中引入不同浓度的化学因子以提供不同的生长条件。使用以下等式计算引入的浓度:
   
   这里的"C" 是指引入液滴中的化学因子的浓度;"a"是指C4和O4连接器之间试剂瓶中化学因子的浓度;"b"是指C6和O6连接器之间试剂瓶中化学因子的浓度;"i"是指可用浓度。MMC中有八种浓度。由于这里的化学因子具有单一浓度（500 mmol/L甲醇），并且是培养基的成分之一，因此此处仅安装一个含有化学因子的试剂瓶， 并且浓度 设置为0%。 类型 是指分培养模式，分为时间模式、OD值模式、荧光模式三种类型。前者是指将液滴培养固定时间然后进行分培养，而后两种手段是将液滴培养到预定义的OD值/荧光强度，然后进行分培养。 参数 是指选择亚培养方式时所需的相关参数。 重复是指 次级栽培的数量。
7. 按照步骤3.8中的说明，取出放置在C2和O2连接器之间的试剂瓶。
8. 观察每个子培养期间液滴的最大OD值是否显着增加。如果发生增加并满足实验要求，请单击" 数据导出 "按钮以导出OD数据，如步骤3.9中所述。
   注意:在这里，子培养期取决于 参数。例如，将 类型 设置为时间， 将参数 设置为30小时时，子培养周期为30小时。在每个子培养期间，液滴都有最大OD值。通过增加最大OD值来估计适应性进化是否满足实验要求（增加取决于菌株的实际培养过程，例如增加20%以上）。
   注意:注意储存的新鲜培养基是否耗尽。如果培养基耗尽后仍未发生显著增加，则提取生长较好的液滴并进行新一轮的适应性进化。
9. 从 MMC 中提取目标液滴。
   1. 单击筛选按钮以选择液滴提取功能（图3C）。选择"收集"选项，单击目标液滴的数量，然后单击"确定"。
      注意:液滴筛选包括"收集"，"丢弃"和"提取种子溶液"。"提取种子溶液"是指在分培养操作后收集剩余的液滴¹³。
   2. 等待弹出窗口提示"请拔出CF快速接头并将其放入EP管中"。根据软件提示，将CF快速接头放入微量离心管中进行收集，然后单击 "确定" （图4D）。
   3. 1-2分钟后，软件界面将弹出一个新窗口，提示"请重新插入连接器，如果完成，请单击 确定 "。然后，向后插入CF快速接头并单击 "确定" 以使MMC继续运行（图4D）。当下一个目标液滴到达液滴识别位点时，重复4.9.2-4.9.3进行收集。
      注意:收集完所有目标液滴后，MMC将继续培养剩余的液滴。如果不需要修炼，点击停止直接终止操作。
   4. 使用2.5μL移液器提取液滴，将其滴在90mm琼脂糖板上，并用侧长为3cm的三角形玻璃铺展棒将其均匀铺展。然后在37°C恒温培养箱中培养72小时。
   5. 选择3-5个独立的菌落，并在50mL摇瓶中分别培养它们，其中10mL新鲜培养基在37°C振荡培养箱（200rpm）中48-72小时。按照相关的标准规定将培养的细菌溶液储存在甘油管中，以备后续实验之用。

5. MMC的清洁

1. 实验完成后，单击" 停止 "以停止所有操作。然后单击" 清洁 "以清洁芯片和管子。大约需要15分钟。

结果

该协议使用 大肠杆菌 MG1655和MesV2.2菌株作为示例，以展示MMC中具有自动化和相对高通量策略的微生物培养和甲醇必需的适应性进化。生长曲线测量主要用于表征微生物培养。通过自动连续亚培养和在每个亚培养过程中加入高浓度甲醇作为选择压力进行适应性进化。通过每个次培养期间液滴最大OD值的变化趋势来估计是否实现了适应性进化。MMC的可调参数和精度参数如 表 2<...

讨论

该协议介绍了如何使用微生物滴培养系统（MMC）进行自动微生物培养和长期适应性进化。MMC是一种小型化，自动化和高通量微生物培养系统。与传统的微生物高通量培养方法和仪器相比，MMC具有劳动力和试剂消耗少、操作简单、在线检测（OD和荧光）、高时间分辨率数据采集、超并行化等诸多优点。MMC还具有一些与常规液滴微流体技术不同的特殊优势，后者通常使用pL和nL液滴。以前报道的大多数?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PVDF filter membrane	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator	Haier	BCD-289BSW	For reagent storage
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
CaCl2·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20011160	Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10007216	Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MMC control
Constant temperature incubator	Shanghai qixin scientific instrument co., LTD	LRH 250	For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10008218	Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance	OHAUS	AR 3130	For reagent weighing
EP tube	Thermo Fisher	1.5 mL	For droplet collection
FeCl3·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10011928	Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For strain preservation
Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054	Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot	SANYO Electric	MLS3020	For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)	Biotopped	420322	Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate	Solarbio	K8020	Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol	MACKLIN	M813895	Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O	BIOBYING	1305715	Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20026118	Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O	GENERAL-REAGENT	G10267B	Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10001518	Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish	Corning Incorporated	90 mm	For the preparation of solid medium
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Quick connector A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask	Union-Biotech	50 mL	For microbial cultivation
Shaking incubator	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate	Solarbio	S8290	Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 mL	Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle	OUBEL Hardware Store	22G	Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone	Oxoid Ltd.	LP0042	Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer	General Electric Company	Ultrospec 3100 pro	For the measurement of OD values
Vitamin B1	Solarbio	SV8080	Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract	Oxoid Ltd.	LP0021	Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10024018	Component of the special medium for MeSV2.2.