果蝇成腿的解剖和免疫组织化学，以检测已识别运动神经元的神经肌肉接头处的变化

摘要

我们描述了一种解剖技术，该技术保留了神经肌肉接头的结构，并能够对成年 果蝇 腿中的运动神经元进行详细的免疫细胞化学研究。

摘要

黑腹果蝇 代表了一种遗传上可处理的模型，用于研究神经元结构和功能以及疾病状态的后续变化。特征良好的幼虫神经肌肉接头通常用于此类研究。然而，在过程中，幼虫的快速发育以及肌肉组织分解和神经系统重塑使得该模型对于研究缓慢的年龄依赖性退行性变化（如肌萎缩性侧索硬化症中发生的变化）是有问题的。或者，成年苍蝇存活90天，成年腿可用于通过角质层使用体内荧光成像来研究成年寿命 期间 的运动神经元变化。在这里，我们描述了一种腿部解剖技术与免疫细胞化学相结合，该技术允许研究已识别的成人腿部运动神经元的神经肌肉连接处的分子变化。这些技术可以与无数标记突触前和突触后结构的抗体结合使用。这些程序一起可以更完整地表征成年苍蝇中缓慢的年龄依赖性变化，并且可以应用于多个运动神经元疾病模型。

引言

运动神经元 （MN） 疾病包括一组异质性疾病，包括导致肌肉萎缩和麻痹的进行性变性，这是主要的临床表型¹。虽然罕见，全球患病率为每10万人4.5人，但预计随着人口老龄化，这一患病率将会增加²。肌萎缩性侧索硬化症 （ALS） 是最常见的 MN 疾病 （MND），通常在诊断后短时间内致命，目前尚无改善疾病的治疗方法³。MNDs具有共同的症状前期，伴有早期分子生物标志物改变和患者功能成像改变⁴。在非人类疾病模型中也观察到早期症状前细胞病理学^{5，6，7，8}。研究神经肌肉接头的早期变化对于了解MN疾病的发病机制非常重要，并可能有助于开发早期诊断和潜在的治疗方法。

果蝇中存在丰富的遗传和分子工具，用于剖析神经肌肉接头的结构和功能（NMJ，参见⁹，了解特征良好的幼虫NMJ的综述）。这些工具与较短的寿命相结合，使果蝇成为研究NMJ神经退行性变化的绝佳模型。具体而言，支配成人肌肉的MNs存在于约90天的成人寿命中，并且受到正常的衰老过程^{10，11，12，13}的影响。因此，成虫 MNs 提供了研究缓慢退行性变化的机会，与幼虫 NMJs 相比，幼虫 NMJ 在前仅存在短短约 1 周的时间段 ^{14 ， 15} 。

在这里，我们描述了一种解剖程序，该程序使我们能够对成人腿部的MNs进行免疫细胞化学分析。每条成年腿由约50 MNs支配，这些MNs突触到相关的腿部肌肉上以驱动运动。腿部解剖学、机械生理学和神经生物学已得到很好的描述^16，17，18。腿部MNs的轴突乔木以前已经通过使用二分Gal4 / UAS系统通过角质层在回填或遗传标记的细胞群中成像来表征，并且先前已经发表过成像方法¹⁹。这里介绍的解剖方法保留了轴突分支形态，并允许我们利用各种抗体来标记NMJ的不同分子成分。我们之前的工作集中在上胸（^第3）腿中定义的MN的投影上，该MN支配胫骨提肌（tilm），并显示出一致的树突模式和胸顿数。最初，我们研究了果蝇超氧化物歧化酶1（dsod1）突变体的年龄依赖性变化，并发现了与NMJ20的拆除一致的改变。这些解剖方法提供了更好地表征NMJ其他ALS模型的缓慢退行性变化，衰老和其他MN相关疾病的基础研究的机会。

图 1.解剖腿的工作流程摘要。 有关详细步骤，请参阅协议。（A，B）选择苍蝇并麻醉。（C）将苍蝇转移到甲醇中并用PBS洗涤。（D）在用解剖显微镜（〜30倍放大倍率）可视化时，在髋臼的底部移除中胸腿;比例尺 = 500 μm。（E）然后将支腿固定在3.7%甲醛/ PBS（FA）溶液中，在24孔板的孔内30分钟，然后通过PBS洗涤除去FA。（F， G， H）将腿转移到硅胶弹性体解剖托盘上，并使用斜面镊子从股骨近端取出一块角质层，同时在80x的解剖显微镜下可视化;比例尺 = 50 μm。（I）腿部在解剖后固定在FA中，然后在PBS中洗涤，然后用PBT（PBS + 0.1%非离子表面活性剂）洗涤。（J）腿部接受免疫细胞化学染色。（K，L）将支腿转移到载玻片上，在安装介质中清除，并覆盖有含有粘土垫片的盖玻片;比例尺 = 2 mm 和 500 μm。（M）腿部通过共聚焦显微镜成像。 请点击此处查看此图的放大版本。

研究方案

与该协议结合使用的制备工作溶液的程序在 表1中描述。

试剂	制备			存储
公共广播公司	通过在蒸馏水中稀释，从10倍PBS原液溶液中制作1x PBS的工作储备。 工作PBS储液的pH值应为7.2-7.4			4°C持续1个月以上，直到细菌污染可见。
断续器	1x PBS溶液，含0.1%非离子表面活性剂。			4°C持续1个月以上，直到细菌污染可见。
发	3.7%甲醛溶液由37%甲醛原液制成，并在1x PBS中稀释。			室温。每天进行清扫
	注意:作为37%储备溶液提供的甲醛是一种潜在的致癌物质，应在通风橱中稀释。
5% 新糖核酸	5%正常山羊血清稀释在PBT中。 使用的血清应与要使用的二抗的种类相匹配。			4°C数周，直到细菌污染可见

表 1.用于对成年果蝇腿进行免疫细胞化学的解决方案。

1. 组织的初始固定

1. 为每个基因型和年龄选择大约10只苍蝇。在二氧化碳下的苍蝇垫上麻醉（图1A，B）。
   注意:开始时要比必要的苍蝇多，以确保解剖后样本量足够大。
2. 使用画笔，将苍蝇转移到玻璃孔或皿中的冷甲醇中约30秒至1分钟（图1C）。甲醇溶解角质层碳氢化合物，苍蝇现在可以被淹没而不是漂浮在水溶液中。
3. 使用镊子，小心地将苍蝇转移到PBS。在冰冷的PBS中冲洗3次以除去多余的甲醇，并将苍蝇保持在PBS的冰上，直到解剖和固定。此时，解剖苍蝇并在尽可能短的时间内（<30分钟）固定。
4. 为了隔离腿部，将苍蝇转移到装满冷PBS的硅胶弹性体解剖皿中，使用两对#5 Dumont镊子去除coxa处的中胸腿，或用Vanna剪刀切割腿部（图1D）。将支腿转移到充满1 mL PBS的塑料24孔板中的孔中，并将板保持在冰上，直到所有腿都被移除并转移到孔中。
   注意:每个井至少可以容纳20条腿。
5. 用1 mL FA溶液替换PBS溶液，并在螺母器上旋转30分钟（图1E）。螺母器设置应设置为中速（17 rpm）。在此期间，确保支腿完全浸没在FA溶液中，以便充分固定。
6. 要除去FA溶液，快速在1 mL PBS 3x中洗涤，然后在1 mL PBS中再洗涤3次，每次5分钟。在下述解剖步骤之前和期间，将组织保持在冰上的1 mL PBS中。

2. 去除腿部角质层和抗体染色

1. 去除腿部角质层
   1. 解剖镊子是成功的关键。在#5超细镊子末端的两个爪子中引入轻微的平行弯曲，以提供一个斜面，允许角质层被表面抓住而不是戳，这可能会破坏组织（图1F，G）。
      注:闭合时，平行弯曲的插脚仍应在整个插脚长度上相互接触（图2）。
   2. 将支腿转移到PBS中的硅胶弹性体培养皿中进行解剖。调整腿部方向，使前侧朝上（有关腿部解剖学和方向信息，请参见 图3 ）。使用一对镊子，将胫骨段固定在硅胶弹性体皿上。使用其他镊子将斜面朝下，抓住股骨远端的角质层，然后向近端方向向大转子拉动。
   3. 保持有条不紊地去除角质层，直到整个股骨近端可见裸肌（图1F，G，H）。
      注意:仅使用镊子的斜面与腿部进行浅表接触，以避免拉扯肌肉。
   4. 解剖所有支腿后，用FA替换PBS，在固定支腿后以中速摇动螺母30分钟（图1I）。在1mL PBS中快速洗涤样品3次，然后在PBT中洗涤3次，每次5分钟（图1J）。
      注意:如果用单克隆抗体NC82（抗布鲁赫普氏仪）染色以标记活性区域，则在固定后20分钟，因为该抗原对较长时间的固定敏感。

图 2.用于解剖成人腿的改良镊子。 （A）镊子的末端弯曲，然后在底部（箭头）变平，通过在磨刀石上锉削形成斜面。（B）相比之下，未经修饰的镊子的爪子不弯曲。比例尺 = 1 mm 请单击此处查看此图的放大版本。

2. 抗体染色
   1. 为了阻断组织以进行抗体染色，用由1 mL稀释在PBT中的5%NGS组成的封闭溶液代替1mL PBT。在室温下孵育解剖的腿4小时，或在4°C下过夜，同时以中速（17 rpm）在螺母上摇动。在所有孵育过程中，除了塑料盖外，还要用密封胶带盖住孔（图1J）。
      注意:24孔板用于免疫细胞化学，而不是1.5 mL或2 mL微量离心机，因为以前尝试使用微量离心管导致腿部骨折和组织受损。
   2. 除去封闭溶液，加入300mL在新鲜封闭溶液中稀释的一抗。使用的小体积抗体应足以覆盖组织。用实验室密封胶带和塑料盖重新密封孔，并在4°C下孵育过夜，并在螺母器上以中速振荡（图1J）。用于这些研究的工作抗体试剂信息和浓度如 表2所示。
   3. 在1mLPBT中短暂洗涤一抗3次，然后3次，每次15分钟（图1J）。
      注意:如果稀释的一抗在4°C下储存长达2周，则可以保存并重复使用。
   4. 在1mL 5%NGS中再次阻断组织，在室温下或4 C过夜至少2小时（图1J）。
   5. 除去5%NGS封闭溶液，加入300μL适当稀释的荧光偶联二抗。此外，加入 1 : 2000 稀释的荧光偶联的蛋白以标记肌肉（ 图 1J ）。
   6. 对于二抗孵育，请使用实验室密封胶带和盖子密封孔。此外，用铝箔包裹板以保护荧光团免受光照。在室温下孵育6-8小时或在4°C下孵育过夜。
   7. 洗涤二抗和苷，如上述步骤 2 . 2 . 3 所述。在洗涤之间用铝箔盖板，以保护荧光团免受光照。

3. 安装腿

1. 使用镊子将腿转移到载玻片上，并将前侧向上定向。用安装介质盖住支腿（图1K，L）。
   注意:如果用剃须刀片切割底部孔加宽，则可以使用P1000移液器吸头吸出解剖的支腿。
2. 将粘土垫片添加到22x22 ^mm2 的盖玻片（#1.5厚度）中，方法是在建模粘土的小球上刮刮盖玻片角。每个角落应有少量1-2毫米厚的粘土（图1K）。
3. 要覆盖滑轨，请添加盖玻片，将粘土垫片朝向载玻片，然后小心地推动角落，直到盖玻片刚好接触到股骨表面。
4. 为了防止蒸发，用指甲油密封盖玻片的边缘，并在黑暗的地方（约10分钟）干燥，然后在4°C下储存直至成像。

4. 成像

1. 通过共聚焦显微镜成像（图1M）。包括透射光通道以更好地评估解剖的质量，并且应丢弃在感兴趣区域具有明显破坏的肌肉纤维的样品。
   1. 开始成像z-stack，以20倍放大倍率，2倍变焦，总图像深度约为40毫米，对应于股骨的厚度。对于荧光信号检测，以与奈奎斯特采样一致的分辨率捕获图像（我们使用1024 x 1024像素，停留设置为8-10 μs /像素）。信号强度应在通过调整高电压增益设置实现的线性范围内。一旦为实验中的一系列样品设置了增益设置，就不应更改它们，以便可以比较样品之间的信号强度。
2. 对于突触胸顿和其他亚细胞结构的成像，以≥60倍放大倍率捕获共聚焦图像。探测器设置应在线性范围内，而对于以较低放大倍率拍摄的图像，像素密度、停留设置和 z 深度应相似（步骤 4.1）。

结果

图 4 显示了用抗 hrp ，抗 dlg 和素染色的中胸腿的代表性示例。对于从股骨近端部分切除角质层的解剖，在肌腱附近将出现刻板状的乔木，这很容易通过自发荧光检测到。请注意，抗体渗透到腿部的距离发生在角质层被切除区域之外的短距离内（图4A）。当存在强烈的荧光信号时，可以有效地对这些区域进行成像。在低倍率（20倍，2倍变焦）下成像，可以轻松确定1）去除了多少角质层，以及2）解剖过程中是否发生了损伤。增加的放大倍率（60倍）显示刻板投影到tilm上（图4B）。我们的工作集中在一个MN上，可能来自I-MN谱系，该谱系支配股骨近端的tilm（框， 图4B 和 图4C）。进一步增加放大倍率（100倍，2倍变焦）可以有效地可视化突触布顿（图4D）。

为了研究成年NMJ随时间变化的形态变化，我们之前使用dsod1突变体作为ALS的模型。Bouton肿胀发生在相对于dsod1nulland dsod1+的老化dsod1H71Y突变体中（图5A，B）。 在幼虫NMJ中，单克隆抗体NC82通常用于标记活性区，这些结构可以在成体NMJ上轻松可视化（图5C）。弱阳性HRP轴突分支在dsod1H71Y突变体中丰富，这些分支通常显示出弱和弥漫的BRP定位（箭头）。

对于神经变性很重要，市售抗体可以检测通常在聚集体中发现的泛素化蛋白，并且我们已经在老年突变 dsod1 苍蝇的MNs末端轴突内以及肌肉内检测到泛素化聚集体（图6A）。此外，标记线粒体的抗体也可以检测随年龄变化的形态变化（图6B）。

对于某些制剂，解剖过程中的肌肉损伤会使样品无法使用。起初，这种损害可能很常见，但在实践中会有所改善。良好解剖的示例如图 7A，C所示， 而较差的解剖如图 7B，D所示。解剖不良会导致相差显微镜检测的肌肉纤维紊乱（ 图 7B ）或荧光共轭的蛋白（ 图 7D ，箭头）显示的肌肉纤维缺失。使用素标记肌肉和透射光图像的组合可以帮助检测这种肌肉损伤，这在解剖显微镜下观察时可能并不明显。

图 3. 果蝇 腿的解剖学。 （A）上胸腿前侧的示意图，其特征在于存在刷毛，与后侧突出的裸露角质层形成对比。分段式腿由髋关节 （Cx）、转子 （Tr）、股骨 （Fe）、胫骨 （Ti）、5 个跗骨节段 （Ta1-5） 和爪 （Cl） 组成，顺序从近端 （Pr） 到远端 （Di）。也需指股骨的背侧 （D） 和腹侧 （V）。比例尺 = 100 μm。（B） 包含胫骨提肌 （tilm）、胫骨压低肌 （tidm）、长肌 2 （ltm2） 和胫骨减压器 （tirm） 的股骨示意图以及股骨近端支配股骨的轴突突突。这些刻板的轴突突投影被认为来自I谱系神经母细胞¹⁶，第二次乔木是最容易通过解剖（盒装）获得的。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 4.解剖的胸上股骨揭示了支配股骨的刻板MN结构。 免疫细胞化学用于标记神经元（ HRP ），椎间盘大（ DLG ）和肌肉（苷）。Z-stack通过共聚焦显微镜成像通过整个股骨捕获，并显示为最大系列投影。（A）还包括透射光通道，以说明在解剖过程中没有发生可检测到的肌肉损伤。在20倍放大倍率下拍摄图像，比例尺=50μm。（B）已确定的与tilm相关的心轴（盒状区域，中心），比例尺= 20μm;和（C）在60倍放大倍率下，比例尺= 20μm。（D）DLG周围的胸花在野生动物中以100倍放大倍率和2倍变焦成像时很明显;比例尺 = 2 μm 请单击此处查看此图的放大版本。

图 5.步子形态中年龄依赖性变化的示例，可以使用腿部解剖技术进行检测。布顿肿胀见于老化的 dsod1H71Y 突变体。（A）来自年轻（新关闭，第0天成年）和老年（第10天）苍蝇的HRP染色布顿的代表性图像，比例尺= 1μm。（B）使用ImageJ中的测量函数从各自的基因型中量化Bouton大小。p<0.0001（具有事后图基检验的双因子方差分析）。（C）标有单克隆抗体NC82（抗布鲁赫普洛特）的突触布顿内的活性区;比例尺 = 1 μm。图修改自²⁰请点击此处查看此图的大图。

图 6.与神经退行性疾病相关的常见标志物用于果蝇腿部制剂。（A）在老化的dsod1H71Y苍蝇的末端轴突和肌肉中检测到亚细胞多泛素聚集体。使用抗多泛素（FK2）的免疫细胞化学可检测老化的dsod1H71Y^/H71Y中的穿刺（箭头），比例尺= 20μm（左）和5μm（右）。（B）肿胀的线粒体可以使用抗ATP5A检测，比例尺= 1μm。图修改自²⁰请点击此处查看此图的大图。

图 7.好解剖和差解剖的示例。 （A）不破坏潜在肌肉结构的解剖。（B）解剖效果差的例子，显示肌肉纤维磨损（箭头），不能用于分析。两个样品均通过相差显微镜成像。比例尺 = 50 μm。（ C ）通过共聚焦显微镜用 HRP （绿色）和素（蓝色）成像的良好解剖示例。（D）解剖不良的TILM缺失的背肌纤维缺失（箭头）。比例尺 = 50 μm 请单击此处查看此图的放大版本。

抗体/染色	稀释*
抗 ATP5A	1:500
反布鲁赫领航员 （nc82）	1:20
抗半胱氨酸串蛋白 （ab49）	1:50
防盘大 （4F3）	1:200
抗热血红素	1:550
抗多泛素 （FK2）	1:1000
反回购 （8D12）	1:5
山羊抗小鼠二抗	1:800
法洛丁	1:2000
	*稀释在5%的NGS中

表 2.抗体和稀释液。 这些研究中使用的抗体的商业供应商列在材料清单中。

讨论

果蝇成腿是研究神经变性的理想模型，相对简单，具有从神经母细胞谱系和刻板化模式映射的具有良好特征的MNs。一些报告以前使用腿部MNs研究神经退行性疾病^21，22。这些研究利用GFP表达线与嵌合分析与可抑制细胞标记（MARCM）相结合，通过角质层成像，并记录了一系列形态变化。通过切除角质层的免疫细胞化学对成人NMJ进行成像，能够使用可用的抗体工具箱跟踪复杂的分子变化，从而实现进一步的表征。

该方案的免疫细胞化学部分是相对标准的，可以独立于基因型实施（参见²³ ，了解用于 果蝇的一般抗体染色方法的出色描述）。此外，一旦捕获了图像并发表了详细的定量分析方法，就可以使用各种可用的ImageJ宏来确定荧光强度，轴突分支长度以及胸顿数和大小等参数（例如，参见^24，25，26）。因此，解剖技术是这里描述的主要创新。在解剖之前，苍蝇被浸没在酒精中以剥离角质层碳氢化合物。乙醇和甲醇通常用于此目的;但是，我们只使用了甲醇。解剖成功的关键有几个因素:首先，使用带有斜角的改良镊子可以与角质层进行非常浅的接触。其次，使用能够达到60-100倍总放大倍率的解剖显微镜，使角质层表面清晰可见。对于最大放大倍率较低的显微镜，大多数常见品牌都可以使用2倍物镜，与现有镜片结合使用时应该足够了。第三，初始固定步骤使角质层变脆，更容易拉开，而不会损坏下面的肌肉。在此步骤中过度固定会使整个腿过于僵硬，无法有效解剖。因此，初始固定应限制在30分钟以内。甲醛固定剂的渗透性不足以在短时间内有效地交联下层组织，因此需要第二个固定步骤。在第二次固定之前，组织应保持在冰上以防止降解和形态变化。第四，我们发现在冷敷时解剖样本也很重要，可能是出于类似的原因，角质层很脆，一小块更容易去除。

通过实践，我们发现约50%的解剖可以在没有明显组织损伤的情况下使用。虽然这个百分比相对于其他一些组织来说似乎很低，但解剖过程很快，许多腿可以在30-60分钟内处理。因此，即使最初成功率较低，也可以为每个实验组获得4-5个好样品。然而，如果基因型和/或年龄导致实质性致死，则限制可能是在任何给定时间可用的苍蝇数量。

另一个限制是，由于尺寸的原因，我们无法解剖超出股骨近端区域的腿部其他区域。因此，我们可以可靠地研究确定的MN心轴支配TILM，并且有可能在解剖时对腿部定向方式发生微小变化，从而解剖胫骨压低肌上方的角质层。然而，在解剖过程中，在不破坏轴突结构的情况下，进入腿部的其他区域已被证明更加困难。

在这里，我们提出了解剖方法，以检测使用免疫细胞化学支配tilm的已定义MNs在成人NMJ上的变化。腿部是一个简单的系统，仅由约 50 MN 支配，包含 14 块肌有良好的解剖结构。解剖的腿部制剂可以跨基因型使用，并且一套抗体可用于NMJ可视化，而无需在突变背景中构建报告基因构建体的基因型复杂储备。这种方法将能够更详细地表征NMJ对MN疾病和其他年龄相关疾病的变化。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP3991
24 well plates	Corning	3473	Hydrophobic, ultra-low attachment surface
2x objective accessory	Olympus	110AL2X	Screw-on attachment
Anti-ATP5A primary antibody	Abcam	ab14748	Mouse monoclonal
Anti-bruchpilot primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Mouse monoclonal
Anti-discs large primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Mouse monoclonal
Anti-hrp primary antibody	Jackson Immuno Research	123-605-021	Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal
Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody	Millipore Sigma	04-263	Mouse monoclonal
Confocal Microscope	Olympus	FV1000	Objectives (NA):  10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40)
Coverslips	Corning	285022	160-190 mm thickness
Dissecting forceps	Fine Science Tools	11252-00	Dumont #5SF
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Formaldehyde	Fisher Scientific	BP531-500	37% stock stabilized with methanol
Goat anti-mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	115-545-146	Alexa Fluor 488 conjugated
Goat Serum	Novus Biologicals	NB036768	0.2 mm filtered
Laboratory sealing tape	Fisher Scientific	03-448-254	Parafilm M
Methanol	Fisher Scientific	A413
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-123	76mm x 25mm
Mounting media	Molecular Probes	S36972	Slowfade Diamond mounting media
Nonionic surfactant	Acros Organics	215680010	Triton-X 100
Nutator	Fisher Scientific	S06622
Phalloidin	Invitrogen	A34055	Alexa Fluor 555- conjugated
Sharpening stone	Fine Science Tools	29008-01
Silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	2423610	Sylgard 184