全麻醉血友病A小鼠尾静脉横断出血模型

摘要

麻醉小鼠的精制尾静脉横断（TVT）出血模型是评估血友病出血的灵敏 体内 方法。这种优化的TVT出血模型使用失血和出血时间作为终点，完善其他模型并避免死亡作为终点。

摘要

尾出血模型是血友病研究的重要工具，专门用于评估促凝剂效应。由于对临床相关剂量的FVIII敏感，尾静脉横断（TVT）生存模型在许多地区是首选，而其他已建立的模型（如尾夹模型）需要更高水平的促凝剂化合物。为了避免使用生存作为终点，我们开发了一个TVT模型，将失血和出血时间确定为终点，并在整个实验期间进行全麻醉。简而言之，将麻醉的小鼠定位，将尾巴浸没在温带盐水（37°C）中，并在右侧尾静脉中与测试化合物一起给药。5分钟后，使用模板导轨切除左外侧尾静脉，将尾巴返回到盐水，并在收集血液的同时监测并记录所有出血发作40分钟。如果在受伤后10分钟，20分钟或30分钟没有发生出血，则用湿纱布拭子拭子两次，轻轻地挑战凝块。40分钟后，通过出血到盐水中的血红蛋白量来量化失血量。这种快速且相对简单的过程导致一致且可重复的出血。与TVT生存模型相比，它使用更人道的程序，而不会影响对药物干预的敏感性。此外，可以使用两种性别，减少需要繁殖的动物总数，符合3R的原则。出血模型的潜在局限性是止血的随机性，这会降低模型的可重复性。为了解决这个问题，手动破坏凝块可确保在监测期间对凝块进行挑战，防止原发性（血小板）止血。对出血损伤模型目录的这一补充提供了一种选择，以标准化和人道的方式表征促凝剂效应。

引言

动物模型对于了解血友病的发病机制以及开发和测试治疗方案和疗法至关重要。因子VIII敲除小鼠（F8-KO）是研究血友病A^1，2的广泛使用的模型。这些小鼠概括了该疾病的关键特征，并已被广泛用于开发治疗，例如重组FVIII产品^3，4，5 和基因治疗策略^6，7。

有多种出血损伤模型用于评估不同止血化合物 在体内的药理作用。这些凝血模型之一是尾静脉横断术存活模型^{8，9，10，11，12，13，14}，测量血友病小鼠在尾部横断后血血后存活的能力。这种方法是在四十多年前¹⁵ 年引入的，至今仍在^{使用9，16，17}。然而，该模型利用生存作为终点，需要在长达24小时的时间内观察动物，在此期间动物是有意识的，因此可以经历疼痛和痛苦。

以前已经描述过持续时间较短且完全麻醉下的出血模型，例如尾夹模型（也称为尾尖）^{8，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28}.然而，为了在出血激发后使失血完全正常化，这些模型需要远高于临床施用的促凝剂化合物（例如FVIII）^的剂量29。麻醉下的另一种损伤模型，即沙芬纳静脉出血法，对较低剂量的促凝剂化合物³⁰敏感，但需要高水平的实验者干预，因为凝块必须经常破坏（而不是所提出的模型中的3次）。

标准化为测试新的促凝剂化合物的通用方案将大大促进实验室之间的数据比较^31，32，33。在TVT模型中，关于研究的终点（失血量^7，26，出血时间^9，34和存活率^35，36）尚未达成共识，并且实验长度因研究而异¹³。

我们的主要目标是描述和表征具有高可重复性的优化模型，按需研究的可能性以及预防性治疗，对相当于生存模型的药物干预的敏感性，但不使用死亡或濒临死亡作为终点。为了减轻疼痛和痛苦，动物在出血期间不应该有意识，需要实施更合乎道德的终点³⁷。

尾夹模型通常以两种变体之一进行，要么截肢尾尖，例如截肢1-5毫米^{18，19，20，21，23，24}，或者在更严重的变体中，在尾部直径约1-3毫米^8，22，25处截断.这会导致联合动静脉出血，因为侧静脉和背静脉以及腹动脉通常被切断，并且通常截肢越大，对促凝化合物的敏感性越低。此外，由于尾尖被截肢，动静脉损伤暴露在没有任何对立组织的情况下;因此，至少在理论上，它与最常见的血友病出血不同。

顾名思义，在如本文所述的尾静脉横断模型中，只有静脉受伤，从而导致完全静脉出血。由于血管未完全切断，因此预计损伤将小于截肢模型，并且保留切口周围的组织（凝块可能粘附）。此外，与动脉相比，静脉中的血压较低。这些因素有助于相对于截肢模型增加敏感性，因此可以通过临床相关剂量的替代治疗（例如，在血友病A中使用rFVIII）实现出血正常化，这有助于评估促凝治疗效果的大小和持久性^26，38，39。

研究方案

本议定书中描述的所有程序均已获得诺和诺德公司动物福利机构以及丹麦食品、农业和渔业部丹麦动物实验监察局的批准。优化的 40 分钟方法在设计中包括麻醉和给药时间（图 1）。该手术需要10-16周龄的两性血友病小鼠。

1. 研究前的准备工作

1. 以正确的浓度制备加液。
2. 开始水浴并加热至37°C。 用盐水（0.9%NaCl）填充15mL离心管以收集血液。
3. 在实验开始前至少15分钟，将15mL盐水管置于加热底板的孔中。
4. 识别小鼠并记录其重量。避免处理不必要的老鼠，因为这会导致压力并影响研究。
5. 在继续之前，在通风橱中准备工作站，以便一切都触手可及:餐巾纸，尾架，纱布，注射器，手术刀，秒表和血流记谱纸。
6. 将尾印和切割块放在加热板上 - 冷块会使静脉收缩，从而影响出血。

2. 麻醉

1. 在通风橱内进行异氟醚麻醉程序。
2. 将气体汽化器最初设置为5%异氟醚，在麻醉室中以30%O₂/70%N₂O，流量为1 L / min。允许足够的时间使麻醉室充满（约5分钟，具体取决于腔室体积和气体流速）。确保快速诱导（少于一分钟）。
3. 将小鼠置于麻醉室中，直到它们失去意识。
   注意:如果腔室充满，这应该在一分钟或更短的时间内发生。
4. 通过对踏板反射（牢固的脚趾捏合）没有痛苦的反应来确保适当的麻醉。
5. 将小鼠放在加热板上，确保鼻子在鼻锥中。
6. 将麻醉剂在30%O 2/70%N₂ O中降低至₂%异氟醚的维持水平，并在小鼠上方放置塑料盖以减少热量损失。涂抹合适的眼药膏，以防止麻醉时干燥。
7. 使用尾部标记块以直径2.5毫米标记尾巴。不要将尾巴强行插入块中的狭缝中 - 它必须紧贴（补充图1）
8. 将尾部置于盐水管中至少5分钟，以确保温暖的尾静脉最适合静脉注射（静脉注射）。

3. 测试溶液的加样

1. 将一只小鼠放在尾架中，将鼻子放在麻醉面罩中。
2. 用目标化合物（在本例中为rFVIII）给动物加药，然后立即启动秒表（t = 0）。
3. 将鼠标放回加热板上，尾巴在盐管中。与其他小鼠重复该过程。

4. 进行尾静脉横断

1. 给药后正好5分钟进行尾静脉横断。将尾部放在切割块中并转动90°以暴露静脉（补充图2）。
2. 在从测试溶液加样的另一侧/静脉进行切割。
3. 将#11手术刀刀片穿过夹持尾巴的切割块的狭缝，以产生出血。重置秒表，立即将尾部放回盐水。

5. 观测时间及挑战

1. 观察出血并注释整个40分钟内出血的开始和停止;在血流记谱纸上注释它。
   注意:由于主观性，这种出血的视觉评估可能略有不同。
2. 原发性出血必须在切口后3分钟内停止。如果不是这种情况，请取消小鼠的资格，安乐死和更换（未能停止原发性出血可能表明损伤太严重或缺乏原发性止血，如vWF KO小鼠）。
3. 如果在受伤后 10 分钟、20 分钟和 30 分钟没有出血，请按照步骤 4-5 中所述挑战尾部切口。
4. 使用浸泡在温盐水中的纱布拭子，从保存在水浴中的单独管中。将尾巴从生理盐水中取出，用湿纱布在尾巴切口的远端方向轻轻擦拭两次。
5. 每次挑战后，立即将尾巴再次浸入盐管中。
6. 在t = 40分钟时，通过从盐管中取出尾巴来停止采血。

6. 血液采样

1. t = 40分钟后，从眶上静脉获取血液样本。

7. 安乐死

1. 在完全麻醉下通过宫颈脱位对小鼠实施安乐死。

8. 样品处理

1. 在室温下用盐水在4000× g 下离心15mL血液收集管5分钟。
2. 从15mL管中弃去上清液，将沉淀重悬于2-14mL红细胞（RBC）裂解溶液中，然后稀释至达到淡咖啡色。
3. 注意总体积（血液体积+使用管上的刻度标记添加的红细胞（RBC）裂解溶液体积）。
4. 将2mL稀释液转移到血红蛋白管中并冷藏直至血红蛋白分析。
5. 通过测量生理盐水中的血红蛋白浓度来确定失血量。在酶标仪上测量550nm处的吸光度（材料表）。
6. 使用从人血红蛋白制备的标准曲线（材料表）将吸光度转换为nmol血红蛋白，并用RBC裂解溶液校正稀释。

9. 统计分析

1. 使用适当的软件分析数据。这里使用了GraphPad Prism软件。在一系列研究中，发现以下统计方法表现良好。
   注意:分析失血量，出血时间，暴露，血小板计数和血细胞比容;使用Brown-Forsythe和Welch方差分析检验（因为数据是连续的，但没有残差的方差均匀性），应用Dunnett检验来调整多重比较。皮尔逊测试用于测试出血时间，失血量和剂量之间的相关性。为了确定ED₅₀ 值，将四参数逆对数（剂量）反应方程拟合到出血和失血数据。为了分析性别效应，使用了双向方差分析检验，应用Bonferroni校正来调整多重比较。显著性水平定义为 P < 0.05。数据显示为SEM±均值。

结果

为了评估优化模型的适用性，在用市售重组因子VIII替代疗法（rFVIII）施用的F8-KO（C57BL遗传背景）小鼠中进行了研究;测试了四种不同的剂量:1 IU / kg，5 IU / kg，10 IU / kg和20 IU / kg。此外，我们使用C57BL小鼠作为阳性对照组，在F8-KO小鼠和野生型（WT）组中测试了相应的载体（阴性）对照，以评估模型中的反应范围。

在优化方案之后，与载体组相比，rFVIII治疗组的失血量显着减少?...

讨论

与TVT生存方法相比，这种优化的尾静脉横断（TVT）方法具有几个优点。在整个研究期间，动物被完全麻醉，这使得小鼠处理更容易，并增加了动物的健康。此外，与TVT生存模型不同，不需要过夜观察，并且这种优化的模型提供了测量失血量和观察40分钟内确切出血时间的可能性。此外，意识动物出血时间较长会导致血液出血，导致动物疼痛和痛苦，并可能产生压力，可能导致变异增加

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo