Dissezione e immunoistochimica della gamba adulta di Drosophila per rilevare i cambiamenti alla giunzione neuromuscolare per un motoneurone identificato

Riepilogo

Descriviamo una tecnica di dissezione che preserva l'architettura della giunzione neuromuscolare e consente uno studio immunocitochimico dettagliato dei motoneuroni nella gamba adulta di Drosophila .

Abstract

Drosophila melanogaster rappresenta un modello geneticamente trattabile per studiare la struttura e la funzione neuronale e i successivi cambiamenti negli stati patologici. La giunzione neuromuscolare larvale ben caratterizzata viene spesso utilizzata per tali studi. Tuttavia, il rapido sviluppo larvale seguito dall'istolisi muscolare e dal rimodellamento del sistema nervoso durante la metamorfosi rende questo modello problematico per lo studio di cambiamenti degenerativi lenti dipendenti dall'età come quelli che si verificano nella sclerosi laterale amiotrofica. In alternativa, le mosche adulte vivono per 90 giorni e la gamba adulta può essere utilizzata per studiare i cambiamenti dei motoneuroni nel corso della vita adulta utilizzando l'imaging fluorescente in vivo attraverso la cuticola. Qui, descriviamo una tecnica di dissezione delle gambe accoppiata con l'immunocitochimica, che consente lo studio dei cambiamenti molecolari alla giunzione neuromuscolare dei motoneuroni delle gambe adulti identificati. Queste tecniche possono essere accoppiate con una miriade di anticorpi che etichettano sia le strutture pre- che post-sinaptiche. Insieme, queste procedure consentono una caratterizzazione più completa dei cambiamenti lenti dipendenti dall'età nelle mosche adulte e possono essere applicate su più modelli di malattia del motoneurone.

Introduzione

Le malattie dei motoneuroni (MN) comprendono un gruppo di condizioni eterogenee che includono la degenerazione progressiva che porta allo spreco muscolare e alla paralisi come fenotipo clinico ^primario1. Sebbene rara con una prevalenza globale di 4,5 per 100.000, questa prevalenza dovrebbe aumentare con l'invecchiamento della ^popolazione2. La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è la malattia MN (MND) più comune ed è in genere fatale entro un breve periodo di tempo dalla diagnosi senza trattamenti modificanti la malattia esistenti ^disponibili3. Le MND condividono in comune una fase presintomatica prolungata con cambiamenti precoci dei biomarcatori molecolari e cambiamenti di imaging funzionale osservati nei ^pazienti4. La patologia cellulare presintomatica precoce è osservata anche in modelli di malattia non umana5,6,7,8. Lo studio dei cambiamenti precoci alla giunzione neuromuscolare è importante per comprendere la patogenesi della malattia MN e può aiutare a sviluppare diagnosi precoce e potenziali terapie.

Una ricchezza di strumenti genetici e molecolari esiste in Drosophila per sezionare la struttura e la funzione della giunzione neuromuscolare (NMJ, ^vedi9 per una revisione del NMJ larvale ben caratterizzato). Questi strumenti combinati con una breve durata della vita rendono Drosophila un modello eccellente per studiare i cambiamenti neurodegenerativi presso l'NMJ. In particolare, i MN che innervano i muscoli adulti sono presenti per tutta la durata della vita adulta di ~ 90 giorni e sono soggetti a normali processi di invecchiamento10,11,12,13. Le MN adulte offrono quindi l'opportunità di studiare i cambiamenti degenerativi lenti in contrasto con gli NMJ larvali che esistono solo per un breve periodo di tempo di ~ 1 settimana prima della metamorfosi14,15.

Qui, descriviamo una procedura di dissezione che ci consente di condurre analisi immunocitochimiche di MN nella gamba adulta. Ogni gamba adulta è innervata da ~ 50 MN, che sinapsi sulla gamba associata muscolare per guidare la locomozione. L'anatomia delle gambe, la fisiologia meccanica e la neurobiologia sono state ben ^{descritte16,17,18}. I perni assonali delle MN delle gambe sono stati precedentemente caratterizzati dall'imaging attraverso la cuticola in popolazioni cellulari riempite o geneticamente marcate utilizzando il sistema bipartito Gal4 / UAS e i metodi di imaging sono stati pubblicati in ^precedenza19. I metodi di dissezione qui presentati preservano la morfologia della ramificazione assonale e ci permettono di sfruttare una vasta gamma di anticorpi per etichettare diversi componenti molecolari del NMJ. Il nostro lavoro precedente si è concentrato sulle proiezioni di un MN definito nella gamba metatoracica (^3a), che innerva il muscolo elevatore della tibia (tilm) e mostra modelli di arborizzazione coerenti e numeri di bouton. Inizialmente abbiamo studiato i cambiamenti dipendenti dall'età nei mutanti della Drosophila superossido dismutasi 1 (dsod1) e abbiamo trovato alterazioni coerenti con lo smantellamento della NMJ20. Questi metodi di dissezione offrono l'opportunità di caratterizzare meglio i cambiamenti degenerativi lenti al NMJ per altri modelli di SLA, studi di base sull'invecchiamento e altre malattie associate al MN.

Figura 1. Riepilogo del flusso di lavoro per sezionare le gambe. Vedere protocollo per i passaggi dettagliati. (A,B) Le mosche vengono selezionate e anestetizzate. (C) Le mosche vengono trasferite al metanolo e lavate con PBS. (D) Le zampe metatoraciche vengono rimosse alla base della coxa mentre vengono visualizzate con un microscopio di dissezione (ingrandimento ~ 30x); barra della scala = 500 μm. (E) Le zampe vengono quindi fissate in una soluzione di formaldeide/PBS (FA) al 3,7% per 30 minuti all'interno di pozzetti di piastre a 24 pozzetti e quindi la FA viene rimossa mediante lavaggi con PBS. (F, G, H) Le gambe vengono trasferite su vassoi di dissezione in elastomero siliconico e un pezzo di cuticola viene rimosso dal femore prossimale usando una pinza smussata mentre viene visualizzato sotto un microscopio di dissezione a 80x; barra della scala = 50 μm. (I) Le gambe sono post-dissezione fissate in FA e lavate in PBS e poi PBT (PBS + 0,1% tensioattivo non ionico). (J) Le gambe sono sottoposte a colorazione immunocitochimica. (K,L) Le gambe vengono trasferite su una diapositiva di vetro, ripulite in supporti di montaggio e coperte con un coperchio contenente distanziali di argilla; barre di scala = 2 mm e 500 μm. (M) Le gambe sono fotografate al microscopio confocale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Le procedure per la preparazione delle soluzioni di lavoro utilizzate in combinazione con questo protocollo sono descritte nella tabella 1.

Reagente	Preparazione			Immagazzinamento
PBS	Crea uno stock di lavoro di 1x PBS da una soluzione madre PBS 10x diluendo in acqua distillata.  Il pH dello stock PBS funzionante dovrebbe essere 7,2-7,4			4 °C per 1+ mesi fino a quando la contaminazione batterica è visibile.
PBT	1x soluzione PBS con tensioattivo non ionico allo 0,1%.			4 °C per 1+ mesi fino a quando la contaminazione batterica è visibile.
FA	Soluzione di formaldeide al 3,7% ottenuta da un brodo di formaldeide al 37% e diluita in 1x PBS.			Temperatura ambiente. Rendere fresco ogni giorno di dissezione
	ATTENZIONE: La formaldeide fornita come soluzione madre al 37% è un potenziale cancerogeno e deve essere diluita in una cappa aspirante.
5% NGS	5% siero di capra normale diluito in PBT.  Il siero utilizzato deve corrispondere alla specie dell'anticorpo secondario da utilizzare.			4 °C per diverse settimane fino a quando la contaminazione batterica è visibile

Tabella 1. Soluzioni per l'esecuzione di immunocitochimica della gamba Adulta Drosophila.

