Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC)

Riepilogo

Questo protocollo descrive come utilizzare il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC) per condurre la coltivazione microbica automatizzata e l'evoluzione adattativa. MMC può coltivare e sub-coltivare microrganismi automaticamente e continuamente e monitorare online la loro crescita con una produttività relativamente elevata e una buona parallelizzazione, riducendo il consumo di manodopera e reagenti.

Abstract

I metodi di coltivazione microbica convenzionali di solito hanno operazioni ingombranti, bassa produttività, bassa efficienza e grande consumo di manodopera e reagenti. Inoltre, i metodi di coltivazione ad alto rendimento basati su micropiastre sviluppati negli ultimi anni hanno uno scarso stato di crescita microbica e sperimentano la parallelizzazione a causa del loro basso livello di ossigeno disciolto, della scarsa miscela e della grave evaporazione e dell'effetto termico. A causa dei numerosi vantaggi delle micro-goccioline, come il piccolo volume, l'elevata produttività e la forte controllabilità, la tecnologia microfluidica a base di goccioline può superare questi problemi, che è stata utilizzata in molti tipi di ricerca di coltivazione, screening ed evoluzione microbica ad alto rendimento. Tuttavia, la maggior parte degli studi precedenti rimane nella fase di costruzione e applicazione del laboratorio. Alcune questioni chiave, come gli elevati requisiti operativi, l'elevata difficoltà di costruzione e la mancanza di tecnologia di integrazione automatizzata, limitano l'ampia applicazione della tecnologia microfluidica a goccioline nella ricerca microbica. Qui, un sistema automatizzato di coltura microbica a microgoccioline (MMC) è stato sviluppato con successo basato sulla tecnologia microfluidica delle goccioline, ottenendo l'integrazione di funzioni come l'inoculazione, la coltivazione, il monitoraggio online, la sottocoltivazione, lo smistamento e il campionamento richiesti dal processo di coltivazione microbica delle goccioline. In questo protocollo, l'Escherichia coli (E. coli) MG1655 wild-type e un ceppo di E. coli essenziale per il metanolo (MeSV2.2) sono stati presi come esempi per introdurre come utilizzare l'MMC per condurre in dettaglio la coltivazione microbica automatizzata e relativamente ad alto rendimento e l'evoluzione adattativa. Questo metodo è facile da usare, consuma meno manodopera e reagenti e ha un'elevata produttività sperimentale e una buona parallelità dei dati, che presenta grandi vantaggi rispetto ai metodi di coltivazione convenzionali. Fornisce una piattaforma sperimentale a basso costo, favorevole alle operazioni e affidabile in termini di risultati per i ricercatori scientifici per condurre ricerche microbiche correlate.

Introduzione

La coltivazione microbica è una base importante per la ricerca scientifica microbiologica e le applicazioni industriali, che è ampiamente utilizzata nell'isolamento, identificazione, ricostruzione, screening ed evoluzione dei microrganismi ^1,2,3. I metodi di coltivazione microbica convenzionali utilizzano principalmente provette, fiaschi di scuotimento e piastre solide come contenitori di coltivazione, combinati con incubatori vibranti, spettrofotometri, lettori di micropiastre e altre attrezzature per la coltivazione, il rilevamento e lo screening microbico. Tuttavia, questi....

Protocollo

1. Installazione di strumenti e software

1. Scegli un ambiente pulito e sterile (come un banco pulito) come spazio permanente dedicato per MMC. Installare MMC in modo costante nello spazio.
   NOTA: tenere l'MMC lontano dall'interferenza di forti campi elettrici, campi magnetici e forti sorgenti di radiazioni termiche. Evitare che forti vibrazioni influenzino i componenti di rilevamento ottico. Fornire l'alimentazione di AC220 V, 50 HZ all'MMC. Per informazioni dettagliate su MMC, fare riferimento alla Tabella dei materiali e al sito Web di MMC¹⁶.
2. Installare il software operativo dal file MMC.z....

Risultati

Questo protocollo utilizza E. coli MG1655 e un ceppo MeSV2.2 come esempi per dimostrare la coltivazione microbica e l'evoluzione adattativa essenziale del metanolo con una strategia automatizzata e relativamente elevata in MMC. La misurazione della curva di crescita è stata utilizzata principalmente per caratterizzare la coltivazione microbica. L'evoluzione adattativa è stata condotta mediante sottocoltura continua automatizzata e aggiungendo un'alta concentrazione di metanolo come pressione selettiva durante .......

Discussione

Questo protocollo presenta come utilizzare il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC) per eseguire la coltivazione microbica automatizzata e l'evoluzione adattiva a lungo termine. MMC è un sistema di coltivazione microbica miniaturizzato, automatizzato e ad alto rendimento. Rispetto ai metodi e agli strumenti di coltivazione microbici convenzionali ad alta produttività, MMC presenta molti vantaggi come il basso consumo di manodopera e reagenti, il funzionamento semplice, il rilevamento online (OD e fluore.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PVDF filter membrane	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator	Haier	BCD-289BSW	For reagent storage
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
CaCl2·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20011160	Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10007216	Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MMC control
Constant temperature incubator	Shanghai qixin scientific instrument co., LTD	LRH 250	For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10008218	Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance	OHAUS	AR 3130	For reagent weighing
EP tube	Thermo Fisher	1.5 mL	For droplet collection
FeCl3·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10011928	Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For strain preservation
Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054	Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot	SANYO Electric	MLS3020	For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)	Biotopped	420322	Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate	Solarbio	K8020	Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol	MACKLIN	M813895	Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O	BIOBYING	1305715	Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20026118	Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O	GENERAL-REAGENT	G10267B	Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10001518	Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish	Corning Incorporated	90 mm	For the preparation of solid medium
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Quick connector A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask	Union-Biotech	50 mL	For microbial cultivation
Shaking incubator	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate	Solarbio	S8290	Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 mL	Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle	OUBEL Hardware Store	22G	Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone	Oxoid Ltd.	LP0042	Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer	General Electric Company	Ultrospec 3100 pro	For the measurement of OD values
Vitamin B1	Solarbio	SV8080	Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract	Oxoid Ltd.	LP0021	Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10024018	Component of the special medium for MeSV2.2.