Modelo de sangrado por transyección de la vena de la cola en ratones con hemofilia A totalmente anestesiada

Resumen

El modelo de sangrado de transección refinada de la vena de la cola (TVT) en ratones anestesiados es un método sensible in vivo para la evaluación del sangrado hemofílico. Este modelo optimizado de sangrado TVT utiliza la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado como puntos finales, refinando otros modelos y evitando la muerte como punto final.

Resumen

Los modelos de sangrado de cola son herramientas importantes en la investigación de la hemofilia, específicamente para la evaluación de los efectos procoagulantes. El modelo de supervivencia de la transección de la vena de la cola (TVT) se ha preferido en muchos entornos debido a la sensibilidad a las dosis clínicamente relevantes de FVIII, mientras que otros modelos establecidos, como el modelo de clip de la cola, requieren niveles más altos de compuestos procoagulantes. Para evitar el uso de la supervivencia como punto final, desarrollamos un modelo de TVT que establece la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado como puntos finales y la anestesia completa durante todo el experimento. Brevemente, los ratones anestesiados se colocan con la cola sumergida en solución salina templada (37 ° C) y se dosifican con el compuesto de prueba en la vena lateral derecha de la cola. Después de 5 min, la vena de la cola lateral izquierda se transecta utilizando una guía de plantilla, la cola se devuelve a la solución salina y todos los episodios de sangrado se monitorean y registran durante 40 minutos mientras se recolecta la sangre. Si no se produce sangrado a los 10 minutos, 20 minutos o 30 minutos después de la lesión, el coágulo se desafía suavemente limpiando el corte dos veces con un hisopo de gasa húmeda. Después de 40 min, la pérdida de sangre se cuantifica por la cantidad de hemoglobina sangrada en la solución salina. Este procedimiento rápido y relativamente simple da como resultado hemorragias consistentes y reproducibles. En comparación con el modelo de supervivencia TVT, utiliza un procedimiento más humano sin comprometer la sensibilidad a la intervención farmacológica. Además, es posible utilizar ambos sexos, reduciendo el número total de animales que necesitan ser criados, en cumplimiento de los principios de las 3R. Una limitación potencial en los modelos de sangrado es la naturaleza estocástica de la hemostasia, que puede reducir la reproducibilidad del modelo. Para contrarrestar esto, la interrupción manual del coágulo asegura que el coágulo sea desafiado durante el monitoreo, evitando que la hemostasia primaria (plaquetaria) detenga el sangrado. Esta adición al catálogo de modelos de lesiones hemorrágicas proporciona una opción para caracterizar los efectos procoagulantes de una manera estandarizada y humana.

Introducción

Los modelos animales son esenciales para comprender la patogénesis de la hemofilia y desarrollar y probar regímenes de tratamiento y terapias. El ratón knock-out factor VIII (F8-KO) es un modelo ampliamente utilizado para el estudio de la hemofilia A ^1,2. Estos ratones recapitulan características clave de la enfermedad y han sido ampliamente utilizados para el desarrollo de tratamientos, como los productos FVIII recombinantes ^3,4,5 y las estrategias de terapia génica ^6,7.

Existen varios modelos de lesiones hemorrágicas para evaluar los efectos farmacológicos de diferentes compuestos hemostáticos in vivo. Uno de estos modelos de coagulación es el modelo de supervivencia de la transección de la vena de la cola en ratones ^{8,9,10,11,12,13,14}, que mide la capacidad de los ratones hemofílicos para sobrevivir a la exsanguinación después de la transección de la cola. Este método se introdujo hace más de cuatro décadas¹⁵ y todavía se utiliza ^9,16,17. Sin embargo, el modelo utiliza la supervivencia como punto final y requiere la observación de los animales durante un período de hasta 24 h, durante el cual los animales están conscientes y, por lo tanto, pueden experimentar dolor y angustia.

Anteriormente se han descrito modelos sangrantes de menor duración y bajo anestesia completa, como el modelo de clip de cola (también conocido como punta de cola)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Sin embargo, para una normalización completa de la pérdida de sangre después del desafío hemorrágico, estos modelos requieren dosis de compuestos procoagulantes (por ejemplo, FVIII) mucho más altas que las administradas clínicamente²⁹. Un modelo de lesión diferente bajo anestesia, el método de sangrado de vena saphena, es sensible a dosis más bajas de compuestos procoagulantes³⁰, pero requiere un alto nivel de intervención del experimentador, ya que los coágulos deben interrumpirse con frecuencia (a diferencia de 3 veces en el modelo presentado).

La estandarización hacia un protocolo común para probar nuevos compuestos procoagulantes facilitaría en gran medida la comparación de datos entre laboratorios 31,32,33. En los modelos de TVT, aún no existe un acuerdo común sobre los criterios de valoración estudiados (pérdida de sangre ^7,26, tiempo de sangrado ^9,34 y tasa^{de supervivencia 35,36}), y la duración experimental varía entre los estudios¹³.

Nuestro objetivo principal es describir y caracterizar un modelo optimizado con alta reproducibilidad, la posibilidad de estudiar bajo demanda así como un tratamiento profiláctico, sensibilidad a la intervención farmacológica equivalente al modelo de supervivencia, pero sin utilizar la muerte o la casi muerte como criterios de valoración. Para reducir el dolor y la angustia, los animales no deben estar conscientes durante el sangrado y se debe implementar un punto final más ético³⁷.