1. Fissazione iniziale dei tessuti

1. Seleziona circa 10 mosche per ogni genotipo ed età. Anestetizzare su una piattaforma sotto anidride carbonica (Figura 1A, B).
   NOTA: iniziare con più mosche del necessario per garantire una dimensione del campione abbastanza grande dopo la dissezione.
2. Utilizzando un pennello, trasferire le mosche al metanolo freddo in un pozzetto di vetro o in un piatto per circa 30 secondi a 1 minuto (Figura 1C). Il metanolo solubilizza gli idrocarburi cuticolari e le mosche possono ora essere immerse piuttosto che galleggiare in soluzioni acquose.
3. Con la pinza, trasferire con attenzione le mosche a PBS. Risciacquare 3 volte in PBS ghiacciato per rimuovere il metanolo in eccesso e mantenere le mosche in PBS sul ghiaccio fino alla dissezione e alla fissazione. A questo punto, seziona le mosche e ripara nel più breve tempo possibile (<30 minuti).
4. Per isolare le gambe, trasferire le mosche su un piatto di dissezione in elastomero siliconico riempito con PBS freddo, rimuovere le gambe metatoraciche alla coxa usando due paia di pinze Dumont #5 o tagliare le gambe con forbici Vanna (Figura 1D). Trasferire le gambe in un pozzo in una piastra di plastica a 24 pozzetti riempita con 1 mL di PBS e mantenere la piastra sul ghiaccio fino a quando tutte le gambe non vengono rimosse e trasferite nei pozzetti.
   NOTA: Ogni pozzetto può contenere almeno 20 gambe.
5. Sostituire la soluzione PBS con 1 mL di soluzione FA e ruotare su un nutatore per 30 minuti (Figura 1E). L'impostazione del nutator deve essere impostata a una velocità media (17 rpm). Assicurarsi che le gambe siano completamente immerse in soluzione FA durante questo periodo per un'adeguata fissazione.
6. Per rimuovere la soluzione fa, lavare in 1 mL di PBS 3x rapidamente seguito da altri 3 lavaggi per 5 minuti ciascuno in 1 mL di PBS. Trattenere i tessuti in 1 mL di PBS sul ghiaccio prima e durante le fasi di dissezione descritte di seguito.

2. Rimozione della cuticola della gamba e colorazione degli anticorpi

1. Rimozione della cuticola della gamba
   1. Le pinze di dissezione sono fondamentali per il successo. Introdurre lievi curve parallele in entrambi i poli alla fine della pinza super fine #5 per fornire una smussatura che consenta alla cuticola di essere afferrata superficialmente piuttosto che essere colpita, il che può rovinare il tessuto (Figura 1F, G).
      NOTA: i rebbi piegati in parallelo devono comunque entrare in contatto tra loro per tutta la lunghezza del polo quando sono chiusi (Figura 2).
   2. Trasferire le gambe su un piatto in elastomero siliconico in PBS per la dissezione. Orientare una gamba in modo che il lato anteriore sia rivolto verso l'alto (vedere la Figura 3 per le informazioni sull'anatomia e l'orientamento della gamba). Usando un paio di pinze, tenere il segmento della tibia contro il piatto di elastomero siliconico. Usando l'altra pinza tenuta smussata verso il basso, afferra un pezzo di cuticola sull'estremità distale del femore e tira nella direzione prossimale verso il trocantere.
   3. Continuare a rimuovere metodicamente la cuticola fino a quando il muscolo nudo è visibile in tutta l'estremità prossimale del femore (Figura 1F, G, H).
      NOTA: Effettuare un contatto superficiale con le gambe solo utilizzando il lato smussato della pinza per evitare di tirare il muscolo.
   4. Una volta sezionate tutte le gambe, sostituire PBS con FA per post-fissare le gambe per 30 minuti con agitazione su un nutatore a velocità media (Figura 1I). Lavare i campioni in 1 mL di PBS per 3 volte velocemente e poi 3 volte per 5 minuti ciascuno in PBT (Figura 1J).
      NOTA: Se si colora con l'anticorpo monoclonale NC82 (anti-bruchpilot) per etichettare le zone attive, post-fissare per 20 minuti poiché questo antigene è sensibile a fissazioni più lunghe.

Figura 2. Pinze modificate utilizzate per sezionare le gambe degli adulti. (A) Le estremità della pinza sono piegate e poi appiattite nella parte inferiore (freccia) creando una smussatura limando su una pietra affilata. (B) Al contrario, i rebbi delle pinze non modificate non sono piegati. Barra della scala = 1 mm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Colorazione anticorpale
   1. Per bloccare i tessuti per la colorazione anticorpale, sostituire 1 mL di PBT con una soluzione bloccante composta da 1 mL di NGS al 5% diluito in PBT. Incubare le gambe sezionate per 4 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C mentre si dondola su un nutatore a velocità media (17 giri/ min). Durante tutte le incubazioni, coprire i pozzetti con nastro sigillante oltre al coperchio di plastica (Figura 1J).
      NOTA: 24 piastre di pozzo sono utilizzate per l'immunocitochimica piuttosto che 1,5 mL o 2 mL di microcentrifuga perché i precedenti tentativi di utilizzare tubi di microcentrifuga hanno provocato la rottura delle gambe e il tessuto danneggiato.
   2. Rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere 300 ml di anticorpi primari diluiti in una nuova soluzione bloccante. Il piccolo volume di anticorpi utilizzato dovrebbe essere sufficiente a coprire i tessuti. Ri-sigillare i pozzetti con nastro sigillante da laboratorio e coperchio di plastica e incubare durante la notte a 4 °C con agitazione su un nutatore a velocità media (Figura 1J). Le informazioni sul reagente anticorpale funzionante e le concentrazioni utilizzate per questi studi sono descritte nella Tabella 2.
   3. Lavare gli anticorpi primari in 1 mL di PBT per 3 volte brevemente e poi 3 volte per 15 minuti ciascuno (Figura 1J).
      NOTA: Gli anticorpi primari diluiti possono essere salvati e riutilizzati se conservati a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
   4. Bloccare nuovamente i tessuti in 1 mL di NGS al 5% per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 C (Figura 1J).
   5. Rimuovere la soluzione bloccante NGS al 5% e aggiungere 300 μL degli opportuni anticorpi secondari coniugati fluorescenti diluiti appropriati. Inoltre, aggiungere la diluizione 1:2000 della falloidina coniugata con fluorescenza per etichettare il muscolo (Figura 1J).
   6. Per le incubazioni di anticorpi secondari, sigillare i pozzetti con nastro sigillante e coperchio di laboratorio. Inoltre, avvolgere le piastre in un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori dalla luce. Incubare per 6-8 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
   7. Lavare gli anticorpi secondari e la falloidina come descritto al punto 2.2.3 di cui sopra. Coprire le piastre con un foglio di alluminio tra i lavaggi per proteggere i fluorofori dalla luce.

3. Gambe di montaggio

1. Trasferire le gambe su una slitta usando una pinza e orientare il lato anteriore verso l'alto. Coprire le gambe con supporti di montaggio (Figura 1K, L).
   NOTA: Le gambe sezionate possono essere aspirate con una punta a pipetta P1000 se il foro inferiore viene allargato tagliando con una lama di rasoio.
2. Aggiungi distanziali in argilla a un coverslip ^{22x22 mm2} (spessore # 1,5) raschiando gli angoli di copertura su una piccola palla di argilla modellante. Ogni angolo dovrebbe avere una piccola quantità di argilla di 1-2 mm di spessore (Figura 1K).
3. Per coprire la diapositiva, aggiungere il coperchio con i distanziali di argilla rivolti verso la diapositiva e spingere con attenzione sugli angoli fino a quando il coverslip non tocca solo la superficie del femore.
4. Per evitare l'evaporazione, sigillare i bordi del coperchio con lo smalto e lasciare asciugare in un luogo buio (circa 10 minuti) prima di conservare a 4 °C fino all'imaging.

4. Imaging

1. Immagine al microscopio confocale (Figura 1M). Includere un canale di luce trasmessa per valutare meglio la qualità della dissezione e i campioni con fibre muscolari visibilmente interrotte nell'area di interesse dovrebbero essere scartati.
   1. Inizia a visualizzare z-stack con ingrandimento 20x con zoom 2x e una profondità totale dell'immagine di ~ 40 mm corrispondente allo spessore del femore. Per il rilevamento di segnali fluorescenti, acquisire immagini a risoluzioni coerenti con il campionamento Nyquist (stiamo utilizzando 1024 x 1024 pixel con un'impostazione di permanenza di 8-10 μs / pixel). L'intensità del segnale dovrebbe essere nell'intervallo lineare che si ottiene regolando le impostazioni di guadagno ad alta tensione. Una volta impostate le impostazioni di guadagno per una serie di campioni all'interno di un esperimento, non devono essere modificate in modo che le intensità del segnale possano essere confrontate tra i campioni.
2. Per l'imaging di bouton sinaptici e altre strutture subcellulari, acquisire immagini confocali con ingrandimento ≥60x. Le impostazioni del rilevatore dovrebbero essere nell'intervallo lineare, mentre la densità di pixel, le impostazioni di permanenza e la profondità z dovrebbero essere simili per le immagini acquisite con ingrandimento inferiore (passaggio 4.1).

Risultati

La Figura 4 mostra un esempio rappresentativo di una gamba metatoracica macchiata con anti-hrp, anti-dlg e falloidina. Per le dissezioni che rimuovono la cuticola dalla porzione prossimale del femore, i pergole stereotipati saranno evidenti vicino al tendine che viene rilevato facilmente dall'autofluorescenza. Si noti che la penetrazione degli anticorpi nella gamba avviene per una breve distanza oltre la regione in cui è stata rimossa la cuticola (Figura 4A). Queste regioni possono essere fotografate efficacemente quando è presente un forte segnale di fluorescenza. L'imaging a basso ingrandimento (20x con uno zoom 2x) consente una facile determinazione di 1) quanta cuticola viene rimossa e 2) se il danno si è verificato durante la dissezione. L'ingrandimento aumentato (60x) mostra proiezioni stereotipate sul tilm (Figura 4B). Il nostro lavoro si è concentrato su un MN, probabilmente derivato dal lignaggio I-MN che innerva il tilm nel femore prossimale (scatola, Figura 4B e Figura 4C). L'ulteriore aumento dell'ingrandimento (100x con zoom 2x) consente una visualizzazione efficace dei bouton sinaptici (Figura 4D).

Per studiare i cambiamenti morfologici al NMJ adulto nel tempo, abbiamo precedentemente utilizzato i mutanti dsod1 come modello di SLA. Il gonfiore di Bouton si verifica nei mutanti dsod1H71Y invecchiati rispetto a dsod1nulland dsod1⁺ (Figura 5A, B). Al NMJ larvale, l'anticorpo monoclonale NC82 viene spesso utilizzato per etichettare le zone attive e queste strutture possono essere facilmente visualizzate al NMJ adulto (Figura 5C). I rami assonali HRP debolmente positivi sono abbondanti nei mutanti dsod1H71Y e questi rami mostrano spesso una localizzazione BRP debole e diffusa (frecce).

Importante per la neurodegenerazione, gli anticorpi disponibili in commercio possono rilevare proteine ubiquitinate che si trovano spesso negli aggregati e abbiamo rilevato aggregati ubiquitinati all'interno di assoni terminali di MN in mosche dsod1 mutanti invecchiate e all'interno del muscolo (Figura 6A). Inoltre, gli anticorpi che etichettano i mitocondri possono anche rilevare cambiamenti morfologici con l'età (Figura 6B).

Per alcuni preparati, il danno muscolare durante la dissezione rende il campione inutilizzabile. All'inizio, tale danno può essere un evento comune, ma il miglioramento si verifica con la pratica. Esempi di buone dissezioni sono mostrate nella Figura 7A, C mentre le dissezioni scarse sono mostrate nella Figura 7B, D. Le dissezioni scarse causano la disorganizzazione delle fibre muscolari rilevate dalla microscopia a contrasto di fase (Figura 7B) o fibre muscolari mancanti visualizzate dalla falloidina coniugata fluorescente (Figura 7D, freccia). La combinazione dell'uso della falloidina per etichettare il muscolo e le immagini luminose trasmesse possono aiutare a rilevare tali danni muscolari che potrebbero non essere evidenti quando si guarda al microscopio sezionante.

Figura 3. Anatomia della gamba di Drosophila . (A) Diagramma del lato anteriore di una gamba metatoracica, caratterizzato dalla presenza di setole in contrasto con la cuticola nuda prominente presente sul lato posteriore. La gamba segmentata è composta da coxa (Cx), trocantere (Tr), femore (Fe), tibia (Ti), 5 segmenti tarsali (Ta1-5) e artiglio (Cl) in ordine da prossimale (Pr) a distale (Di). Sono indicati anche i lati dorsale (D) e ventrale (V) del femore. Barra di scala = 100 μm. (B) Diagramma del femore contenente i muscoli dell'elevatore della tibia (tilm), del depressore della tibia (tidm), del muscolo tendineo lungo 2 (ltm2) e del reduttore della tibia (tirm) e proiezioni assonali nel femore prossimale innervando il tilm. Si presume che queste proiezioni assonali stereotipate derivino dai neuroblasti del lignaggio ^I16 e la seconda arborizzazione è la più facile da accedere per dissezione (in scatola). Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Il femore metatoracico sezionato ha rivelato un'architettura MN stereotipata che innerva il tilm. L'immunocitochimica è stata utilizzata per marcare i neuroni (HRP), i dischi grandi (DLG) e i muscoli (falloidina). Le pile Z sono state catturate mediante microscopia confocale attraverso l'intero femore e mostrate come proiezione in serie massima. (A) È stato inoltre incluso un canale di luce trasmessa per illustrare che non si sono verificati danni muscolari rilevabili durante la dissezione. L'immagine è stata catturata con ingrandimento 20x, barra di scala = 50 μm. (B) Pergole identificate associate al tilm (area in scatola, centro), barra della scala = 20 μm; e (C) con ingrandimento 60x, barra di scala = 20 μm. (D) DLG che circonda i bouton era evidente negli animali selvatici quando ripreso con ingrandimento 100x con zoom 2x; barra della scala = 2 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Esempio di cambiamenti dipendenti dall'età nella morfologia del bouton che possono essere rilevati utilizzando la tecnica di dissezione delle gambe. Il gonfiore di Bouton è visto nei mutanti dsod1H71Y invecchiati. (A) Immagini rappresentative di bouton macchiati di HRP da mosche giovani (appena echiuse, giorno 0 adulti) e vecchie (giorno 10), barra della scala = 1 μm. (B) Le dimensioni di Bouton sono state quantificate dai rispettivi genotipi utilizzando la funzione di misura all'interno di ImageJ. p<0.0001 (ANOVA a 2 vie con test Tukey post-hoc). (C) Zone attive all'interno dei bouton sinaptici marcati con anticorpo monoclonale NC82 (anti-bruchpilot); barra della scala = 1 μm. Figura modificata ^da20Per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Marcatori comuni associati a malattie neurodegenerative utilizzate nei preparati per le gambe di Drosophila. (A) Gli aggregati poliubiquitinati subcellulari sono rilevati negli assoni terminali e nei muscoli delle mosche dsod1H71Y invecchiate. L'immunocitochimica che utilizza l'anti-poliubiquitina (FK2) rileva la puncta (frecce) nel dsod1H71Y ^/H71Y invecchiato, la barra della scala = 20 μm (sinistra) e 5 μm (destra). (B) I mitocondri gonfi possono essere rilevati utilizzando anti-ATP5A, barra di scala = 1 μm. Figura modificata ^da20Per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7. Esempi di dissezioni buone e scarse. (A) Dissezione che non ha interrotto l'architettura muscolare sottostante. (B) Un esempio di una dissezione scadente che mostrava fibre muscolari sfilacciate (freccia) e non poteva essere utilizzata per l'analisi. Entrambi i campioni sono stati ripresi mediante microscopia a contrasto di fase. Barra della scala = 50 μm. (C) Esempio di una buona dissezione ripresa al microscopio confocale con HRP (verde) e falloidina (blu). (D) Una scarsa dissezione mancante di fibre muscolari dorsali del TILM mancante (freccia). Barra della scala = 50 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Anticorpo/Macchia	Diluizione*
Anti-ATP5A	1:500
Anti-bruchpilot (nc82)	1:20
Proteina stringa anti-cisteina (ab49)	1:50
Anti-dischi di grandi dimensioni (4F3)	1:200
Anti-hrp	1:550
Anti-poliubiquitina (FK2)	1:1000
Anti-repo (8D12)	1:5
Anticorpo secondario anti-topo di capra	1:800
Falloidina	1:2000
	*Diluire in 5% NGS

Tabella 2. Anticorpi e diluizioni. I fornitori commerciali degli anticorpi utilizzati in questi studi sono elencati nell'elenco dei materiali.

Discussione

La gamba adulta Drosophila è un modello ideale per studiare la neurodegenerazione data la relativa semplicità con MN ben caratterizzati mappati da lignaggi di neuroblasti e modelli di arborizzazione stereotipati. Diversi rapporti hanno precedentemente utilizzato LE MN delle gambe per lo studio delle malattie neurodegenerative21,22. Questi studi hanno utilizzato linee che esprimono GFP combinate con l'analisi del mosaico con un marcatore cellulare repressibile (MARCM) per l'immagine attraverso la cuticola e hanno documentato una serie di cambiamenti morfologici. L'imaging di NMJ adulti mediante immunocitochimica con cuticola resecata consente un'ulteriore caratterizzazione con la capacità di tracciare cambiamenti molecolari complessi utilizzando una cassetta degli attrezzi di anticorpi disponibili.

La parte immunocitochimica di questo protocollo è relativamente standard e può essere implementata indipendentemente dal genotipo (^vedere23 per un'eccellente descrizione dei metodi generali di colorazione degli anticorpi per l'uso con Drosophila). Inoltre, parametri come l'intensità di fluorescenza, la lunghezza del ramo assonale e i numeri e le dimensioni dei bouton possono essere determinati utilizzando una varietà di macro ImageJ disponibili una volta acquisite le immagini e sono stati pubblicati metodi dettagliati per l'analisi quantitativa (ad esempio, vedi 24,25,26). Pertanto, la tecnica di dissezione è la principale innovazione qui descritta. Prima della dissezione, le mosche vengono immerse in un alcol per rimuovere gli idrocarburi cuticolari. Sia l'etanolo che il metanolo sono comunemente usati per questo scopo; tuttavia, abbiamo usato solo metanolo. Fondamentali per il successo della dissezione sono diversi fattori: in primo luogo, l'uso di pinze modificate con una smussatura consente un contatto molto superficiale con la cuticola. In secondo luogo, utilizzando un microscopio di dissezione in grado di ingrandimento totale 60-100x in modo che la superficie della cuticola sia chiaramente visibile. Per i microscopi con ingrandimento massimo inferiore, sono disponibili obiettivi 2x per le marche più comuni e dovrebbero essere sufficienti se combinati con lenti esistenti. In terzo luogo, la fase di fissazione iniziale rende la cuticola fragile e più facile da tirare via senza danneggiare il muscolo sottostante. La fissazione eccessiva in questa fase rende l'intera gamba troppo rigida per una dissezione efficace. Pertanto, la fissazione iniziale dovrebbe essere limitata a 30 minuti. Il fissativo di formaldeide non penetrerà abbastanza per reticolare efficacemente il tessuto sottostante durante questo breve periodo e quindi è necessaria una seconda fase di fissazione. Prima della seconda fissazione, i tessuti devono essere tenuti sul ghiaccio per prevenire la degradazione e i cambiamenti nella morfologia. In quarto luogo, abbiamo trovato anche la dissezione di campioni mentre il freddo è importante, probabilmente per ragioni simili in quanto la cuticola è fragile e un piccolo pezzo può essere rimosso più facilmente.

Con la pratica, scopriamo che circa il 50% delle dissezioni sarà utilizzabile senza danni tissutali distinguibili. Sebbene questa percentuale possa sembrare bassa rispetto ad altri tessuti, la procedura di dissezione è rapida e molte gambe possono essere elaborate in 30-60 minuti. Pertanto, anche se i tassi di successo sono inizialmente bassi, è possibile ottenere 4-5 buoni campioni per ciascun gruppo sperimentale. Tuttavia, una limitazione può essere il numero di mosche disponibili in un dato momento se i genotipi e/o l'età determinano una letalità sostanziale.

Un'altra limitazione è che non siamo stati in grado di sezionare altre aree della gamba oltre la regione prossimale del femore a causa delle dimensioni. Pertanto, possiamo studiare i pergole MN identificati che innervano il TILM in modo affidabile ed è possibile sezionare la cuticola sopra il muscolo depressore della tibia con piccoli cambiamenti nel modo in cui la gamba è orientata durante la dissezione. Tuttavia, l'accesso ad altre regioni della gamba si è rivelato più difficile senza interrompere l'architettura assonale durante la dissezione.

Qui, presentiamo metodi di dissezione per rilevare i cambiamenti al NMJ adulto per MN definiti che innervano il tilm usando l'immunocitochimica. La gamba è utile come un sistema semplice, innervato da soli ~ 50 MN e contenente 14 muscoli con anatomia ben descritta. La preparazione delle gambe sezionate può essere utilizzata in tutti i genotipi e una suite di anticorpi è disponibile per la visualizzazione NMJ senza la necessità di costruire scorte genotipicamente complesse di costrutti genici reporter in sfondi mutanti. Questo approccio consentirà una caratterizzazione più dettagliata dei cambiamenti al NMJ per le malattie MN e altre condizioni legate all'età.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP3991
24 well plates	Corning	3473	Hydrophobic, ultra-low attachment surface
2x objective accessory	Olympus	110AL2X	Screw-on attachment
Anti-ATP5A primary antibody	Abcam	ab14748	Mouse monoclonal
Anti-bruchpilot primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Mouse monoclonal
Anti-discs large primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Mouse monoclonal
Anti-hrp primary antibody	Jackson Immuno Research	123-605-021	Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal
Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody	Millipore Sigma	04-263	Mouse monoclonal
Confocal Microscope	Olympus	FV1000	Objectives (NA):  10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40)
Coverslips	Corning	285022	160-190 mm thickness
Dissecting forceps	Fine Science Tools	11252-00	Dumont #5SF
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Formaldehyde	Fisher Scientific	BP531-500	37% stock stabilized with methanol
Goat anti-mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	115-545-146	Alexa Fluor 488 conjugated
Goat Serum	Novus Biologicals	NB036768	0.2 mm filtered
Laboratory sealing tape	Fisher Scientific	03-448-254	Parafilm M
Methanol	Fisher Scientific	A413
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-123	76mm x 25mm
Mounting media	Molecular Probes	S36972	Slowfade Diamond mounting media
Nonionic surfactant	Acros Organics	215680010	Triton-X 100
Nutator	Fisher Scientific	S06622
Phalloidin	Invitrogen	A34055	Alexa Fluor 555- conjugated
Sharpening stone	Fine Science Tools	29008-01
Silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	2423610	Sylgard 184