Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Dissektionstechnik, die die Architektur der neuromuskulären Verbindung bewahrt und eine detaillierte immunzytochemische Untersuchung von Motoneuronen im adulten Drosophila-Bein ermöglicht.

Zusammenfassung

Drosophila melanogaster stellt ein genetisch handhabbares Modell zur Untersuchung der neuronalen Struktur und Funktion sowie nachfolgender Veränderungen der Krankheitszustände dar. Die gut charakterisierte larvale neuromuskuläre Verbindung wird oft für solche Studien verwendet. Die schnelle Larvenentwicklung, gefolgt von Muskelhistolyse und Umbau des Nervensystems während der Metamorphose, macht dieses Modell jedoch problematisch für die Untersuchung langsamer altersabhängiger degenerativer Veränderungen, wie sie bei amyotropher Lateralsklerose auftreten. Alternativ leben erwachsene Fliegen 90 Tage lang und das erwachsene Bein kann verwendet werden, um Motoneuronveränderungen im Laufe der Erwachsenenlebensspanne mit In-vivo-Fluoreszenzbildgebung durch die Kutikula zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Beindissektionstechnik in Verbindung mit Immunzytochemie, die die Untersuchung molekularer Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung identifizierter adulter Beinmotorneuronen ermöglicht. Diese Techniken können mit einer Vielzahl von Antikörpern gekoppelt werden, die sowohl prä- als auch postsynaptische Strukturen markieren. Zusammen ermöglichen diese Verfahren eine vollständigere Charakterisierung langsamer altersabhängiger Veränderungen bei erwachsenen Fliegen und können auf mehrere Motoneuron-Krankheitsmodelle angewendet werden.

Einleitung

Motoneuronerkrankungen (MN) umfassen eine Gruppe heterogener Erkrankungen, zu denen eine fortschreitende Degeneration gehört, die zu Muskelschwund und Lähmung als primärem klinischem Phänotyp ^führt1. Obwohl selten mit einer globalen Prävalenz von 4,5 pro 100.000, wird erwartet, dass diese Prävalenz mit einer alternden Bevölkerung ^{zunehmen wird2}. Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist die häufigste MN-Erkrankung (MND) und verläuft in der Regel innerhalb kurzer Zeit nach der Diagnose tödlich, da keine krankheitsmodifizierenden Behandlungen verfügbar ^sind3. MNDs haben eine langwierige präsymptomatische Phase mit frühen molekularen Biomarkerveränderungen und funktionellen Bildgebungsveränderungen bei Patienten ^gemeinsam4. Frühe präsymptomatische zelluläre Pathologie wird auch in nicht-menschlichen Krankheitsmodellen beobachtet5,6,7,8. Die Untersuchung früher Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung ist wichtig für das Verständnis der Pathogenese der MN-Krankheit und kann bei der Entwicklung einer frühen Diagnostik und potenzieller Therapeutika helfen.

In Drosophila gibt es eine Fülle von genetischen und molekularen Werkzeugen, um die Struktur und Funktion der neuromuskulären Verbindung zu sezieren (NMJ, ^siehe9 für einen Überblick über die gut charakterisierte Larven-NMJ). Diese Werkzeuge in Kombination mit einer kurzen Lebensdauer machen Drosophila zu einem hervorragenden Modell, um neurodegenerative Veränderungen am NMJ zu untersuchen. Insbesondere sind MNs, die erwachsene Muskeln innervieren, während der gesamten ~ 90-tägigen Erwachsenenlebensspanne vorhanden und unterliegen normalen Alterungsprozessen10,11,12,13. Die adulten MNs bieten daher die Möglichkeit, langsame degenerative Veränderungen im Gegensatz zu Larven-NMJs zu untersuchen, die nur für einen kurzen Zeitraum von ~ 1 Woche vor der Metamorphose ^{existieren14,15}.

Hier beschreiben wir ein Dissektionsverfahren, mit dem wir eine immunzytochemische Analyse von MNs im erwachsenen Bein durchführen können. Jedes erwachsene Bein wird von ~ 50 MNs innerviert, die sich auf das zugehörige Beinmuskel synapsieren, um die Fortbewegung voranzutreiben. Die Beinanatomie, mechanische Physiologie und Neurobiologie wurde gut beschrieben16,17,18. Axon-Dorne von Bein-MNs wurden zuvor durch Bildgebung durch Kutikula in verfüllten oder genetisch markierten Zellpopulationen unter Verwendung des bipartiten Gal4 / UAS-Systems charakterisiert, und bildgebende Verfahren wurden zuvor ^{veröffentlicht19}. Die hier vorgestellten Dissektionsmethoden bewahren die Axonverzweigungsmorphologie und ermöglichen es uns, eine Vielzahl von Antikörpern zu nutzen, um verschiedene molekulare Komponenten des NMJ zu markieren. Unsere bisherigen Arbeiten konzentrierten sich auf Projektionen eines definierten MN im metathorakalen (3^.) Bein, das den Musculus tibia levator (tilm) innerviert und konsistente Arborisierungsmuster und Boutonzahlen aufweist. Zunächst untersuchten wir altersabhängige Veränderungen in Drosophila-Superoxid-Dismutase-1 (dsod1)-Mutanten und fanden Veränderungen, die mit dem Abbau des ^NMJ20 übereinstimmen. Diese Dissektionsmethoden bieten die Möglichkeit, langsame degenerative Veränderungen am NMJ für andere ALS-Modelle, grundlegende Studien des Alterns und andere MN-assoziierte Krankheiten besser zu charakterisieren.

Abbildung 1. Workflow-Zusammenfassung zum Sezieren von Beinen. Ausführliche Anweisungen finden Sie unter Protokoll. (A,B) Fliegen werden selektiert und betäubt. (C) Fliegen werden auf Methanol übertragen und mit PBS gewaschen. (D) Die metathorakalen Beine werden an der Basis der Coxa entfernt, während sie mit einem Seziermikroskop sichtbar gemacht werden (~ 30-fache Vergrößerung); Maßstabsleiste = 500 μm. (E) Die Beine werden dann in 3,7% iger Formaldehyd/ PBS (FA) -Lösung für 30 Minuten in Vertiefungen von 24-Well-Platten fixiert und dann WIRD FA durch Waschen mit PBS entfernt. (F, G, H) Die Beine werden auf Silikonelastomer-Sezierschalen übertragen und ein Stück Kutikula wird mit einer abgeschrägten Pinzette aus dem proximalen Femur entfernt, während es unter einem Seziermikroskop bei 80x visualisiert wird. Maßstabsleiste = 50 μm. (I) Die Beine werden nach der Dissektion in FA fixiert und in PBS und dann PBT (PBS+ 0,1% nichtionisches Tensid) gewaschen. (J) Die Beine werden einer immunzytochemischen Färbung unterzogen. (K,L) Die Beine werden auf einen Glasträger übertragen, in Montagemedien geklärt und mit einem Deckglas bedeckt, das Tonabstandshalter enthält. Maßstabsbalken = 2 mm und 500 μm. (M) Die Beine werden konfokal mikroskopisch abgetastet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

Die Verfahren zur Vorbereitung von Arbeitslösungen, die in Verbindung mit diesem Protokoll verwendet werden, sind in Tabelle 1 beschrieben.

Reagenz	Präparat			Lagerung
PBS	Machen Sie einen Arbeitsvorrat von 1x PBS aus einer 10x PBS-Stammlösung durch Verdünnen in destilliertem Wasser.  Der pH-Wert des PBS-Arbeitsbestands sollte 7,2- 7,4 betragen			4 °C für mehr als 1 Monat, bis eine bakterielle Kontamination sichtbar ist.
PBT	1x PBS-Lösung mit 0,1% nichtionischem Tensid.			4 °C für mehr als 1 Monat, bis eine bakterielle Kontamination sichtbar ist.
FA	3,7% ige Formaldehydlösung aus einem 37% igen Formaldehydvorrat und verdünnt in 1x PBS.			Raumtemperatur. Machen Sie jeden Tag der Sezierung frisch
	ACHTUNG: Formaldehyd, das als 37% ige Stammlösung geliefert wird, ist ein potenzielles Karzinogen und sollte in einem Abzug verdünnt werden.
5% NGS	5% normales Ziegenserum verdünnt in PBT.  Das verwendete Serum sollte mit der Spezies des zu verwendenden sekundären Antikörpers übereinstimmen.			4 °C für mehrere Wochen, bis eine bakterielle Kontamination sichtbar ist

Tabelle 1. Lösungen zur Durchführung der Immunzytochemie des adulten Drosophila-Beines .

1. Erstfixierung von Geweben

1. Wählen Sie ungefähr 10 Fliegen für jeden Genotyp und jedes Alter aus. Betäuben Sie auf einem Fliegenkissen unter Kohlendioxid (Abbildung 1A, B).
   HINWEIS: Beginnen Sie mit mehr Fliegen als nötig, um nach der Dissektion eine ausreichend große Stichprobengröße zu gewährleisten.
2. Fliegen mit einem Pinsel in einem Glastopf oder einer Schale für ca. 30 Sekunden bis 1 Minute in kaltes Methanol überführen (Abbildung 1C). Das Methanol löst die kutikulären Kohlenwasserstoffe und Fliegen können nun eingetaucht werden, anstatt in wässrigen Lösungen zu schwimmen.
3. Mit einer Pinzette fliegen vorsichtig auf PBS übertragen. Spülen Sie 3x in eiskaltem PBS, um überschüssiges Methanol zu entfernen, und halten Sie die Fliegen in PBS bis zur Dissektion und Fixierung auf Eis. An diesem Punkt sezieren Sie Fliegen und fixieren Sie sie innerhalb kürzester Zeit (<30 Minuten).
4. Um die Beine zu isolieren, übertragen Sie die Fliegen auf eine silikonelastische Dissektionsschale, die mit kaltem PBS gefüllt ist, entfernen Sie die metathorakalen Beine an der Coxa mit zwei Paar Dumont-Zangen # 5 oder schneiden Sie die Beine mit einer Vanna-Schere ab (Abbildung 1D). Übertragen Sie die Beine in einen Brunnen in einer Kunststoffplatte mit 24 Well, die mit 1 ml PBS gefüllt ist, und halten Sie die Platte auf Eis, bis alle Beine entfernt und in Brunnen übertragen wurden.
   HINWEIS: Jeder Brunnen kann mindestens 20 Beine halten.
5. Ersetzen Sie die PBS-Lösung durch 1 ml FA-Lösung, und drehen Sie sie 30 Minuten lang auf einem Nutator (Abbildung 1E). Die Nutatoreinstellung sollte auf eine mittlere Drehzahl (17 U/min) eingestellt werden. Stellen Sie sicher, dass die Beine während dieser Zeit vollständig in FA-Lösung eingetaucht sind, um eine ausreichende Fixierung zu gewährleisten.
6. Um FA-Lösung zu entfernen, waschen Sie 1 ml PBS 3x schnell ein, gefolgt von weiteren 3 Wäschen für jeweils 5 Minuten in 1 ml PBS. Halten Sie Gewebe in 1 ml PBS auf Eis vor und während der unten beschriebenen Dissektionsschritte.

2. Entfernen der Beinkutikula und Antikörperfärbung

1. Entfernen der Beinkutikula
   1. Die Sezierzange ist erfolgskritisch. Führen Sie leichte parallele Biegungen in beiden Zinken am Ende der superfeinen Pinzette Nr. 5 ein, um eine Fase zu erhalten, mit der die Nagelhaut oberflächlich gegriffen werden kann, anstatt gestochen zu werden, was das Gewebe ruinieren kann (Abbildung 1F, G).
      HINWEIS: Parallel gebogene Zinken sollten im geschlossenen Zustand über die gesamte Länge des Stiftes miteinander in Kontakt treten (Abbildung 2).
   2. Die Beine zur Dissektion in eine Silikonelastomerschale in PBS überführen. Richten Sie ein Bein so aus, dass die vordere Seite nach oben zeigt (siehe Abbildung 3 für Informationen zur Anatomie und Ausrichtung des Beines). Halten Sie das Tibiasegment mit einer Pinzette gegen die Silikonelastomerschale. Mit der anderen Pinzette, die mit der schrägen Seite nach unten gehalten wird, greifen Sie ein Stück Nagelhaut am distalen Ende des Femurs und ziehen Sie in die proximale Richtung zum Trochanter.
   3. Entfernen Sie die Nagelhaut methodisch, bis der nackte Muskel am proximalen Ende des Femurs sichtbar ist (Abbildung 1F, G, H).
      HINWEIS: Stellen Sie nur oberflächlichen Kontakt mit den Beinen her, indem Sie die abgeschrägte Seite der Pinzette verwenden, um ein Muskelziehen zu vermeiden.
   4. Sobald alle Beine seziert sind, ersetzen Sie PBS durch FA, um die Beine für 30 Minuten mit Schütteln an einem Nutator bei mittlerer Geschwindigkeit zu fixieren (Abbildung 1I). Waschen Sie die Proben in 1 ml PBS 3-mal schnell und dann 3-mal für jeweils 5 Minuten in PBT (Abbildung 1J).
      HINWEIS: Wenn Sie mit dem monoklonalen Antikörper NC82 (Anti-Bruchpilot) färben, um aktive Zonen zu markieren, nach der Fixierung für 20 Minuten, da dieses Antigen empfindlich auf längere Fixierungen reagiert.

Abbildung 2. Modifizierte Pinzette zum Sezieren von Erwachsenenbeinen. (A) Die Enden der Pinzette werden gebogen und dann unten abgeflacht (Pfeil), wodurch durch Feilen auf einem Schleifstein eine Abschrägung entsteht. (B) Im Gegensatz dazu sind die Zinken der unveränderten Pinzette nicht gebogen. Maßstabsleiste = 1 mm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Antikörperfärbung
   1. Um Gewebe für die Antikörperfärbung zu blockieren, ersetzen Sie 1 ml PBT durch blockierende Lösung, die aus 1 ml 5% NGS besteht, das in PBT verdünnt ist. Sezierte Beine 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C sezieren, während Sie auf einem Nutator mit mittlerer Drehzahl (17 U/min) schaukeln. Decken Sie bei allen Inkubationen zusätzlich zur Kunststoffabdeckung die Vertiefungen mit Dichtband ab (Abbildung 1J).
      HINWEIS: 24 Wellplatten werden für die Immunzytochemie anstelle von 1,5 ml oder 2 ml Mikrozentrifuge verwendet, da frühere Versuche, Mikrozentrifugenröhrchen zu verwenden, zu gebrochenen Beinen und beschädigtem Gewebe führten.
   2. Entfernen Sie die Blocklösung und fügen Sie 300 ml primäre Antikörper hinzu, die in frischer Blockierungslösung verdünnt sind. Das geringe Volumen des verwendeten Antikörpers sollte ausreichen, um das Gewebe zu bedecken. Verschließen Sie die Vertiefungen mit Laborabdichtungsband und Kunststoffdeckel erneut und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C unter Schütteln an einem Nutator mit mittlerer Geschwindigkeit (Abbildung 1J). Die Informationen und Konzentrationen des arbeitsfähigen Antikörperreagenzes, die für diese Studien verwendet wurden, sind in Tabelle 2 beschrieben.
   3. Primäre Antikörper in 1 ml PBT 3 mal kurz und dann 3 mal für jeweils 15 Minuten waschen (Abbildung 1J).
      HINWEIS: Verdünnte primäre Antikörper können gespeichert und wiederverwendet werden, wenn sie bei 4 °C für bis zu 2 Wochen gelagert werden.
   4. Blockieren Sie gewebe erneut in 1 ml 5% NGS für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C (Abbildung 1J).
   5. Entfernen Sie die 5% NGS-blockierende Lösung und fügen Sie 300 μL der entsprechenden verdünnten fluoreszierenden konjugierten sekundären Antikörper hinzu. Fügen Sie zusätzlich eine 1:2000-Verdünnung des fluoreszenzkonjugierten Phalloidins hinzu, um den Muskel zu markieren (Abbildung 1J).
   6. Für sekundäre Antikörperinkubationen versiegeln Sie Vertiefungen mit Labordichtband und Deckel. Wickeln Sie die Platten auch in Aluminiumfolie, um Fluorophore vor Licht zu schützen. 6-8 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   7. Waschen Sie sekundäre Antikörper und Phalloidin wie in Schritt 2.2.3 oben beschrieben. Abdeckplatten mit Aluminiumfolie zwischen den Waschungen, um Fluorophore vor Licht zu schützen.

3. Montagebeine

1. Übertragen Sie die Beine mit einer Pinzette auf eine Rutsche und richten Sie die vordere Seite nach oben aus. Bedecken Sie die Beine mit Montagemedien (Abbildung 1K, L).
   HINWEIS: Die sezierten Beine können mit einer P1000-Pipettenspitze abgesaugt werden, wenn die untere Bohrung durch Schneiden mit einer Rasierklinge verbreitert wird.
2. Fügen Sie Tonabstandhalter zu einem 22x22 ^mm2 Deckglas (# 1.5 Dicke) hinzu, indem Sie die Deckglasecken über eine kleine Kugel Modelliermasse kratzen. Jede Ecke sollte eine kleine Menge Ton von 1-2 mm Dicke haben (Abbildung 1K).
3. Um den Dia abzudecken, fügen Sie den Deckglas mit den Tonabstandshaltern hinzu, die zum Objektträger hin zeigen, und drücken Sie vorsichtig auf die Ecken, bis der Deckglas nur noch die Oberfläche des Femurs berührt.
4. Um eine Verdunstung zu verhindern, versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Nagellack und lassen Sie sie an einem dunklen Ort (ca. 10 Minuten) trocknen, bevor Sie sie bei 4 ° C bis zur Bildgebung aufbewahren.

