미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 이용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화

요약

이 프로토콜은 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 사용하여 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 설명합니다. MMC는 미생물을 자동으로 지속적으로 재배 및 하위 재배 할 수 있으며 상대적으로 높은 처리량과 우수한 병렬화로 온라인으로 성장을 모니터링하여 노동 및 시약 소비를 줄일 수 있습니다.

초록

기존의 미생물 재배 방법은 일반적으로 번거로운 작업, 낮은 처리량, 낮은 효율 및 노동 및 시약의 큰 소비를 가지고 있습니다. 더욱이, 최근 개발된 마이크로플레이트 기반의 고처리량 재배 방법은 낮은 용존산소, 불량한 혼합물, 심한 증발 및 열 효과로 인해 미생물 성장 상태 및 실험 병렬화가 불량하다. 작은 부피, 높은 처리량 및 강력한 제어 가능성과 같은 마이크로 액적의 많은 장점으로 인해 액적 기반 미세 유체 기술은 이러한 문제를 극복 할 수 있으며, 이는 고처리량 미생물 재배, 스크리닝 및 진화에 대한 많은 종류의 연구에 사용되었습니다. 그러나 대부분의 선행 연구는 실험실 건설 및 적용 단계에 남아 있습니다. 높은 운영 요구 사항, 높은 건설 어려움 및 자동화 된 통합 기술의 부족과 같은 몇 가지 주요 문제는 미생물 연구에서 액적 미세 유체 기술의 광범위한 적용을 제한합니다. 여기에서는 액적 미세유체 기술을 기반으로 자동화된 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)이 성공적으로 개발되어 미생물 액적 재배 과정에서 필요한 접종, 재배, 온라인 모니터링, 하위 재배, 분류 및 샘플링과 같은 기능의 통합을 달성했습니다. 본 프로토콜에서는 야생형 대장 균(E. coli) MG1655 및 메탄올-필수 대장균 균주(MeSV2.2)를 예로 들어 MMC를 사용하여 자동화되고 상대적으로 높은 처리량의 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 상세히 소개하였다. 이 방법은 작동하기 쉽고 노동력과 시약을 덜 소비하며 실험 처리량이 높고 데이터 병렬성이 우수하여 기존 재배 방법에 비해 큰 장점이 있습니다. 과학 연구자가 관련 미생물 연구를 수행 할 수있는 저렴한 비용, 작동 친화적이며 결과 신뢰할 수있는 실험 플랫폼을 제공합니다.

서문

미생물 재배는 미생물 과학 연구 및 산업 응용을위한 중요한 토대 이며, 미생물 ^1,2,3의 격리, 식별^{, 재구성,} 스크리닝 및 진화에 널리 사용됩니다. 기존의 미생물 재배 방법은 주로 시험관, 진탕 플라스크 및 고체 플레이트를 재배 용기로 사용하며 진탕 배양기, 분광 광도계, 마이크로 플레이트 판독기 및 미생물 재배, 검출 및 스크리닝을위한 기타 장비와 결합됩니다. 그러나 이러한 방법에는 번거로운 작업, 낮은 처리량, 낮은 효율 및 많은 노동 및 시약 소비와 같은 많은 문제가 있습니다. 최근 몇 년 동안 개발 된 고처리량 재배 방법은 주로 마이크로 플레이트를 기반으로합니다. 그러나 마이크로플레이트는 낮은 수준의 용존 산소, 열악한 혼합 특성, 심한 증발 및 열 효과를 가지며, 이는 종종 불량 한 성장 상태 및 미생물 4,5,6,7의 실험 병렬화로 이어진다; 반면에 자동 재배 및 공정 검출

프로토콜

1. 계기 및 소프트웨어 설치

1. 깨끗하고 멸균 된 환경 (예 : 깨끗한 벤치)을 MMC를위한 전용 영구 공간으로 선택하십시오. MMC를 공간에 꾸준히 설치하십시오.
   참고: MMC를 강한 전기장, 자기장 및 강한 방열원의 간섭으로부터 멀리하십시오. 심한 진동이 광학 감지 부품에 영향을 미치지 않도록 하십시오. MMC에 AC220 V, 50 HZ의 전원 공급 장치를 제공하십시오. MMC에 대한 자세한 내용은 자료 표 및 MMC¹⁶ 웹 사이트를 참조하십시오.
2. MMC.zip 파일에서 작업 소프트웨어를 설치합니다.
   참고: MMC.zip 파일에 대해서는 작성자에게 문의하십시오.
   1. 전용 폴더를 만들고 zip 파일을 저장하십시오.
   2. 다른 전용 폴더를 "설치 디렉토리"로 만듭니다. MMC.zip의 압축을 풀고 새 폴더에 파일을 저장합니다.
      참고: 컴퓨터 구성이 가장 적합합니다: (1) Windows 7 64비트 운영 체제 이상; (2) CPU: i5 이상; (3) 메모리: 4GB 이상; (4) 하드 디스크: 300GB 이상 (회전 속도가 7200rpm 이상 또는 솔리드 스테이트 디스크).

결과

이 프로토콜은 대장균 MG1655 및 MeSV2.2 균주를 예로 사용하여 MMC에서 자동화되고 상대적으로 높은 처리량 전략을 갖는 미생물 배양 및 메탄올 필수 적응 진화를 입증합니다. 성장 곡선 측정은 주로 미생물 재배를 특성화하기 위해 사용되었다. 적응 진화는 자동화된 연속 서브 재배에 의해 수행되었고, 각각의 서브 재배 동안 선택적 압력으로서 고농도의 메탄올을 첨가하였다. 적응 진화가 실?.......

토론

이 프로토콜은 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 사용하여 자동화된 미생물 배양 및 장기 적응 진화를 수행하는 방법을 제시합니다. MMC는 소형화, 자동화 및 고처리량 미생물 배양 시스템입니다. 기존의 미생물 고처리량 배양 방법 및 장비와 비교하여 MMC는 낮은 노동력 및 시약 소비, 간단한 조작, 온라인 검출 (OD 및 형광), 고분해능 데이터 수집 및 우수한 병렬화와 같은 많은 장점을 가지고.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PVDF filter membrane	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator	Haier	BCD-289BSW	For reagent storage
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
CaCl2·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20011160	Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10007216	Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MMC control
Constant temperature incubator	Shanghai qixin scientific instrument co., LTD	LRH 250	For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10008218	Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance	OHAUS	AR 3130	For reagent weighing
EP tube	Thermo Fisher	1.5 mL	For droplet collection
FeCl3·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10011928	Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For strain preservation
Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054	Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot	SANYO Electric	MLS3020	For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)	Biotopped	420322	Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate	Solarbio	K8020	Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol	MACKLIN	M813895	Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O	BIOBYING	1305715	Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20026118	Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O	GENERAL-REAGENT	G10267B	Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10001518	Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish	Corning Incorporated	90 mm	For the preparation of solid medium
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Quick connector A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask	Union-Biotech	50 mL	For microbial cultivation
Shaking incubator	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate	Solarbio	S8290	Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 mL	Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle	OUBEL Hardware Store	22G	Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone	Oxoid Ltd.	LP0042	Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer	General Electric Company	Ultrospec 3100 pro	For the measurement of OD values
Vitamin B1	Solarbio	SV8080	Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract	Oxoid Ltd.	LP0021	Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10024018	Component of the special medium for MeSV2.2.