확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

요약

우리는 신경 근육 접합의 건축을 보존하고 성인 Drosophila 다리에 있는 운동 신경의 상세한 면역 세포화학 연구 를 가능하게 하는 해부 기술을 기술합니다.

초록

Drosophila 멜라노가스터 는 신경 구조와 기능을 연구하는 유전적 인 학문 모델을 나타내며 질병 상태의 후속 변화. 잘 특징의 애벌레 신경 근육 접합은 종종 이러한 연구에 사용됩니다. 그러나, 급속한 애벌레 발달은 근위축성 측삭 경화증에서 생기는 것과 같이 느린 나이 의존적인 퇴행성 변경의 연구 결과에 대한 이 모형을 문제적으로 만드는 변성 도중 근육 조직분해 및 신경계 리모델링에 선행합니다. 또는 성인 파리는 90일 동안 살며 성인 다리는 성기 의 수명 동안 운동 신경 변화를 연구하는 데 사용할 수 있으며, 이는 큐티클을 통해 생체 내 형광화상 영상을 사용하여 사용된다. 여기에서, 우리는 확인된 성인 다리 운동 신경세포의 신경 근육 접합에 분자 변경의 연구를 허용하는 면역 세포화학과 결합된 다리 해부 기술을 기술합니다. 이러한 기술은 시냅스 전 및 시냅스 후 구조를 모두 라벨링하는 무수한 항체와 결합될 수 있다. 이러한 절차는 성인 파리의 느린 연령 의존 적 변화의 보다 완전한 특성을 허용하고 여러 운동 신경 질환 모델에 걸쳐 적용 될 수있다.

서문

운동 뉴런(MN) 질환은 1차 ^{임상 표현형}으로서 근육 낭비및 마비로 이어지는 점진적 변성을 포함하는 이종성 질환의 그룹을 포함한다. 100,000당 4.5의 글로벌 보급으로 드물지만, 이 보급은 고령화 인구²와 함께 증가할 것으로 예상됩니다. 근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 가장 흔한 MN 질병 (MND)이며 기존의 질병 수정 치료없이 진단의 짧은 시간 이내에 일반적으로 치명적입니다^3. MNDs는 환자에서 볼 수있는 초기 분자 바이오 마커 변경 및 기능적 이미징 변화와 함께 장기간 전증상 단계를 공유^합니다4. 초기 전증상 세포 병리학은 또한 비인간 질병 모형에서 관찰됩니다5,6,7,8. 신경 근육 접합에 초기 변화의 연구는 MN 질병 병 인을 이해 하는 데 중요 하 고 초기 진단 및 잠재적인 치료 개발에 도움이 될 수 있습니다.

Drosophila에 풍부한 유전 및 분자 도구가 존재하여 신경 근육 접합의 구조와 기능을 해부합니다 (NMJ, ^see9는 잘 특징적인 애벌레 NMJ의 검토를 위해). 이러한 도구는 짧은 수명과 결합하여 Drosophila는 NMJ에서 신경 퇴행성 변화를 연구하는 훌륭한 모델입니다. 구체적으로, MNs 내분 성인 근육은 ~90일 성인 수명 전반에 걸쳐 존재하며 정상적인 노화 과정^10,11,12,13의 적용을 받습니다. 따라서 성인 MN은 변형 ^14,15 전에 짧은 ~ 1 주 기간 동안 만 존재하는 애벌레 NMJ와 는 대조적으로 느린 퇴행성 변화를 연구 할 수있는 기회를 제공합니다.

여기서는 성인 다리에서 MN의 면역 세포화학 적 분석을 수행 할 수있는 해부 절차를 설명합니다. 각 성인 다리는 ~ 50 MNs에 의해 내면화되며, 이는 운동과 관련된 다리 근육에 시냅스합니다. 다리 해부학, 기계 생리학 및 신경 생물학은 잘 설명되어 있다16,17,18. 다리 MNs의 축삭 아버는 이전에 이중 partite Gal4/UAS 시스템을 사용하여 백 필기 또는 유전으로 표지된 세포 집단에 있는 큐티클을 통해 화상 진찰에 의해 특징지어졌으며 화상 진찰 방법은 이전에 간행되었습니다¹⁹. 여기에 제시된 해부 방법은 축축산 분기 형태를 보존하고 우리가 NMJ의 다른 분자 성분을 표지하기 위하여 항체의 다양한 범위를 이용하는 것을 허용합니다. 우리의 이전 작품은 경골 레바터 근육 (tilm)을 내면화하고 일관된 식소 패턴과 부톤 숫자를 보여주는 metathoracic (3 ^번째) 다리에 정의된 MN의 투영에 초점을 맞추고 있습니다. 처음에 우리는 Drosophila superoxide dismutase 1 (dsod1) 돌연변이에 있는 나이 의존적인 변경을 공부하고 NMJ20의 해체와 일치하는 변경을 찾아냈습니다. 이러한 해부 방법은 다른 ALS 모델, 노화 및 기타 MN 관련 질병에 대한 NMJ의 느린 퇴행성 변화를 더 잘 특성화 할 수있는 기회를 제공합니다.

그림 1. 다리를 해부하기 위한 워크플로 요약입니다. 자세한 단계에 대한 프로토콜을 참조하십시오. (A,B) 파리를 선택하고 마취합니다. (C) 파리는 메탄올로 옮겨지고 PBS로 세척됩니다. (D) 메타토라시브 다리는 해부 현미경(~30배감)으로 시각화되는 동안 coxa의 기지에서 제거됩니다. 스케일 바 = 500 μm. (E) 다리는 24웰 플레이트의 우물 내에서 30분 동안 3.7% 포름알데히드/PBS(FA) 용액으로 고정된 다음 FA는 PBS를 통해 헤이즈에 의해 제거됩니다. (F, G, H) 다리는 실리콘 엘라스토머 해부 트레이로 옮겨지고 80x에서 해부하는 현미경으로 시각화되는 동안 beveled 포셉을 사용하여 근위 대퇴골에서 큐티클 조각이 제거됩니다. 스케일 바 = 50 μm. (I) 다리는 FA에서 고정된 후 PBS및 PBT(PBS+ 0.1% 비이온 계면활성제)로 세척됩니다. (J) 다리는 면역 세포화학 염색을 받습니다. (K,L) 다리는 유리 슬라이드로 옮겨지고, 장착 매체에서 지워지고, 점토 스페이서가 들어 있는 커버슬립으로 덮여 있습니다. 스케일 바 = 2mm 및 500 μm. (M) 다리는 공초점 현미경 검사법에 의해 이미지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

이 프로토콜과 함께 사용되는 작업 솔루션을 준비하기 위한 절차는 표 1에 설명되어 있습니다.

시약	준비			보관
PBS	증류수에서 희석하여 10배 PBS 스톡 솔루션에서 1배 PBS의 작업 재고를 만드십시오.  작업 PBS 주식의 pH는 7.2- 7.4이어야한다			세균 오염이 보일 때까지 1 개월 이상 4 °C.
PBT	0.1% 비이온 계면활성제의 1x PBS 용액.			세균 오염이 보일 때까지 1 개월 이상 4 °C.
파	3.7% 포름알데히드 용액은 37% 포름알데히드 주식으로 만들어졌으며 1배 PBS로 희석됩니다.			실온. 해부의 매일 신선한 만들기
	주의: 37%의 주식 용액으로 공급되는 포름알데히드는 잠재적인 발암물질이며 연기 후드에 희석되어야 합니다.
5% NGS	PBT에서 희석된 일반 염소 혈청의 5%  사용되는 혈청은 사용될 이차 항체의 종과 일치해야 한다.			세균 오염이 보일 때까지 몇 주 동안 4 °C

표 1. 성인 Drosophila 다리 의 면역 세포 화학을 수행하기위한 솔루션.

1. 조직의 초기 고정

1. 각 유전자형과 나이에 대해 약 10개의 파리를 선택합니다. 이산화탄소 아래 플라이 패드에서 마취(그림 1A, B).
   참고: 해부 후 충분한 샘플 크기를 보장하기 위해 필요한 것보다 더 많은 파리로 시작합니다.
2. 페인트 브러시를 사용하여 유리 우물또는 접시에 차가운 메탄올로 파리를 약 30초에서 1분 동안 옮춥니다(그림 1C). 메탄올은 큐티큘러 탄화수소를 용해시키고 파리는 수성 용액에 떠 다니기보다는 침수될 수 있습니다.
3. 집게로 조심스럽게 PBS로 이동합니다. 얼음처럼 차가운 PBS에서 3x를 헹구고 과잉 메탄올을 제거하고 해부및 고정이 될 때까지 PBS에서 얼음으로 날아갑니다. 이 시점에서, 해부 파리와 가능한 짧은 시간 (<30 분) 이내에 수정.
4. 다리를 분리하려면 차가운 PBS로 채워진 실리콘 탄성 탄성 방부 접시로 파리를 옮기고, #5 Dumont 집게 두 쌍을 사용하여 coxa에서 메타토라시 다리를 제거하거나 Vanna 가위로 다리를 잘라냅니다 (그림 1D). 1mL의 PBS로 채워진 플라스틱 24 웰 플레이트에서 다리를 우물로 옮기고 모든 다리가 제거되고 우물로 옮겨질 때까지 접시를 얼음 위에 놓습니다.
   참고: 각 우물은 적어도 20개의 다리를 보유할 수 있습니다.
5. PBS 솔루션을 FA 용액 1mL로 교체하고 30분 동안 누에이터에서 회전합니다(그림 1E). 누에이터 설정은 중간 속도(17rpm)로 설정해야 합니다. 적절한 고정을 위해이 시간 동안 다리가 FA 솔루션에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오.
6. FA 용액을 제거하려면 PBS 3x의 1mL로 빠르게 세척한 다음 PBS 1mL로 5분 동안 3개의 세척을 추가로 세척합니다. 아래에 설명된 해부 단계 동안 PBS1mL의 조직을 얼음 에 보관하십시오.

2. 다리 큐티클 및 항체 염색 제거

1. 다리 큐티클 제거
   1. 해부 포셉은 성공에 매우 중요합니다. #5 슈퍼 미세 포셉의 끝에 있는 두 갈래에 약간의 병렬 굴곡을 도입하여 큐티클을 찌르지 않고 피상적으로 잡을 수 있는 벨을 제공하여 조직을 망칠 수 있습니다(그림 1F, G).
      참고: 병렬로 구부러진 프롱은 닫을 때 프롱 길이 전체에 걸쳐 서로 접촉해야 합니다(그림 2).
   2. 해부를 위해 PBS의 실리콘 엘라스토머 접시에 다리를 옮기습니다. 전방 측이 위를 향하도록 다리를 방향을 지정합니다(다리 해부학 및 방향 정보는 그림 3 참조). 한 쌍의 집게를 사용하여 실리콘 엘라스토머 접시에 경골 세그먼트를 잡습니다. 다른 집게를 사용하여 베벨 쪽을 아래로 잡고, 대퇴골의 말단 끝에 큐티클 조각을 잡고 트로 챈터를 향해 근위 방향으로 당깁니다.
   3. 대퇴골의 근위 쪽 끝에 걸쳐 벌거벗은 근육이 보일 때까지 체계적으로 큐티클을 제거하십시오(도 1F, G, H).
      참고: 근육을 당기는 것을 피하기 위해 집게의 경사진 면을 사용하여 다리와 피상적으로만 접촉합니다.
   4. 모든 다리가 해부되면 PBS를 FA로 교체하여 중간 속도로 누에이터를 흔들어 30 분 동안 다리를 수정합니다 (그림 1I). PBS 1mL로 샘플을 3배 빠르고 PBT에서 각각 5분간 3회 세척합니다(그림 1J).
      참고: 단일 클론 항체 NC82 (항 브루치 파일럿)로 염색하여 활성 영역에 라벨을 붙이는 경우,이 항원이 더 긴 고정에 민감하기 때문에 20 분 동안 수정 후 수정하십시오.

그림 2. 성인 다리를 해부하는 데 사용되는 수정 된 집게. (A) 집게의 끝이 구부러진 다음 바닥(화살표)에서 평평해져 서두르는 돌에 제출하여 bevel을 만듭니다. (B) 반대로 수정되지 않은 집게의 갈래는 구부러지지 않습니다. 스케일 표시줄 = 1mm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 항체 염색
   1. 항체 염색을 위한 조직을 차단하기 위하여는, PBT의 1mL를 PBT에서 희석한 5% NGS의 1mL로 구성된 블로킹 용액으로 대체하십시오. 해부된 다리를 실온에서 4시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양하고 중간 속도(17rpm)로 누에이터에 흔들리고 있습니다. 모든 인큐베이션 동안 플라스틱 커버 (그림 1J)뿐만 아니라 밀봉 테이프로 우물을 덮습니다.
      참고: 24개의 웰 플레이트는 미세원심분리기 튜브를 사용하려는 이전의 시도가 다리가 부러지고 조직이 손상되기 때문에 1.5mL 또는 2mL 마이크로센트심분리기보다는 면역 세포화학에 사용됩니다.
   2. 차단 용액을 제거하고 신선한 차단 용액에 희석 된 1 차 항체의 300 mL을 추가하십시오. 사용되는 항체의 소량은 조직을 커버하기에 충분해야합니다. 실험실 밀봉 테이프와 플라스틱 뚜껑으로 우물을 다시 밀봉하고 중간 속도로 누에이터에 흔들어 4 °C에서 하룻밤 배양 (그림 1J). 이러한 연구를 위해 사용되는 작동 항체 시약 정보 및 농도는 표 2에 설명되어 있습니다.
   3. 1차 항체를 PBT 1mL로 3회 간간 세척한 다음 각각 15분 동안 3회 세척한다(그림 1J).
      참고: 희석된 1차 항체는 최대 2주 동안 4°C에 저장하면 저장하고 재사용할 수 있다.
   4. 실온에서 2시간 이상 또는 4C(그림 1J)에서 1mL의 5% NGS로 조직을 다시 차단합니다.
   5. 5% NGS 차단 용액을 제거하고 적절한 희석 형광 공주 이차 항체의 300 μL을 추가합니다. 또한, 추가 1:2000 형광 -컨쥬게이트 남근의 희석 을 라벨 근육에 (그림 1J).
   6. 이차 항체 인큐베이션의 경우 실험실 밀봉 테이프와 뚜껑으로 우물을 밀봉하십시오. 또한 알루미늄 호일에 플레이트를 싸서 빛으로부터 형광을 보호합니다. 실온에서 6-8시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
   7. 상기 2.2.3 단계에서 설명된 바와 같이 이차 항체 및 프할로이드신을 세척한다. 알루미늄 호일로 플레이트를 세정 사이에 덮어 빛으로부터 형광을 보호합니다.

3. 다리 장착

1. 다리를 집게와 오리엔트 전방 측면을 사용하여 슬라이드로 옮기십시오. 장착 미디어로 다리를 덮습니다(그림 1K, L).
   참고: 해부된 다리는 면도날로 절단하여 바닥 보어가 넓어지면 P1000 파이펫 팁으로 흡인될 수 있습니다.
2. 22x22 ^mm2 커버슬립(#1.5 두께)에 클레이 스페이서를 추가하여 작은 모델링 클레이 볼을 가로질러 커버슬립 모서리를 긁어냅니다. 각 모서리에는 소량의 점토가 1-2mm 두께여야 합니다(그림 1K).
3. 슬라이드를 덮려면 진흙 스페이서가 슬라이드를 향하고 있는 커버슬립을 추가하고 커버슬립이 대퇴골 표면에 닿을 때까지 조심스럽게 모서리를 밀어 넣습니다.
4. 증발을 방지하기 위해, 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 이미징 까지 4 ° C에 저장하기 전에 어두운 장소 (약 10 분)에서 건조하게.

4. 이미징

1. 공초점 현미경에 의한 이미지 (그림 1M). 해부의 품질을 더 잘 평가하기 위해 전달된 광 채널을 포함하고 관심 영역에서 눈에 띄게 중단된 근육 섬유를 가진 시료를 폐기해야 합니다.
   1. 2배 줌으로 20배 배율로 이미징 z 스택을 시작하고 대퇴골의 두께에 해당하는 총 심도 ~40mm입니다. 형광 신호 감지의 경우 나이퀴스트 샘플링과 일치하는 해상도로 이미지를 캡처합니다(8-10 μs/픽셀의 거주 설정이 있는 1024 x 1024 픽셀을 사용하고 있음). 신호 강도는 고전압 게인 설정을 조정하여 달성되는 선형 범위에 있어야 합니다. 실험 내의 일련의 샘플에 대한 게인 설정이 설정되면 샘플 간에 신호 강도를 비교할 수 있도록 변경해서는 안 됩니다.
2. 시냅스 boutons 및 기타 세포 전체 구조를 이미징하기 위해 ≥60배율로 공초점 이미지를 캡처합니다. 검출기 설정은 선형 범위에 있어야 하며 픽셀 밀도, 거주 설정 및 z 깊이는 낮은 배율(단계 4.1)에서 캡처된 이미지와 유사해야 합니다.

결과

도 4 는 안티 hrp, 안티 dlg 및 phalloidin로 염색 된 메타토라시드 다리의 대표적인 예를 나타낸다. 대퇴골의 근위 부에서 표피를 제거하는 해부의 경우, 스테레오형 식목은 자동 불발성에 의해 쉽게 검출되는 힘줄 근처에서 명백해질 것이다. 다리에 항체 침투는 표절이 제거된 영역을 넘어 짧은 거리에서 발생합니다(도 4A). 이 지역은 강한 형광 신호가 존재할 때 효과적으로 심을 수 있다. 낮은 배율(2x 줌을 가진 20배)에서 이미징을 사용하면 1의 쉬운 측정을 허용하며, 해부 중에 손상이 발생했는지 여부는 2) 됩니다. 배율 증가(60x)는 틸름에 고정 고정 투영을 나타낸다(도 4B). 우리의 작품은 근위 대퇴골 (상자, 그림 4B 및 그림 4C)에서 틸름을 내면으로 하는 I-MN 혈통에서 파생 된 하나의 MN에 초점을 맞추고 있습니다. 배율을 더 증가시(2x 줌 100x)를 통해 시냅스 부톤의 효과적인 시각화를 가능하게 합니다(그림 4D).

시간이 지남에 따라 성인 NMJ에서 형태학적 변화를 연구하기 위해 이전에 는 ALS의 모델로 dsod1 돌연변이를 사용했습니다. 부톤 붓기는 dsod1nulland dsod1+ (그림 5A, B)에 비해 숙성 dsod1H71Y 돌연변이체에서 발생합니다. 애벌레 NMJ에서, 단클론 항체 NC82는 종종 활성 영역을 표지하는 데 사용되며 이러한 구조는 성인 NMJ (도 5C)에서 쉽게 시각화 될 수 있습니다. 약한 긍정적 인 HRP 축삭 가지는 dsod1H71Y 돌연변이체가 풍부하며 이러한 분기는 종종 BRP 지역화 (화살표)가 약하고 확산됩니다.

신경 변성에 중요한, 시판되는 항체는 골재에서 수시로 찾아낸 유비쿼터스단백질을 검출할 수 있고, 우리는 숙성돌연변이 dsod1 파리뿐만 아니라 근육 내의 MNs의 말단 축축 내의 유비쿼터티드 골재를 검출했습니다 (그림 6A). 또한, 미토콘드리아를 표지하는 항체는 또한 나이를 가진 형태학적 변화를 검출할 수 있다(도 6B).

일부 제제의 경우 해부 중 근육 손상으로 인해 샘플을 사용할 수 없게 됩니다. 처음에는 이러한 손상이 일반적일 수 있지만 연습과 함께 개선이 발생합니다. 좋은 해분의 예는 그림 7A, C 를 표시하고 불량 해부는 그림 7B, D에 표시됩니다. 불쌍한 해부는 위상 대비 현미경 검사법(도 7B) 또는 형광-컨쥬게이트 된 남근에 의해 시각화 된 누락 된 근육 섬유에 의해 검출된 바와 같이 근육 섬유의 해체를 일으킨다 (도 7D, 화살표). 근육에 라벨을 붙이기 위해 phalloidin을 사용하는 조합, 그리고 전달 된 빛 이미지는 해부 현미경에서 볼 때 명백하지 않을 수 있습니다 이러한 근육 손상을 감지하는 데 도움이 될 수 있습니다.

그림 3. 드로소필라 다리의 해부학. (A) 후방 쪽에 존재하는 눈에 띄는 벌거 벗은 큐티클과 는 대조적으로 강모의 존재를 특징으로하는 메타 토라시크 다리의 전방 측면의 다이어그램. 분할된 다리는 근교(Pr)에서 탈약(Di)에 이르는 콕사(Cx), 트로챈터(Tr), 대퇴골(Fe), 경골(Ti), 5타르탈 세그먼트(Ta1-5), 발톱(Cl)으로 구성됩니다. 대퇴골의 등쪽(D) 및 복부(V) 측면도 표시됩니다. 배율 막대 =100 μm. (B) 경골 레바이터(tilm), 경골 우울기(tidm), 긴 힘줄 근육 2(ltm2) 및 경골 환원기(tirm) 근육 및 축축 투영을 함유하는 대퇴골의 다이어그램이 틸름을 내면으로 휘둘린다. 이러한 고정 관념 축 축 프로젝션I-리니지 ^{neuroblasts16}에서 파생 될 것으로 추정 되며, 두 번째 중단은 해부 (박스)에 의해 액세스 하는 가장 쉬운. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. 해부 된 메타토라시 대퇴골은 틸름을 내면에 고정 된 MN 아키텍처를 공개했다. 면역 세포 화학신경 (HRP), 디스크 대형 (DLG) 및 근육 (phalloidin)을 표시하기 위해 사용되었다. Z-스택은 전체 대퇴골을 통해 공초점 현미경 이미징에 의해 포착되고 최대 시리즈 프로젝션으로 표시되었다. (A) 전염된 광 채널도 해부 중에 검출 가능한 근육 손상이 발생하지 않음을 설명하기 위해 포함되었다. 이미지는 20배율, 스케일 바 =50 μm로 촬영되었다. (B) 틸름(박스 면적, 중앙), 스케일 바 =20 μm과 관련된 수목을 확인; 및 (C) 60x 배율에서, 스케일 바 = 20 μm. (D) DLG 주변 의 boutons야생 형 동물에서 2 배 확대와 100 x 배율로 이미지 할 때 명백했다; 스케일 바 = 2 μm 이 그림을 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5. 다리 해부 기술을 사용하여 검출할 수 있는 bouton morphology에 있는 나이 의존적인 변경의 보기. 부톤 붓기는 노화 dsod1H71Y 돌연변이에서 볼 수 있습니다. (A) 젊은 (새로 폐쇄, 일 0 성인) 및 오래 된 (10 일) 파리, 스케일 바 = 1 μm에서 HRP 스테인드 boutons의 대표적인 이미지. (B) Bouton 크기는 ImageJ 내의 측정 기능을 사용하여 각 유전자형으로부터 정량화되었다. p<0.0001 (후 Hoc 투키 테스트와 2 방향 ANOVA). (C) 단일 클론 항체 NC82 (항 브루치파일럿)로 표시된 시냅스 boutons 내의 활성 영역; 스케일 바 = 1 μm. 에서 수정 된 그림²⁰이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6. Drosophila 다리 준비에 사용 되는 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 일반적인 마커. (A) 세포전 형량 화합은 종기 축삭과 숙성 dsod1H71Y 파리의 근육에서 검출된다. 항폴리비키틴(FK2)을 이용한 면역세포화학은 숙성된 dsod1H71Y^/H71Y, 스케일 바 = 20 μm(왼쪽) 및 5 μm(오른쪽)에서 말크타(화살표)를 검출한다. (B) 부은 미토콘드리아는 항 ATP5A, 스케일 바 = 1 μm을 사용하여 검출될 수 있다. 에서 수정 된 그림²⁰이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7. 선하고 가난한 해부의 예. (A) 근본적인 근육 아키텍처를 방해하지 않은 해부. (B) 마모된 근육 섬유(arrow)를 보여주고 분석에 사용할 수 없었던 가난한 해부의 예. 두 샘플 모두 위상 대비 현미경 검사법에 의해 이미지화되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. (C) HRP(녹색) 및 프할로이딘(blue)을 가진 공초점 현미경 검사법에 의해 이미지된 양해분의 예. (D) TILM 누락 (화살표)의 가난한 해부 누락 등쪽 근육 섬유. 스케일 바 = 50 μm 이 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

항체/얼룩	희석*
안티 ATP5A	1:500
안티 브루치파일럿 (nc82)	1:20
항 시스테인 문자열 단백질 (ab49)	1:50
디스크 방지 대형(4F3)	1:200
안티 hrp	1:550
폴리비비퀴틴 방지 (FK2)	1:1000
안티리포지(8D12)	1:5
염소 항 마우스 이차 항체	1:800
파로딘	1:2000
	*5% NGS로 희석

표 2. 항체 및 희석제. 이러한 연구에서 사용되는 항체의 상업적 공급 업체는 재료 목록에 나열되어 있습니다.

토론

Drosophila 성인 다리는 신경 아세포 계보와 고정 관념 식소 패턴에서 매핑 잘 특징적인 MN과 상대적 단순성을 주어진 신경 변성을 연구하는 이상적인 모델입니다. 몇몇 보고는 이전에 신경 퇴행성 질병의 연구 를 위해 다리 MN을 사용^{했습니다21,22}. 이러한 연구는 억압가능한 세포 마커(MARCM)와 모자이크 분석과 결합된 GFP 표현 라인을 사용하여 큐티클을 통해 이미지화하고 일련의 형태학적 변화를 문서화했습니다. 절제된 자화로 면역 세포화학에 의한 성인 NMJ를 이미징하면 사용 가능한 항체의 툴박스를 사용하여 복잡한 분자 변화를 추적할 수 있는 기능을 통해 추가 특성화가 가능합니다.

이 프로토콜의 면역 세포화학 부분은 상대적으로 표준이며 유전자형에 독립적으로 구현될 수 있습니다(예를 들어 Drosophila와 함께 사용하기 위한 일반적인 항체 염색 방법에 대한 우수한 설명을 위한 참조²³). 더욱이, 형광 강도, 축슨 분기 길이 및 부톤 수 및 크기와 같은 파라미터는 이미지가 캡처되고 정량적 분석을 위한 상세한 방법이 게시된 후 다양한 ImageJ 매크로를 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, see24,25,26). 따라서, 해부 기술은 여기에 설명된 주요 혁신이다. 해부 전에 파리는 알코올에 잠기면 자쿠리탄화수소를 제거합니다. 에탄올과 메탄올 은 이 목적을 위해 일반적으로 사용됩니다. 그러나, 우리는 메탄올만 사용했습니다. 성공을 해부하는 데 중요한 요소는 여러 가지 요소입니다: 첫째, 벨이 있는 수정된 집게를 사용하면 표피와 매우 피상적인 접촉을 할 수 있습니다. 둘째, 60-100x 총 배율이 가능한 해부 현미경을 사용하여 표피의 표면이 선명하게 보이게 된다. 최대 배율이 낮은 현미경의 경우, 2배 의 목표는 가장 일반적인 브랜드에 사용할 수 있으며 기존 렌즈와 결합될 때 충분해야 합니다. 셋째, 초기 고정 단계는 큐티클이 부서지기 쉽고 밑에 근육을 손상시키지 않고 쉽게 멀리 당겨. 이 단계에서 과도하게 고정하면 전체 다리가 너무 뻣뻣하여 효과적인 해부를 만듭니다. 따라서 초기 고정은 30분으로 제한되어야 합니다. 포름알데히드 고정은 이 짧은 기간 동안 기본 조직을 효과적으로 교차연결하는 데 충분히 침투하지 않으므로 두 번째 고정 단계가 필요합니다. 두 번째 고정 전에 조직은 형태학의 저하와 변화를 방지하기 위해 얼음위에 보관해야 합니다. 넷째, 우리는 감기가 중요하지만 해부 샘플을 발견했으며, 큐티클이 부서지기 쉽고 작은 조각을 더 쉽게 제거할 수 있습니다.

연습을 통해 해분의 50%가 눈에 띄는 조직 손상 없이 사용할 수 있다는 것을 발견합니다. 이 백분율은 몇몇 그밖 조직에 비해 낮은 보일 수 있더라도, 해부 절차는 급속하고, 많은 다리는 30- 60 분에서 처리될 수 있습니다. 따라서 처음에는 성공률이 낮더라도 각 실험 군에 대해 4-5개의 좋은 샘플을 얻을 수 있습니다. 그러나, 유전자형 및/또는 나이가 상당한 치사증을 초래하는 경우 주어진 시간에 사용할 수 있는 파리의 수에 제한이 있을 수 있습니다.

또 다른 제한사항은 크기때문에 대퇴골의 근위 영역을 넘어 다리의 다른 영역을 해부할 수 없다는 것입니다. 따라서, 우리는 TILM을 안정적으로 내면으로 내면화하는 MN 아버를 연구할 수 있으며, 해부시 다리가 방향을 바꾸는 방식에 작은 변화와 함께 경골 우울근 위에 표피를 해부할 수 있다. 그러나 다리의 다른 영역에 액세스하는 것은 해부 동안 축축건축을 방해하지 않고 더 어려워 입증되었습니다.

여기서, 우리는 면역 세포화학을 사용하여 틸름을 내면화하는 정의된 MNs에 대한 성인 NMJ에서의 변화를 검출하는 해부 방법을 제시한다. 다리는 단순한 시스템으로 유용하며, ~50MN에 의해 내면화되고 잘 설명된 해부학을 가진 14개의 근육을 함유하고 있습니다. 해부된 다리 제제는 유전자형 전반에 걸쳐 사용될 수 있으며 돌연변이 배경에서 기자 유전자 구조의 유전자 생성물의 유전자 전형적으로 복잡한 주식을 구축할 필요 없이 NMJ 시각화에 사용할 수 있다. 이 접근법은 MN 질병 및 기타 연령 관련 조건에 대한 NMJ의 변화에 대한 보다 상세한 특성화를 가능하게 할 것입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP3991
24 well plates	Corning	3473	Hydrophobic, ultra-low attachment surface
2x objective accessory	Olympus	110AL2X	Screw-on attachment
Anti-ATP5A primary antibody	Abcam	ab14748	Mouse monoclonal
Anti-bruchpilot primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Mouse monoclonal
Anti-discs large primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Mouse monoclonal
Anti-hrp primary antibody	Jackson Immuno Research	123-605-021	Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal
Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody	Millipore Sigma	04-263	Mouse monoclonal
Confocal Microscope	Olympus	FV1000	Objectives (NA):  10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40)
Coverslips	Corning	285022	160-190 mm thickness
Dissecting forceps	Fine Science Tools	11252-00	Dumont #5SF
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Formaldehyde	Fisher Scientific	BP531-500	37% stock stabilized with methanol
Goat anti-mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	115-545-146	Alexa Fluor 488 conjugated
Goat Serum	Novus Biologicals	NB036768	0.2 mm filtered
Laboratory sealing tape	Fisher Scientific	03-448-254	Parafilm M
Methanol	Fisher Scientific	A413
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-123	76mm x 25mm
Mounting media	Molecular Probes	S36972	Slowfade Diamond mounting media
Nonionic surfactant	Acros Organics	215680010	Triton-X 100
Nutator	Fisher Scientific	S06622
Phalloidin	Invitrogen	A34055	Alexa Fluor 555- conjugated
Sharpening stone	Fine Science Tools	29008-01
Silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	2423610	Sylgard 184