4. Bildgebung

1. Aufnahme mit konfokalem Mikroskop (Abbildung 1M). Fügen Sie einen Durchlichtkanal hinzu, um die Qualität der Dissektion besser beurteilen zu können, und Proben mit sichtbar gestörten Muskelfasern im interessierenden Bereich sollten verworfen werden.
   1. Beginnen Sie mit der Bildgebung von Z-Stacks mit 20-facher Vergrößerung mit 2-fachem Zoom und einer Gesamtbildtiefe von ~ 40 mm, die der Dicke des Femurs entspricht. Für die Erkennung von Fluoreszenzsignalen nehmen Sie Bilder mit Auflösungen auf, die mit der Nyquist-Abtastung übereinstimmen (wir verwenden 1024 x 1024 Pixel mit einer Verweileinstellung von 8-10 μs/Pixel). Die Signalintensität sollte im linearen Bereich liegen, der durch Einstellen der Hohen Spannungsverstärkungseinstellungen erreicht wird. Sobald die Verstärkungseinstellungen für eine Reihe von Stichproben innerhalb eines Experiments festgelegt wurden, sollten sie nicht geändert werden, damit die Signalintensitäten zwischen den Stichproben verglichen werden können.
2. Zur Abbildung synaptischer Boutons und anderer subzellulärer Strukturen nehmen Sie konfokale Bilder mit ≥60-facher Vergrößerung auf. Die Detektoreinstellungen sollten im linearen Bereich liegen, während die Pixeldichte, die Verweildauereinstellungen und die Z-Tiefe für Bilder, die mit geringerer Vergrößerung aufgenommen wurden, ähnlich sein sollten (Schritt 4.1).

Ergebnisse

Abbildung 4 zeigt ein repräsentatives Beispiel für ein metathorakales Bein, das mit Anti-HRP, Anti-Dlg und Phalloidin gefärbt ist. Bei Dissektionen, bei denen die Nagelhaut aus dem proximalen Teil des Femurs entfernt wird, sind stereotype Dornen in der Nähe der Sehne sichtbar, die durch Autofluoreszenz leicht erkannt werden können. Beachten Sie, dass das Eindringen von Antikörpern in das Bein für eine kurze Strecke über den Bereich hinaus erfolgt, in dem die Kutikula entfernt wurde (Abbildung 4A). Diese Bereiche können effektiv abgebildet werden, wenn ein starkes Fluoreszenzsignal vorhanden ist. Die Bildgebung bei geringer Vergrößerung (20-fach mit 2-fachem Zoom) ermöglicht eine einfache Bestimmung von 1) wie viel Nagelhaut entfernt wird und 2) ob während der Dissektion Schäden aufgetreten sind. Eine erhöhte Vergrößerung (60-fach) zeigt stereotype Projektionen auf die Kachel (Abbildung 4B). Unsere Arbeit konzentrierte sich auf eine MN, die wahrscheinlich von der I-MN-Linie abgeleitet ist, die das Tilm im proximalen Femur innerviert (Kasten, Abbildung 4B und Abbildung 4C). Eine weitere Vergrößerung (100-fach mit 2-fachem Zoom) ermöglicht eine effektive Visualisierung synaptischer Boutons (Abbildung 4D).

Um morphologische Veränderungen am erwachsenen NMJ im Laufe der Zeit zu untersuchen, haben wir zuvor dsod1-Mutanten als Modell für ALS verwendet. Bouton-Schwellung tritt bei gealterten ^{dsod1H71Y-Mutanten} im Verhältnis zu dsod1null und dsod1⁺ auf (Abbildung 5A, B). Am Larven-NMJ wird häufig der monoklonale Antikörper NC82 verwendet, um aktive Zonen zu markieren, und dies kann diese Strukturen leicht am adulten NMJ sichtbar gemacht werden (Abbildung 5C). Schwach positive HRP-Axonäste sind in ^{dsod1H71Y-Mutanten} reichlich vorhanden und diese Zweige zeigen oft eine schwache und diffuse BRP-Lokalisation (Pfeile).

Wichtig für die Neurodegeneration ist, dass kommerziell erhältliche Antikörper ubiquitinierte Proteine nachweisen können, die häufig in Aggregaten vorkommen, und wir haben ubiquitinierte Aggregate in terminalen Axonen von MNs in gealterten mutierten Dsod1-Fliegen sowie innerhalb von Muskeln nachgewiesen (Abbildung 6A). Auch Antikörper, die Mitochondrien markieren, können morphologische Veränderungen mit dem Alter erkennen (Abbildung 6B).

Bei einigen Präparaten machen Muskelschäden während der Dissektion die Probe unbrauchbar. Zunächst können solche Schäden häufig auftreten, aber mit der Praxis tritt eine Verbesserung ein. Beispiele für gute Dissektionen zeigen Abbildung 7A, C, während schlechte Dissektionen in Abbildung 7B, D gezeigt werden. Schlechte Dissektionen verursachen eine Desorganisation der Muskelfasern, wie sie durch Phasenkontrastmikroskopie nachgewiesen wurde (Abbildung 7B), oder fehlende Muskelfasern, die durch fluoreszierend konjugiertes Phalloidin sichtbar gemacht werden (Abbildung 7D, Pfeil). Die Kombination aus der Verwendung von Phalloidin zur Markierung von Muskeln und Durchlichtbildern kann helfen, solche Muskelschäden zu erkennen, die bei der Betrachtung unter einem Seziermikroskop möglicherweise nicht offensichtlich sind.

Abbildung 3. Anatomie des Drosophila-Beines . (A) Diagramm der vorderen Seite eines metathorakalen Beines, gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Borsten im Gegensatz zu der markanten nackten Kutikula auf der hinteren Seite. Das segmentierte Bein besteht aus der Coxa (Cx), dem Trochanter (Tr), dem Femur (Fe), der Tibia (Ti), 5 Tarsalsegmenten (Ta1-5) und der Klaue (Cl) in der Reihenfolge von proximal (Pr) bis distal (Di). Dorsale (D) und ventrale (V) Seiten des Femurs sind ebenfalls indiziert. Maßstabsleiste =100 μm. (B) Diagramm des Femurs, der die Muskeln Tibia Levator (Tilm), Tibia Depressor (Tidm), Langer Sehnenmuskel 2 (ltm2) und Tibia Reduktor (Tirm) sowie Axonprojektionen im proximalen Femur enthält, die das Tilm innervieren. Es wird angenommen, dass diese stereotypen axonalen Projektionen von Neuroblasten der I-Linie abgeleitet ^sind16, und die zweite Arborisation ist am einfachsten durch Dissektion zugänglich (boxed). Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4. Der sezierte metathorakale Femur enthüllte eine stereotype MN-Architektur, die die Kachel innervierte. Die Immunzytochemie wurde verwendet, um Neuronen (HRP), Bandscheiben (DLG) und Muskeln (Phalloidin) zu markieren. Z-Stacks wurden mittels konfokaler Mikroskopie durch den gesamten Femur erfasst und als maximale Serienprojektion dargestellt. (A) Ein Durchlichtkanal wurde ebenfalls einbezogen, um zu veranschaulichen, dass während der Dissektion keine nachweisbaren Muskelschäden aufgetreten sind. Das Bild wurde mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen, Maßstabsleiste = 50 μm. (B) Identifizierte Dorne, die der Tilme zugeordnet sind (boxed area, center), Maßstabsleiste =20 μm; und (C) bei 60-facher Vergrößerung, Maßstabsbalken = 20 μm. (D) DLG-umgebende Boutons waren bei Wildtyptieren offensichtlich, wenn sie bei 100-facher Vergrößerung mit 2-fachem Zoom abgebildet wurden; Maßstabsleiste = 2 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5. Beispiel für altersabhängige Veränderungen in der Boutonmorphologie, die mit der Beindissektionstechnik nachgewiesen werden können. Bouton-Schwellungen werden bei gealterten ^{dsod1H71Y-Mutanten} beobachtet. (A) Repräsentative Bilder von HRP-gefärbten Boutons von jungen (neu veröffneten, Tag 0 Erwachsene) und alten (Tag 10) Fliegen, Maßstabsbalken = 1 μm. (B) Boutongrößen wurden aus den jeweiligen Genotypen mit der Maßfunktion in ImageJ quantifiziert. S<0,0001 (2-Wege-ANOVA mit Post-hoc-Tukey-Test). (C) Aktive Zonen innerhalb synaptischer Boutons, die mit dem monoklonalen Antikörper NC82 (Anti-Bruchpilot) markiert sind; Maßstabsleiste = 1 μm. Abbildung geändert ^von20Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6. Häufige Marker im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen, die in Drosophila-Beinpräparaten verwendet werden. (A) Subzelluläre polyubiquitinierte Aggregate werden in terminalen Axonen und Muskeln von gealterten ^{dsod1H71Y-Fliegen} nachgewiesen. Immunzytochemie mit Anti-Polyubiquitin (FK2) detektiert Puncta (Pfeile) in gealtertem dsod1H71Y^/H71Y, Maßstabsbalken = 20 μm (links) und 5 μm (rechts). (B) Geschwollene Mitochondrien können mit Anti-ATP5A nachgewiesen werden, Skala bar = 1 μm. Abbildung geändert ^von20Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7. Beispiele für gute und schlechte Dissektionen. (A) Dissektion, die die zugrunde liegende Muskelarchitektur nicht stört. (B) Ein Beispiel für eine schlechte Dissektion, die ausgefranste Muskelfasern (Pfeil) zeigte und nicht für die Analyse verwendet werden konnte. Beide Proben wurden mittels Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen. Maßstabsleiste = 50 μm. (C) Beispiel für eine gute Dissektion, aufgenommen durch konfokale Mikroskopie mit HRP (grün) und Phalloidin (blau). (D) Bei einer schlechten Dissektion fehlen dorsale Muskelfasern der TILM (Pfeil). Maßstabsleiste = 50 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Antikörper/Färbung	Verdünnung*
Anti-ATP5A	1:500
Anti-Bruchpilot (nc82)	1:20
Anti-Cystein-Stringprotein (ab49)	1:50
Anti-Discs groß (4F3)	1:200
Anti-HRP	1:550
Anti-Polyubiquitin (FK2)	1:1000
Anti-Repo (8D12)	1:5
Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper	1:800
Phalloidin	1:2000
	*Verdünnt in 5% NGS

Tabelle 2. Antikörper und Verdünnungen. Die kommerziellen Lieferanten der in diesen Studien verwendeten Antikörper sind in der Materialliste aufgeführt.

Diskussion

Das Drosophila Adult Leg ist ein ideales Modell zur Untersuchung der Neurodegeneration bei relativer Einfachheit mit gut charakterisierten MNs, die aus Neuroblastenlinien und stereotypen Arborisierungsmustern kartiert wurden. Mehrere Berichte haben zuvor Bein-MNs für die Untersuchung neurodegenerativer ^{Erkrankungen verwendet21,22}. Diese Studien verwendeten GFP-exprimierende Linien in Kombination mit Einer Mosaikanalyse mit einem repressiblen Zellmarker (MARCM), um durch die Kutikula zu blättern, und dokumentierten eine Reihe morphologischer Veränderungen. Die Bildgebung von adulten NMJs durch Immunzytochemie mit resezierter Kutikula ermöglicht eine weitere Charakterisierung mit der Fähigkeit, komplexe molekulare Veränderungen mit einer Toolbox von verfügbaren Antikörpern zu verfolgen.

Der immunzytochemische Teil dieses Protokolls ist relativ standardisiert und kann unabhängig vom Genotyp implementiert werden (siehe ²³ für eine ausgezeichnete Beschreibung allgemeiner Antikörperfärbemethoden zur Verwendung mit Drosophila). Darüber hinaus können Parameter wie Fluoreszenzintensität, Axonzweiglänge und Boutonzahlen und -größe mit einer Vielzahl verfügbarer ImageJ-Makros bestimmt werden, sobald Bilder aufgenommen und detaillierte Methoden für die quantitative Analyse veröffentlicht wurden (siehe z. B. 24,25,26). Daher ist die Dissektionstechnik die wichtigste Innovation, die hier beschrieben wird. Vor der Dissektion werden die Fliegen in einen Alkohol getaucht, um kutikuläre Kohlenwasserstoffe zu entfernen. Sowohl Ethanol als auch Methanol werden üblicherweise für diesen Zweck verwendet; Wir haben jedoch nur Methanol verwendet. Entscheidend für den Seziererfolg sind mehrere Faktoren: Erstens ermöglicht die Verwendung einer modifizierten Pinzette mit einer Fase einen sehr oberflächlichen Kontakt mit der Kutikula. Zweitens, mit einem Seziermikroskop, das in der Lage ist, eine 60-100-fache Gesamtvergrößerung durchzuführen, so dass die Oberfläche der Kutikula deutlich sichtbar ist. Für Mikroskope mit geringerer maximaler Vergrößerung sind für die meisten gängigen Marken 2-fache Objektive erhältlich und sollten in Kombination mit vorhandenen Linsen ausreichend sein. Drittens macht der anfängliche Fixierungsschritt die Nagelhaut brüchig und leichter wegzuziehen, ohne den darunter liegenden Muskel zu beschädigen. Eine Überfixierung bei diesem Schritt macht das gesamte Bein zu steif für eine effektive Dissektion. Daher sollte die anfängliche Fixierung auf 30 Minuten begrenzt sein. Das Formaldehyd-Fixiermittel dringt nicht genug ein, um das darunter liegende Gewebe während dieser kurzen Zeit effektiv zu vernetzen, und daher ist ein zweiter Fixierungsschritt erforderlich. Vor der zweiten Fixierung sollten Gewebe auf Eis gehalten werden, um Abbau und Veränderungen in der Morphologie zu verhindern. Viertens haben wir festgestellt, dass das Sezieren von Proben während Kälte ebenfalls wichtig ist, wahrscheinlich aus ähnlichen Gründen, da die Nagelhaut brüchig ist und ein kleines Stück leichter entfernt werden kann.

Mit der Praxis stellen wir fest, dass ~ 50% der Dissektionen innerhalb keiner erkennbaren Gewebeschädigung verwendbar sind. Obwohl dieser Prozentsatz im Vergleich zu einigen anderen Geweben niedrig erscheinen mag, ist der Dissektionsvorgang schnell und viele Beine können in 30-60 Minuten bearbeitet werden. Selbst wenn die Erfolgsraten anfangs niedrig sind, ist es daher möglich, 4-5 gute Proben für jede experimentelle Gruppe zu erhalten. Eine Einschränkung kann jedoch die Anzahl der zu einem bestimmten Zeitpunkt verfügbaren Fliegen sein, wenn Genotypen und/oder Alter zu einer erheblichen Letalität führen.

Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass wir aufgrund der Größe nicht in der Lage waren, andere Bereiche des Beines jenseits der proximalen Region des Femurs zu sezieren. So können wir identifizierte MN-Dorne, die das TILM innervieren, zuverlässig untersuchen und es ist möglich, die Kutikula über dem Musculus tibia depressor mit kleinen Veränderungen der Ausrichtung des Beines beim Sezieren zu sezieren. Der Zugang zu anderen Bereichen des Beines hat sich jedoch als schwieriger erwiesen, ohne die axonale Architektur während der Sezierung zu stören.

Hier stellen wir Dissektionsmethoden vor, um Veränderungen am adulten NMJ für definierte MNs zu erkennen, die das Tilm mittels Immunzytochemie innervieren. Das Bein ist nützlich als einfaches System, das nur von ~ 50 MNs innerviert wird und 14 Muskeln mit gut beschriebener Anatomie enthält. Das präparierte Beinpräparat kann über Genotypen hinweg verwendet werden und eine Reihe von Antikörpern steht für die NMJ-Visualisierung zur Verfügung, ohne dass genotypisch komplexe Bestände von Reportergenkonstrukten in mutierten Hintergründen aufgebaut werden müssen. Dieser Ansatz wird eine detailliertere Charakterisierung von Veränderungen am NMJ für MN-Erkrankungen und andere altersbedingte Erkrankungen ermöglichen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP3991
24 well plates	Corning	3473	Hydrophobic, ultra-low attachment surface
2x objective accessory	Olympus	110AL2X	Screw-on attachment
Anti-ATP5A primary antibody	Abcam	ab14748	Mouse monoclonal
Anti-bruchpilot primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Mouse monoclonal
Anti-discs large primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Mouse monoclonal
Anti-hrp primary antibody	Jackson Immuno Research	123-605-021	Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal
Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody	Millipore Sigma	04-263	Mouse monoclonal
Confocal Microscope	Olympus	FV1000	Objectives (NA):  10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40)
Coverslips	Corning	285022	160-190 mm thickness
Dissecting forceps	Fine Science Tools	11252-00	Dumont #5SF
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Formaldehyde	Fisher Scientific	BP531-500	37% stock stabilized with methanol
Goat anti-mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	115-545-146	Alexa Fluor 488 conjugated
Goat Serum	Novus Biologicals	NB036768	0.2 mm filtered
Laboratory sealing tape	Fisher Scientific	03-448-254	Parafilm M
Methanol	Fisher Scientific	A413
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-123	76mm x 25mm
Mounting media	Molecular Probes	S36972	Slowfade Diamond mounting media
Nonionic surfactant	Acros Organics	215680010	Triton-X 100
Nutator	Fisher Scientific	S06622
Phalloidin	Invitrogen	A34055	Alexa Fluor 555- conjugated
Sharpening stone	Fine Science Tools	29008-01
Silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	2423610	Sylgard 184