מודל דימום טרנסקציה של וריד זנב בהמופיליה מורדמת לחלוטין עכברים

Summary

מודל הדימום של זנב זנב מעודן (TVT) בעכברים מורדמים הוא שיטת in vivo רגישה להערכת דימום המופילי. מודל דימום TVT ממוטב זה משתמש באובדן דם ובזמן דימום כנקודות קצה, תוך זיקוק מודלים אחרים והימנעות ממוות כנקודת קצה.

Abstract

מודלים של דימום זנב הם כלים חשובים בחקר המופיליה, במיוחד להערכת השפעות פרו-קרישיות. מודל ההישרדות של טרנסקציה של ורידי זנב (TVT) הועדף במסגרות רבות בשל רגישות למינונים רלוונטיים מבחינה קלינית של FVIII, בעוד שמודלים מבוססים אחרים, כגון מודל קליפ הזנב, דורשים רמות גבוהות יותר של תרכובות פרוקו-קרישיות. כדי להימנע משימוש בהישרדות כנקודת קצה, פיתחנו מודל TVT המבסס איבוד דם וזמן דימום כנקודות קצה והרדמה מלאה במהלך הניסוי כולו. בקצרה, עכברים מורדמים ממוקמים כאשר הזנב שקוע במי מלח ממוזגים (37 מעלות צלזיוס) ומנונים עם תרכובת הבדיקה בווריד הזנב הצדדי הימני. לאחר 5 דקות, וריד הזנב הצדדי השמאלי עובר טרנסקט באמצעות מדריך תבנית, הזנב מוחזר למלח, וכל פרקי הדימום מנוטרים ומתועדים במשך 40 דקות תוך כדי איסוף הדם. אם לא מתרחש דימום במשך 10 דקות, 20 דקות או 30 דקות לאחר הפציעה, הקריש מאותגר בעדינות על ידי ניגוב החתך פעמיים עם ספוגית גזה רטובה. לאחר 40 דקות, איבוד הדם מכמת על ידי כמות המוגלובין שמדמם לתוך המלח. הליך מהיר ופשוט יחסית זה גורם לדימומים עקביים הניתנים לשחזור. בהשוואה למודל ההישרדות של TVT, הוא משתמש בהליך הומני יותר מבלי לפגוע ברגישות להתערבות פרמקולוגית. יתר על כן, ניתן להשתמש בשני המינים, מה שמקטין את המספר הכולל של בעלי החיים שיש לגדל, תוך שמירה על עקרונות ה-3R's. מגבלה פוטנציאלית במודלים של דימום היא האופי הסטוכסטי של המוסטזיס, אשר יכול להפחית את יכולת השכפול של המודל. כדי להתמודד עם זה, הפרעה ידנית לקריש מוודאת שהקריש מאותגר במהלך הניטור, ומונעת מהמוסטזיס ראשוני (טסיות דם) לעצור את הדימום. תוספת זו לקטלוג מודלים של פציעה מדממת מספקת אפשרות לאפיין השפעות פרו-קרישיות באופן סטנדרטי והומני.

Introduction

מודלים של בעלי חיים חיוניים להבנת הפתוגנזה של המופיליה ולפיתוח ובדיקה של משטרי טיפול וטיפולים. עכבר הנוק-אאוט פקטור VIII (F8-KO) הוא מודל נפוץ לחקר המופיליה A ^1,2. עכברים אלה מסכמים תכונות מרכזיות של המחלה ונמצאים בשימוש נרחב לפיתוח טיפולים, כגון מוצרי FVIII רקומביננטיים ^3,4,5 ואסטרטגיות ריפוי^{גנטי 6,7}.

ישנם מודלים שונים של פציעת דימום להערכת ההשפעות הפרמקולוגיות של תרכובות המוסטטיות שונות in vivo. אחד ממודלים אלה של קרישה הוא מודל ההישרדות של טרנסאקציה של ורידי זנב בעכברים 8,9,10,11,12,13,14, המודד את יכולתם של עכברים המופיליים לשרוד אקסנגווינציה לאחר טרנסקציה של הזנב. שיטה זו הוצגה לפני יותר מארבעה עשורים לפני¹⁵ ועדיין נעשה בה שימוש ^9,16,17. עם זאת, המודל מנצל את ההישרדות כנקודת קצה ודורש תצפית על בעלי החיים במשך תקופה של עד 24 שעות, שבמהלכה בעלי החיים בהכרה ולכן יכולים לחוות כאב ומצוקה.

מודלים של דימום של משך זמן קצר יותר ותחת הרדמה מלאה תוארו בעבר, כגון מודל קליפ הזנב (הידוע גם בשם קצה הזנב)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . עם זאת, לצורך נורמליזציה מלאה של אובדן הדם לאחר אתגר הדימום, מודלים אלה דורשים מינונים של תרכובות פרו-קרישיות (למשל, FVIII) גבוהות בהרבה מאלו שניתנו קלינית²⁹. מודל פציעה אחר בהרדמה, שיטת הדימום של הווריד saphena, רגיש למינונים נמוכים יותר של תרכובות פרוקו-קרישיות³⁰ אך דורש רמה גבוהה של התערבות נסיינית מכיוון שיש לשבש את הקרישים לעתים קרובות (בניגוד ל-3 פעמים במודל המוצג).

סטנדרטיזציה לקראת פרוטוקול משותף לבדיקת תרכובות פרוקו-קרישיות חדשות תקל מאוד על השוואת נתונים בין מעבדות 31,32,33. במודלים של TVT, אין עדיין הסכמה משותפת על נקודות קצה שנחקרו (איבוד דם ^7,26, זמן דימום ^9,34 ושיעור הישרדות^35,36), ואורך הניסוי משתנה בין מחקרים¹³.

המטרה העיקרית שלנו היא לתאר ולאפיין מודל אופטימלי עם יכולת שכפול גבוהה, את האפשרות ללמוד לפי דרישה כמו גם טיפול מניעתי, רגישות להתערבות פרמקולוגית המקבילה למודל ההישרדות, אך לא להשתמש במוות או כמעט מוות כנקודות קצה. על מנת להפחית את הכאב והמצוקה, בעלי החיים לא צריכים להיות בהכרה במהלך הדימום ויש ליישם נקודת קצה אתית יותר³⁷.

דגמי קליפס זנב נערכים בדרך כלל באחת משתי גרסאות, או קטיעת קצה הזנב, למשל, קטיעה של 1-5 מ"מ 18,19,20,20,21,23,24 או, בגרסה חמורה יותר, קטיעת קוטר זנב סביב 1-3 מ"מ ^8,22,25 . זה גורם לדימום עורקי משולב, שכן הוורידים הצדדיים והגבריים והעורק הגחוני מנותקים בדרך כלל, ובאופן כללי, ככל שהקטיעה גדולה יותר, כך הרגישות לתרכובת פרוקו-קרישית נמוכה יותר. יתר על כן, מכיוון שקצה הזנב נקטע, הפגיעה העורקית נחשפת ללא כל רקמה מנוגדת; לכן, לפחות בתיאוריה, הוא שונה מהדימומים ההמופיליים הנפוצים ביותר.

כפי שהשם מרמז, רק הווריד נפגע במודלים של טרנסקציה של וריד זנב כמו המתואר במאמר זה, וכתוצאה מכך נוצר דימום ורידי בלבד. מכיוון שהכלי אינו מנותק לחלוטין, הפציעה צפויה להיות קטנה יותר מאשר במודלי הקטיעה, והרקמה סביב החתך, שקריש עשוי לדבוק בה, נשמרת. בנוסף, יש לחץ דם נמוך יותר בווריד לעומת העורק. גורמים אלה תורמים לרגישות מוגברת ביחס למודלים של קטיעה, כך שניתן להשיג נורמליזציה של דימום עם מינונים רלוונטיים מבחינה קלינית של טיפול חלופי, למשל, עם rFVIII בהמופיליה A, אשר שימושי להערכת הגודל והעמידות של ההשפעות של טיפול פרוקו-קרישי 26,38,39.

Protocol

כל הנהלים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הגוף לרווחת בעלי חיים ב- Novo Nordisk A/S, והפיקוח הדני על ניסויים בבעלי חיים, משרד המזון, החקלאות והדיג הדני. שיטת 40 הדקות הממוטבת כוללת הרדמה וזמן מינון בתכנון (איור 1). עכברים המופיליים משני המינים בין 10-16 שבועות נדרשים להליך זה.

1. הכנות לפני המחקר

1. הכן את פתרונות המינון בריכוזים הנכונים.
2. התחילו את אמבט המים וחממו עד 37 מעלות צלזיוס. מלאו את צינורות הצנטריפוגה של 15 מ"ל לאיסוף דם במי מלח (0.9% NaCl).
3. מניחים את צינורות המלח של 15 מ"ל בחורים בלוח הבסיס המחומם לפחות 15 דקות לפני תחילת הניסוי.
4. זהה את העכברים ותעד את משקלם. הימנעו מטיפול בעכברים יותר מהנדרש מכיוון שהדבר עלול לגרום ללחץ ולהשפיע על המחקר.
5. הכינו את תחנת העבודה במכסה האדים לפני שתמשיכו כך שהכל יהיה בהישג יד: מפיות, מחזיק זנב, גזה, מזרקים, אזמלים, שעוני עצר ונייר סימון זרימת דם.
6. מניחים את סימן הזנב וחותכים בלוקים על צלחת החימום - בלוקים קרים יגרמו לוורידים להתכווץ ובכך להשפיע על הדימום.

2. הרדמה

1. לבצע את הליך ההרדמה איזופלורן בתוך מכסה אדים.
2. הגדר את מכשיר אידוי הגז ל-5% איזופלורן בתחילה ב-30% O₂/70% N₂O בתא ההרדמה עם זרימה של 1 ליטר לדקה. אפשר מספיק זמן עד שתא ההרדמה יתמלא (כ-5 דקות בהתאם לנפח התא ולקצב זרימת הגז). הקפידו על אינדוקציה מהירה (פחות מדקה אחת).
3. מניחים את העכברים בתא ההרדמה עד שהם מאבדים את הכרתם.
   הערה: זה אמור להתרחש תוך דקה או פחות אם החדר מלא מספיק.
4. הבטיחו הרדמה נכונה על ידי היעדר תגובה כואבת לרפלקס הדוושה (צביטה חזקה בבוהן).
5. הניחו את העכברים על צלחת החימום, וודאו שהאף נמצא בקונוס האף.
6. הפחיתו את ההרדמה לרמת תחזוקה של 2% איזופלורן ב-30% O₂/70% N₂O והניחו כיסוי פלסטיק מעל העכברים כדי להפחית את אובדן החום. יש למרוח משחה מתאימה לעיניים כדי למנוע יובש בהרדמה.
7. סמן את הזנב בקוטר של 2.5 מ"מ באמצעות בלוק סימן הזנב. אל תכריחו את הזנב לתוך החריץ שבגוש - הוא חייב להתאים בנוחות (איור משלים 1)
8. מניחים את הזנב בצינור המלוח למשך 5 דקות לפחות כדי להבטיח וריד זנב חם האופטימלי למינון תוך ורידי (כלומר).

3. מינון של פתרון בדיקה

1. מניחים עכבר אחד במחזיק הזנב עם האף במסכת הרדמה.
2. מנה את החיה עם תרכובת העניין (במקרה זה, rFVIII) ומיד להפעיל את שעון העצר (t = 0).
3. הניחו את העכבר בחזרה על צלחת החימום עם הזנב בצינור המלוח. חזור על ההליך עם העכברים האחרים.

4. ביצוע טרנסקציה של ורידים בזנב

1. בצע את הטרנסקציה של וריד הזנב בדיוק 5 דקות לאחר המינון. מניחים את הזנב בבלוק החיתוך ומסובבים 90° כדי לחשוף את הווריד (איור משלים 2).
2. בצעו את החתך בצד הנגדי/וריד שממנו הונחה תמיסת הבדיקה.
3. ציירו את להב האזמל מספר 11 דרך החריץ של גוש החיתוך המחזיק את הזנב כדי ליצור דימום. אפס את שעון העצר והחזיר את הזנב מיד למלח.

5. זמן תצפית ואתגרים

1. שימו לב לדימום וביארו את ההתחלה והעצירה של הדימום במשך 40 דקות; לבאר אותו על נייר סימון זרימת הדם.
   הערה: הערכה חזותית זו של דימום עשויה להשתנות מעט עקב הסובייקטיביות.
2. הדימום הראשוני חייב להיפסק תוך 3 דקות לאחר ביצוע החתך. אם זה לא המקרה, לפסול את העכבר, להרדים ולהחליף (אי עצירת הדימום הראשוני יכול להצביע על פציעה חמורה מדי או היעדר המוסטזיס ראשוני, כמו בעכברי vWF KO).
3. אם אין דימום ב-10 דקות, 20 דקות ו-30 דקות לאחר הפציעה, קראו תיגר על חתך הזנב כמתואר בשלבים 4-5.
4. השתמשו במטוש גזה ספוג במי מלח חמים מצינור נפרד שנשמר באמבט המים. הרימו את הזנב מתוך המלוח ונגבו ברכות פעמיים עם הגזה הרטובה בכיוון דיסטלי מעל חתך הזנב.
5. לאחר כל אתגר, מיד להטביע מחדש את הזנב לתוך צינור מלוח שוב.
6. בשעה 40 דקות, עצרו את איסוף הדם על ידי הסרת הזנב מהצינור המלוח.

6. דגימת דם

1. לאחר t = 40 דקות, קבל דגימות דם מהווריד הסופראורביטלי.

7. המתת חסד

1. להרדים את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם בעודם עדיין בהרדמה מלאה.

8. טיפול בדגימות

1. צנטריפוגה צינורות איסוף הדם 15 מ"ל עם מלח ב 4000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. השליכו את הסופרנאטנט מצינורות ה-15 מ"ל, החזירו את הכדור ב-2-14 מ"ל של תמיסת ליסינג אריתרוציטים (RBC), ואז דיללו אותה עד שתגיע לצבע קפה בהיר.
3. שים לב לנפח הכולל (נפח הדם + נפח של אריתרוציטים (RBC) תמיסת שינון שנוספו באמצעות סימני הסיום על הצינור).
4. מעבירים 2 מ"ל של הדילול לצינור המוגלובין ומכניסים אותו למקרר עד לניתוח ההמוגלובין.
5. קבע את אובדן הדם על ידי מדידת ריכוז ההמוגלובין במי מלח. מדוד את הספיגה ב- 550 ננומטר על קורא מיקרו-פלטה (טבלת חומרים).
6. המר את הספיגה להמוגלובין nmol באמצעות עקומה סטנדרטית שהוכנה מהמוגלובין אנושי (טבלת חומרים) ונכונה לדילול עם תמיסת ליסינג RBC.

9. ניתוחים סטטיסטיים

1. נתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה. כאן נעשה שימוש בתוכנת פריזמה GraphPad. על פני מגוון מחקרים, השיטות הסטטיסטיות הבאות נמצאו כבעלות ביצועים טובים.
   הערה: כדי לנתח אובדן דם, זמן דימום, חשיפה, ספירת טסיות דם והמטוקריט; נעשה שימוש במבחן בראון-פורסייט ו-ANOVA וולש, (מכיוון שהנתונים היו רציפים אך ללא הומוגניות שונות של השאריות) תוך יישום המבחן של דאנט כדי להתאים את עצמו להשוואות מרובות. בדיקה של פירסון שימשה לבדיקת קורלציות בין זמן הדימום, איבוד הדם והמינונים. כדי לקבוע ערכי ED₅₀ , משוואת תגובה של ארבעה פרמטרים של יומן הפוך (מינון) הותאמה לנתוני דימום ואיבוד דם. כדי לנתח את האפקט המגדרי, נעשה שימוש במבחן ANOVA דו-כיווני, תוך יישום תיקון בונפרוני כדי להתאים את עצמו להשוואות מרובות. רמת המובהקות הוגדרה כ-P < 0.05. הנתונים מוצגים כאמצעים ± SEM.

תוצאות

כדי להעריך את הישימות של המודל הממוטב, בוצע מחקר בעכברי F8-KO (רקע גנטי C57BL) שניתנו עם טיפול חלופי של גורם רקומביננטי VIII הזמין מסחרית (rFVIII); נבדקו ארבעה מינונים שונים: 1 IU/kg, 5 IU/kg, 10 IU/kg ו-20 IU/kg. יתר על כן, בדקנו את בקרת הרכב המתאימה (שלילית) בעכברי F8-KO ובקבוצות מסוג פרא (WT) תוך שימוש בעכברי C57BL כקבוצת ב?...

Discussion

לשיטה אופטימלית זו של טרנסקציה של ורידי זנב (TVT) יש מספר יתרונות בהשוואה לשיטת ההישרדות של TVT. בעלי החיים מורדמים לחלוטין במשך כל משך המחקר, מה שהופך את הטיפול בעכברים לקל יותר ומגביר את רווחת בעלי החיים. יתר על כן, בניגוד למודל ההישרדות של TVT, אין צורך בתצפית לילה, ומודל מותאם זה מציע את האפשר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo