Рассечение и иммуногистохимия ноги дрозофилы для обнаружения изменений в нервно-мышечном соединении для идентифицированного двигательного нейрона

Резюме

Описана методика рассечения, которая сохраняет архитектуру нервно-мышечного соединения и позволяет детально провести иммуноцитохимическое исследование двигательных нейронов у взрослой ноги дрозофилы .

Аннотация

Drosophila melanogaster представляет собой генетически поддающуюся обработке модель для изучения структуры и функции нейронов, а также последующих изменений в болезненных состояниях. Для таких исследований часто используется хорошо охарактеризованный личиночный нервно-мышечный узел. Однако быстрое развитие личинок с последующим гистолизом мышц и ремоделированием нервной системы во время метаморфоза делает эту модель проблематичной для изучения медленных возрастных дегенеративных изменений, подобных тем, которые происходят при боковом амиотрофическом склерозе. В качестве альтернативы, взрослые мухи живут в течение 90 дней, а взрослая нога может быть использована для изучения изменений двигательных нейронов в течение взрослой жизни с использованием флуоресцентной визуализации in vivo через кутикулу. Здесь мы описываем технику рассечения ног в сочетании с иммуноцитохимией, которая позволяет изучать молекулярные изменения в нервно-мышечном соединении идентифицированных двигательных нейронов взрослых ног. Эти методы могут сочетаться с множеством антител, маркирующих как пре-, так и постсинаптические структуры. Вместе эти процедуры позволяют более полно характеризовать медленные возрастные изменения у взрослых мух и могут применяться к нескольким моделям заболеваний двигательных нейронов.

Введение

Заболевания двигательных нейронов (МН) охватывают группу гетерогенных состояний, которые включают прогрессирующую дегенерацию, приводящую к истощению мышц и параличу в качестве первичного клинического фенотипа1. Несмотря на редкость с глобальной распространенностью 4,5 на 100 000 человек, ожидается, что эта распространенность будет увеличиваться со старением ^{населения2}. Боковой амиотрофический склероз (БАС) является наиболее распространенным заболеванием МН (МНД) и, как правило, приводит к летальному исходу в течение короткого времени после постановки диагноза без каких-либо существующих методов лечения, модифицирующих ^{заболевание3}. МНД объединяет затяжную предсимптоматическую фазу с ранними изменениями молекулярных биомаркеров и функциональными изменениями визуализации, наблюдаемыми у ^{пациентов4}. Ранняя предсимптоматная клеточная патология также наблюдается в моделях нечеловеческих заболеваний5,6,7,8. Изучение ранних изменений в нервно-мышечном соединении важно для понимания патогенеза болезни МН и может помочь в разработке ранней диагностики и потенциальных терапевтических средств.

У дрозофилы существует множество генетических и молекулярных инструментов для препарирования структуры и функции нервно-мышечного соединения (NMJ, см. ⁹ для обзора хорошо охарактеризованного личиночного NMJ). Эти инструменты в сочетании с короткой продолжительностью жизни делают дрозофилу отличной моделью для изучения нейродегенеративных изменений в NMJ. В частности, МН, иннервирующие взрослые мышцы, присутствуют на протяжении ~ 90-дневной взрослой жизни и подвержены нормальным процессам старения10,11,12,13. Таким образом, взрослые МН дают возможность изучать медленные дегенеративные изменения в отличие от личиночных НМЖ, которые существуют только в течение короткого ~ 1 недельного периода времени до ^{метаморфоза14,15}.

Здесь мы опишем процедуру рассечения, которая позволяет провести иммуноцитохимический анализ МН во взрослой ноге. Каждая взрослая нога иннервируется ~ 50 МН, которые синапсируются на ассоциированную мышцу ноги, чтобы управлять локомоцией. Анатомия ног, механическая физиология и нейробиология были хорошо описаны16,17,18. Аксонные беседки МН ног ранее характеризовались визуализацией через кутикулу в заполненных назад или генетически меченых клеточных популяциях с использованием двусторонней системы Gal4 / UAS, а методы визуализации были опубликованы ^ранее19. Методы диссекции, представленные здесь, сохраняют морфологию ветвления аксона и позволяют использовать разнообразный спектр антител для маркировки различных молекулярных компонентов NMJ. Наша предыдущая работа была сосредоточена на проекциях определенного MN в метаторакальной (^3-й) ноге, которая иннервирует леваторную мышцу большеберцовой кости (tilm) и показывает последовательные паттерны арборизации и количество бутонов. Первоначально мы изучили возрастно-зависимые изменения в мутантах Drosophila superoxide dismutase 1 (dsod1) и обнаружили изменения, согласующиеся с демонтажем NMJ20. Эти методы рассечения дают возможность лучше охарактеризовать медленные дегенеративные изменения в NMJ для других моделей БАС, фундаментальных исследований старения и других заболеваний, связанных с MN.

Рисунок 1. Сводка рабочего процесса по рассечению ног. Подробные инструкции см. в протоколе. (А,Б) Мух отбирают и обезболивают. (C) Мух переносят на метанол и промывают PBS. (D) Метаторакальные ножки удаляются у основания кокса при визуализации с помощью рассекающего микроскопа (увеличение ~30x); шкала = 500 мкм. (E) Затем ножки фиксируют в 3,7% растворе формальдегида/PBS (FA) в течение 30 минут в колодцах из 24-луночных пластин, а затем FA удаляют путем промывки PBS. (Ф, Г, Н) Ножки переносят в силиконовые эластомерные рассекающие лотки и удаляют кусочек кутикулы из проксимальной бедренной кости с помощью скошенных щипцов при визуализации под рассекающим микроскопом в 80 раз; шкала шкалы = 50 мкм. (I) Ноги после рассечения фиксируют в ФА и моют в ПБС, а затем в ПБТ (ПБС+ 0,1% неионного поверхностно-активного вещества). J) Ноги подвергаются иммуноцитохимическому окрашиванию. (К,Л) Ножки переносятся на стеклянную горку, очищаются в монтажных средах и покрываются крышкой, содержащей глиняные распорки; шкала стержней = 2 мм и 500 мкм. (M) Ноги визуализируются с помощью конфокальной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

протокол

Процедуры приготовления рабочих решений, используемые совместно с данным протоколом, описаны в таблице 1.

Реагент	Подготовка			Хранение
ПБС	Сделайте рабочий запас из 1x PBS из 10x PBS стокового раствора, разбавив в дистиллированной воде.  PH рабочего запаса PBS должен составлять 7,2-7,4			4 °C в течение 1+ месяцев, пока не будет видно бактериальное загрязнение.
ПБТ	1x раствор PBS с 0,1% неионным поверхностно-активным веществом.			4 °C в течение 1+ месяцев, пока не будет видно бактериальное загрязнение.
ФА	3,7% раствор формальдегида, изготовленный из 37% материала формальдегида и разбавленный в 1x PBS.			Комнатная температура. Делайте свежим каждый день вскрытия
	ВНИМАНИЕ: Формальдегид, поставляемый в виде 37% раствора, является потенциальным канцерогеном и должен быть разбавлен в вытяжном шкафу.
5% НГС	5% нормальной козьей сыворотки, разведенной в ПБТ.  Используемая сыворотка должна соответствовать видам вторичного антитела, которое будет использоваться.			4 °C в течение нескольких недель, пока не будет видно бактериальное загрязнение

Таблица 1. Растворы для проведения иммуноцитохимии стопы дрозофилы у взрослых .

1. Начальная фиксация тканей

1. Выберите примерно 10 мух для каждого генотипа и возраста. Обезболить на нахлыстовой подушке под углекислым газом (рис. 1А, В).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с большего количества мух, чем необходимо, чтобы обеспечить достаточно большой размер выборки после рассечения.
2. Используя кисть, переложите мух на холодный метанол в стеклянном колодце или блюде примерно от 30 секунд до 1 минуты (рисунок 1C). Метанол солюбилизирует кутикулярные углеводороды, и мухи теперь могут погружаться, а не плавать в водных растворах.
3. С помощью щипцов осторожно переведите мух на PBS. Промыть 3 раза в ледяном PBS, чтобы удалить избыток метанола и держать мух в PBS на льду до рассечения и фиксации. В этот момент рассекните мухи и зафиксируйте в кратчайшие сроки (<30 минут).
4. Чтобы изолировать ноги, перенесите мух в силиконовую эластомерную форму для рассечения, наполненную холодным PBS, удалите метаторакальные ножки у коксы с помощью двух пар щипцов Дюмона No5 или отрежьте ножницами Vanna (рисунок 1D). Переложите ножки в колодец в пластиковой пластине из 24 скважин, заполненной 1 мл PBS, и держите пластину на льду до тех пор, пока все ножки не будут удалены и перенесены в колодцы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый колодец может вместить не менее 20 ножек.
5. Замените раствор PBS 1 мл раствора FA и поверните на нутаторе в течение 30 минут (рисунок 1E). Настройка нутатора должна быть установлена на средней скорости (17 об/мин). Убедитесь, что ноги полностью погружены в раствор FA в течение этого времени для адекватной фиксации.
6. Чтобы удалить раствор ФА, быстро промойте в 1 мл PBS 3x с последующим дополнительным 3 промывками в течение 5 минут каждая в 1 мл PBS. Удерживать ткани в 1 мл PBS на льду до и во время этапов рассечения, описанных ниже.

2. Удаление кутикулы ноги и окрашивание антителами

1. Удаление кутикулы ножки
   1. Рассекающие щипцы имеют решающее значение для успеха. Введите небольшие параллельные изгибы в оба зубца в конце сверхтонких щипцов No 5, чтобы обеспечить скос, который позволяет захватывать кутикулу поверхностно, а не тыкать, что может испортить ткань (рисунок 1F, G).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зубцы, согнутые параллельно, должны по-прежнему контактировать друг с другом по всей длине зубца при закрытии (рисунок 2).
   2. Переложите ножки на силиконовую эластомерную посуду в PBS для рассечения. Ориентируйте ногу так, чтобы передняя сторона была обращена вверх (см. Рисунок 3 для анатомии ноги и информации об ориентации). Используя одну пару щипцов, прижмите сегмент большеберцовой кости к силиконовой эластомерной посуде. Используя другие щипцы, удерживаемые скосом вниз, схватите кусок кутикулы на дистальном конце бедренной кости и потяните в проксимальном направлении к трохантеру.
   3. Продолжайте методично удалять кутикулу до тех пор, пока голая мышца не будет видна по всему проксимальному концу бедренной кости (рисунок 1F, G, H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Устанавливайте только поверхностный контакт с ногами, используя скошенную сторону щипцов, чтобы избежать вытягивания мышц.
   4. После того, как все ноги будут рассечены, замените PBS на FA на постфиксирующие ноги в течение 30 минут с встряхиванием на нутаторе на средней скорости (рисунок 1I). Промывайте образцы в 1 мл PBS в 3 раза быстрее, а затем 3 раза в течение 5 минут каждый в PBT (рисунок 1J).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При окрашивании моноклональным антителом NC82 (анти-брухпилот) для маркировки активных зон, постфиксируют в течение 20 минут, так как этот антиген чувствителен к более длительным фиксациям.

Рисунок 2. Модифицированные щипцы, используемые для рассечения ног взрослых. (А) Концы щипцов изгибаются, а затем сплющиваются внизу (стрелка), создавая скос путем подачи на заточенный камень. (B) Напротив, зубцы неизмененных щипцов не изогнуты. Шкала = 1 мм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Окрашивание антителами
   1. Чтобы блокировать ткани для окрашивания антителами, замените 1 мл ПБТ блокирующим раствором, состоящим из 1 мл 5% NGS, разбавленного в ПБТ. Инкубировать рассеченные ножки в течение 4 часов при комнатной температуре или на ночь при 4 °C, раскачивая на нутаторе на средней скорости (17 об/мин). Во время всех инкубаций закрывайте колодцы уплотнительной лентой в дополнение к пластиковой крышке (рисунок 1J).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для иммуноцитохимии используются 24 пластины скважины, а не микроцентрифуга 1,5 мл или 2 мл, поскольку предыдущие попытки использовать микроцентрифужные трубки приводили к переломам ног и повреждению тканей.
   2. Удалить блокирующий раствор и добавить 300 мл первичных антител, разведенных в свежем блокирующем растворе. Небольшого объема используемых антител должно быть достаточно для покрытия тканей. Повторно запечатывают скважины лабораторной уплотнительной лентой и пластиковой крышкой и инкубируют в течение ночи при 4 °C с встряхиванием на нутаторе на средней скорости (рисунок 1J). Информация о рабочем реагенте антител и концентрациях, используемых в этих исследованиях, описаны в таблице 2.
   3. Промывайте первичные антитела в 1 мл ПБТ в течение 3 раз ненадолго, а затем 3 раза в течение 15 минут каждое (рисунок 1J).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавленные первичные антитела могут быть сохранены и повторно использованы при хранении при 4 °C в течение 2 недель.
   4. Снова блокируют ткани в 1 мл 5% NGS в течение не менее 2 часов при комнатной температуре или на ночь при 4 C (рисунок 1J).
   5. Удалите 5% раствор, блокирующий NGS, и добавьте 300 мкл соответствующих разбавленных флуоресцентных конъюгированных вторичных антител. Кроме того, добавьте 1:2000 разбавления флуоресцентно-конъюгированного фаллоидина для маркировки мышц (рисунок 1J).
   6. Для вторичной инкубации антител запечатывают колодцы лабораторной герметизационной лентой и крышкой. Также оберните пластины в алюминиевую фольгу для защиты флуорофоров от света. Инкубировать в течение 6-8 часов при комнатной температуре или на ночь при 4 °C.
   7. Промывайте вторичные антитела и фаллоидин, как описано на этапе 2.2.3 выше. Накладки с алюминиевой фольгой между смывами для защиты флуорофоров от света.

3. Крепление ножек

1. Переведите ноги на горку с помощью щипцов и ориентируйте переднюю сторону вверх. Накройте ножки монтажным носителем (рисунок 1K, L).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассеченные ножки могут быть аспирированы наконечником пипетки P1000, если нижнее отверстие расширено путем резки лезвием бритвы.
2. Добавьте глиняные распорки к обшивке размером ^{22x22 мм2} (толщина No 1,5), соскребая углы крышки через небольшой шарик из моделирующей глины. Каждый уголок должен иметь небольшое количество глины толщиной 1-2 мм (рисунок 1К).
3. Чтобы покрыть горку, добавьте крышку с глиняными распорками, обращенными к слайду, и осторожно надавите на углы, пока крышка не коснется поверхности бедренной кости.
4. Чтобы предотвратить испарение, запечатайте края обложек лаком для ногтей и дайте высохнуть в темном месте (около 10 минут) перед хранением при 4 °C до получения изображения.

4. Визуализация

1. Изображение с помощью конфокального микроскопа (рисунок 1M). Включите проходящий световой канал для лучшей оценки качества рассечения и образцы с явно нарушенными мышечными волокнами в интересующей области должны быть отброшены.
   1. Начните съемку z-стеков с 20-кратным увеличением с 2-кратным зумом и общей глубиной изображения ~ 40 мм, соответствующей толщине бедренной кости. Для обнаружения флуоресцентного сигнала захватывайте изображения с разрешениями, соответствующими выборке Найквиста (мы используем 1024 x 1024 пикселей с настройкой выдержки 8-10 мкс / пиксель). Интенсивность сигнала должна быть в линейном диапазоне, который достигается путем регулировки настроек усиления высокого напряжения. После того, как настройки усиления установлены для серии образцов в эксперименте, их не следует изменять таким образом, чтобы можно было сравнивать интенсивность сигнала между образцами.
2. Для визуализации синаптических бутонов и другой субклеточной структуры захватывайте конфокальные изображения с увеличением ≥60x. Настройки детектора должны находиться в линейном диапазоне, в то время как плотность пикселей, настройки выдержки и z-глубина должны быть одинаковыми для изображений, снятых при меньшем увеличении (шаг 4.1).

Результаты

На рисунке 4 показан репрезентативный пример метаторакальной ноги, окрашенной анти-hrp, анти-dlg и фаллоидином. Для рассечений, которые удаляют кутикулу из проксимальной части бедренной кости, стереотипные беседки будут очевидны вблизи сухожилия, которое легко обнаруживается автофлуоресценцией. Обратите внимание, что проникновение антител в ногу происходит на небольшом расстоянии за пределами области, в которой была удалена кутикула (рисунок 4А). Эти области могут быть эффективно визуализированы при наличии сильного флуоресцентного сигнала. Визуализация при низком увеличении (20x с 2-кратным зумом) позволяет легко определить, 1) сколько кутикулы удалено, и 2) произошло ли повреждение во время рассечения. Увеличенное увеличение (60x) показывает стереотипные проекции на tilm (рисунок 4B). Наша работа была сосредоточена на одном MN, вероятно, полученном из линии I-MN, которая иннервирует тилм в проксимальной бедренной кости (коробка, рисунок 4B и рисунок 4C). Дальнейшее увеличение увеличения (100x с 2-кратным зумом) позволяет эффективно визуализировать синаптические бутоны (рисунок 4D).

Для изучения морфологических изменений у взрослого NMJ с течением времени мы ранее использовали мутанты dsod1 в качестве модели БАС. Отек бутона возникает у возрастных мутантов ^dsod1H71Y относительно ^dsod1nulland dsod1⁺ (рисунок 5A, B). В личиночном NMJ моноклональное антитело NC82 часто используется для маркировки активных зон, и эти структуры могут быть легко визуализированы на взрослом NMJ (рисунок 5C). Слабоположительные ветви аксонов HRP в изобилии встречаются у мутантов ^dsod1H71Y, и эти ветви часто показывают слабую и диффузную локализацию BRP (стрелки).

Важные для нейродегенерации коммерчески доступные антитела могут обнаруживать убиквитинированные белки, часто встречающиеся в агрегатах, и мы обнаружили убиквитинированные агрегаты в терминальных аксонах MN у возрастных мутантных мух dsod1 , а также в мышцах (рисунок 6A). Кроме того, антитела, маркирующие митохондрии, также могут обнаруживать морфологические изменения с возрастом (рисунок 6B).

Для некоторых препаратов повреждение мышц во время рассечения делает образец непригодным для использования. Поначалу такое повреждение может быть обычным явлением, но улучшение происходит с практикой. Примеры хороших рассечений показаны на рисунке 7A, C, в то время как плохие рассечения показаны на рисунке 7B, D. Плохие рассечения вызывают дезорганизацию мышечных волокон, обнаруженную с помощью фазово-контрастной микроскопии (рисунок 7B) или отсутствующие мышечные волокна, визуализированные флуоресцентно-конъюгированным фаллоидином (рисунок 7D, стрелка). Сочетание использования фаллоидина для маркировки мышц и передаваемых световых изображений может помочь обнаружить такие повреждения мышц, которые могут быть неочевидны при просмотре под рассекающим микроскопом.

Рисунок 3. Анатомия ноги дрозофилы . (A) Диаграмма передней стороны метаторакальной ноги, характеризующаяся наличием щетинок в отличие от выступающей обнаженной кутикулы, присутствующей на задней стороне. Сегментированная нога состоит из коксы (Cx), трохантера (Tr), бедренной кости (Fe), большеберцовой кости (Ti), 5 предплюсневых сегментов (Ta1-5) и когтей (Cl) в порядке от проксимального (Pr) до дистального (Di). Также показаны дорсальная (D) и вентральная (V) стороны бедренной кости. Шкала бар = 100 мкм. (B) Диаграмма бедренной кости, содержащей леватор большеберцовой кости (tilm), депрессор большеберцовой кости (tidm), длинную сухожильную мышцу 2 (ltm2) и большеберцовую редуктор (tirm) мышцы и проекции аксонов в проксимальной бедренной кости, иннервирующие tilm. Предполагается, что эти стереотипные аксональные проекции получены из нейробластов ^I-lineage16, а вторая арборизация является наиболее легкодоступной путем рассечения (коробочной). Шкала шкалы = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4. Рассеченная метаторакальная бедренная кость выявила стереотипную архитектуру МН, иннервирующую тилм. Иммуноцитохимия использовалась для маркировки нейронов (HRP), больших дисков (DLG) и мышц (фаллоидин). Z-стеки были захвачены конфокальной микроскопией через всю бедренную кость и показаны как максимальная последовательная проекция. (A) Был также включен проходящий световой канал, чтобы проиллюстрировать отсутствие обнаруживаемых повреждений мышц во время рассечения. Изображение было получено при 20-кратном увеличении, шкала шкалы = 50 мкм. (B) Идентифицированные беседки, связанные с тилмом (квадратная область, в центре), шкала шкалы = 20 мкм; и (C) при 60-кратном увеличении, шкала шкалы = 20 мкм. (D) DLG, окружающий бутоны, был очевиден у диких животных при изображении с 100-кратным увеличением с 2-кратным зумом; шкала = 2 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5. Пример возрастно-зависимых изменений в морфологии бутона, которые могут быть обнаружены с помощью метода рассечения ног. Отек Бутона наблюдается у мутантов в возрасте dsod1H71Y. (A) Репрезентативные изображения окрашенных HRP бутонов молодых (недавно эклозированных, день 0 взрослых) и старых (день 10) мух, шкала бар = 1 мкм. (B) Размеры бутона были количественно определены по соответствующим генотипам с использованием функции измерения в ImageJ. p<0.0001 (2-полосная ANOVA с пост-хок тукейским тестом). (C) Активные зоны в синаптических бутонах, меченные моноклональным антителом NC82 (анти-брухпилот); шкала = 1 мкм. Рисунок изменен от20Пожалуйста нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6. Общие маркеры, связанные с нейродегенеративными заболеваниями, используются в препаратах для ног дрозофилы. (A) Субклеточные полиубиквитинированные агрегаты обнаруживаются в концевых аксонах и мышцах возрастных мух dsod1H71Y. Иммуноцитохимия с использованием антиполиубиквитина (FK2) обнаруживает пункту (стрелки) в возрасте ^{dsod1H71Y/H71Y}, шкала бар = 20 мкм (слева) и 5 мкм (справа). (B) Опухшие митохондрии могут быть обнаружены с использованием анти-ATP5A, шкала бар = 1 мкм. Рисунок изменен от20Пожалуйста нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7. Примеры хороших и плохих рассечений. (A) Рассечение, которое не нарушило основную мышечную архитектуру. (B) Пример плохого рассечения, которое показало изношенные мышечные волокна (стрелка) и не могло быть использовано для анализа. Оба образца были получены с помощью фазово-контрастной микроскопии. Шкала бара = 50 мкм. (C) Пример хорошего рассечения, полученного с помощью конфокальной микроскопии с HRP (зеленый) и фаллоидином (синий). (D) Плохое рассечение отсутствующих дорсальных мышечных волокон TILM отсутствует (стрелка). Шкала = 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Антитело/Пятно	Разбавление*
Анти-АТФ5А	1:500
Анти-брухпилот (nc82)	1:20
Антицистеиновый струнный белок (ab49)	1:50
Антидиски большие (4F3)	1:200
Анти-hrp	1:550
Антиполиубиквитин (FK2)	1:1000
Анти-репо (8D12)	1:5
Козье антимышечное вторичное антитело	1:800
Фаллоидин	1:2000
	* Разбавлять в 5% NGS

Таблица 2. Антитела и разведения. Коммерческие поставщики антител, используемых в этих исследованиях, перечислены в Перечне материалов.

Обсуждение

Взрослая нога дрозофилы является идеальной моделью для изучения нейродегенерации, учитывая относительную простоту с хорошо охарактеризованными МН, отображенными из линий нейробластов и стереотипных моделей арборизации. В нескольких отчетах ранее использовались МН ног для изучения нейродегенеративных ^{заболеваний21,22}. В этих исследованиях использовались GFP-экспрессирующие линии в сочетании с мозаичным анализом с репрессивным клеточным маркером (MARCM) для изображения через кутикулу и документировался ряд морфологических изменений. Визуализация взрослых НМЖ с помощью иммуноцитохимии с резецированной кутикулой позволяет проводить дальнейшую характеристику с возможностью отслеживания сложных молекулярных изменений с использованием набора доступных антител.

Иммуноцитохимическая часть этого протокола является относительно стандартной и может быть реализована независимо от генотипа (см. ²³ для отличного описания общих методов окрашивания антител для использования с дрозофилой). Кроме того, такие параметры, как интенсивность флуоресценции, длина ветви аксона, а также количество и размер бутона, могут быть определены с использованием различных доступных макросов ImageJ после захвата изображений и публикации подробных методов количественного анализа (например, см. 24,25,26). Таким образом, техника рассечения является основным новшеством, описанным здесь. Перед рассечением мух погружают в спирт, чтобы удалить кутикулярные углеводороды. Для этой цели обычно используются как этанол, так и метанол; однако мы использовали только метанол. Решающее значение для успеха рассечения имеют несколько факторов: во-первых, использование модифицированных щипцов со скосом позволяет очень поверхностно контактировать с кутикулой. Во-вторых, с помощью рассекающего микроскопа, способного к 60-100-кратному общему увеличению, чтобы поверхность кутикулы была хорошо видна. Для микроскопов с меньшим максимальным увеличением для большинства распространенных брендов доступны 2-кратные объективы, которых должно быть достаточно в сочетании с существующими линзами. В-третьих, начальный этап фиксации делает кутикулу хрупкой и ее легче оттянуть, не повреждая мышцы под ней. Чрезмерная фиксация на этом этапе делает всю ногу слишком жесткой для эффективного рассечения. Поэтому первоначальная фиксация должна быть ограничена 30 минутами. Формальдегидный фиксатор не будет проникать достаточно, чтобы эффективно сшивать подлежащую ткань в течение этого короткого периода, и, таким образом, необходим второй этап фиксации. До второй фиксации ткани следует держать на льду, чтобы предотвратить деградацию и изменение морфологии. В-четвертых, мы обнаружили, что рассечение образцов в то время, когда холод также важен, вероятно, по тем же причинам, что кутикула хрупкая, и небольшой кусочек может быть легче удален.

С практикой мы обнаруживаем, что ~ 50% рассечений будут пригодны для использования при отсутствии заметного повреждения тканей. Хотя этот процент может показаться низким по сравнению с некоторыми другими тканями, процедура рассечения проходит быстро, и многие ноги могут быть обработаны за 30-60 минут. Поэтому, даже если показатели успеха изначально низкие, можно получить 4-5 хороших образцов для каждой экспериментальной группы. Однако ограничением может быть количество мух, доступных в любой момент времени, если генотипы и/или возраст приводят к значительной летальности.

Другим ограничением является то, что мы не смогли рассечь другие области ноги за пределами проксимальной области бедренной кости из-за размера. Таким образом, мы можем достоверно изучить идентифицированные беседки MN, иннервирующие TILM, и можно рассечь кутикулу над большеберцовой депрессорной мышцей с небольшими изменениями в том, как ориентирована нога при рассечении. Тем не менее, доступ к другим областям ноги оказался более трудным без нарушения аксональной архитектуры во время рассечения.

Здесь мы представляем методы диссекции для обнаружения изменений во взрослом NMJ для определенных МН, иннервирующих тилм с использованием иммуноцитохимии. Нога полезна как простая система, иннервируемая всего ~50 МН и содержащая 14 мышц с хорошо описанной анатомией. Препарат для рассеченной ноги может быть использован для всех генотипов, и набор антител доступен для визуализации NMJ без необходимости создания генотипически сложных запасов репортерных генных конструкций в мутантных фонах. Такой подход позволит более детально охарактеризовать изменения в НМЮ для заболеваний МН и других возрастных состояний.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP3991
24 well plates	Corning	3473	Hydrophobic, ultra-low attachment surface
2x objective accessory	Olympus	110AL2X	Screw-on attachment
Anti-ATP5A primary antibody	Abcam	ab14748	Mouse monoclonal
Anti-bruchpilot primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Mouse monoclonal
Anti-discs large primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Mouse monoclonal
Anti-hrp primary antibody	Jackson Immuno Research	123-605-021	Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal
Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody	Millipore Sigma	04-263	Mouse monoclonal
Confocal Microscope	Olympus	FV1000	Objectives (NA):  10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40)
Coverslips	Corning	285022	160-190 mm thickness
Dissecting forceps	Fine Science Tools	11252-00	Dumont #5SF
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Formaldehyde	Fisher Scientific	BP531-500	37% stock stabilized with methanol
Goat anti-mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	115-545-146	Alexa Fluor 488 conjugated
Goat Serum	Novus Biologicals	NB036768	0.2 mm filtered
Laboratory sealing tape	Fisher Scientific	03-448-254	Parafilm M
Methanol	Fisher Scientific	A413
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-123	76mm x 25mm
Mounting media	Molecular Probes	S36972	Slowfade Diamond mounting media
Nonionic surfactant	Acros Organics	215680010	Triton-X 100
Nutator	Fisher Scientific	S06622
Phalloidin	Invitrogen	A34055	Alexa Fluor 555- conjugated
Sharpening stone	Fine Science Tools	29008-01
Silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	2423610	Sylgard 184