Los modelos de clip de cola generalmente se llevan a cabo en una de dos variantes, ya sea amputando la punta de la cola, por ejemplo, amputación de 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 o, en una variante más severa, transectada a un diámetro de cola alrededor de 1-3 mm ^8,22,25 . Esto causa una hemorragia arteriovenosa combinada, ya que las venas lateral y dorsal y la arteria ventral generalmente se cortan, y en general, cuanto mayor es la amputación, menor es la sensibilidad a un compuesto procoagulante. Además, dado que la punta de la cola está amputada, la lesión arteriovenosa se expone sin ningún tejido opuesto; por lo tanto, al menos en teoría, es diferente a las hemorragias hemofílicas más comunes.

Como su nombre lo indica, solo la vena se lesiona en los modelos de transección de la vena de la cola como los descritos en este documento, lo que resulta en una hemorragia exclusivamente venosa. Dado que el vaso no está completamente cortado, se espera que la lesión sea más pequeña que en los modelos de amputación, y el tejido alrededor del corte, al que puede adherirse un coágulo, se retiene. Además, hay una presión arterial más baja en la vena en comparación con la arteria. Estos factores contribuyen a una mayor sensibilidad en relación con los modelos de amputación, de modo que la normalización de la hemorragia se puede lograr con dosis clínicamente relevantes de terapia de reemplazo, por ejemplo, con rFVIII en la hemofilia A, lo que es útil para evaluar la magnitud y durabilidad de los efectos del tratamiento procoagulante 26,38,39.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Organismo de Bienestar Animal de Novo Nordisk A/S, y la Inspección Danesa de Experimentos Con Animales, el Ministerio danés de Alimentación, Agricultura y Pesca. El método optimizado de 40 minutos incluye anestesia y tiempo de dosificación en el diseño (Figura 1). Se requieren ratones hemofílicos de ambos sexos entre las 10-16 semanas de edad para este procedimiento.

1. Preparativos previos al estudio

1. Prepare las soluciones dosificadoras en las concentraciones correctas.
2. Inicie el baño de agua y caliente a 37 °C. Llene los tubos centrífugos de 15 ml para la extracción de sangre con solución salina (0,9% naCl).
3. Coloque los tubos salinos de 15 ml en los orificios de la placa base calentada al menos 15 minutos antes del inicio del experimento.
4. Identifique a los ratones y registre su peso. Evite manipular ratones más de lo necesario, ya que esto puede causar estrés y afectar el estudio.
5. Prepare la estación de trabajo en la campana extractora antes de continuar para que todo esté a su alcance: servilletas, soporte de cola, gasa, jeringas, bisturíes, cronómetros y papel de notación de flujo sanguíneo.
6. Coloque la marca de la cola y los bloques de corte en la placa de calentamiento: los bloques fríos harán que las venas se contraigan y, por lo tanto, afectarán el sangrado.

2. Anestesia

1. Realice el procedimiento anestésico de isoflurano dentro de una campana extractora de humos.
2. Ajuste el vaporizador de gas a inicialmente 5% de isoflurano en 30% O₂/70% N₂O en la cámara de anestesia con 1 L/min de flujo. Deje suficiente tiempo para que la cámara de anestesia se llene (aproximadamente 5 minutos dependiendo del volumen de la cámara y la tasa de flujo de gas). Asegurar una inducción rápida (menos de un minuto).
3. Coloque a los ratones en la cámara de anestesia hasta que pierdan el conocimiento.
   NOTA: Esto debe ocurrir dentro de un minuto o menos si la cámara está suficientemente llena.
4. Asegurar una anestesia adecuada por la ausencia de respuesta dolorosa al reflejo del pedaleo (pellizco firme del dedo del pie).
5. Coloque los ratones en la placa de calentamiento, asegurándose de que la nariz esté en el cono de la nariz.
6. Reducir la anestesia a un nivel de mantenimiento de 2% de isoflurano en 30% O₂/70% N₂O y colocar una cubierta de plástico sobre los ratones para reducir la pérdida de calor. Aplique un ungüento adecuado para los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
7. Marque la cola en un diámetro de 2,5 mm utilizando el bloque de marca de cola. No fuerce la cola en la hendidura del bloque, debe ajustarse perfectamente (Figura suplementaria 1)
8. Coloque la cola en el tubo salino durante al menos 5 minutos para asegurar una vena de la cola caliente que sea óptima para la dosificación intravenosa (i.v.).

3. Dosificación de la solución de prueba

1. Coloque un ratón en el soporte de la cola con la nariz en una máscara de anestesia.
2. Dosifique al animal con el compuesto de interés (en este caso, rFVIII) e inicie inmediatamente el cronómetro (t = 0).
3. Coloque el ratón de nuevo en la placa calefactora con la cola en el tubo salino. Repita el procedimiento con los otros ratones.

4. Realización de la transección de la vena de la cola

1. Realice la transección de la vena de la cola exactamente 5 minutos después de la dosificación. Coloque la cola en el bloque de corte y gire 90° para exponer la vena (Figura suplementaria 2).
2. Realice el corte en el lado opuesto / vena desde donde se dosificó la solución de prueba.
3. Dibuje la hoja de bisturí # 11 a través de la hendidura del bloque de corte que sostiene la cola para crear sangrado. Restablezca el cronómetro y devuelva la cola inmediatamente a la solución salina.

5. Tiempo de observación y desafíos

1. Observe el sangrado y anote el inicio y la detención del sangrado a lo largo de 40 minutos; anotarlo en el papel de notación del flujo sanguíneo.
   NOTA: Esta evaluación visual del sangrado puede variar ligeramente debido a la subjetividad.
2. El sangrado primario debe detenerse dentro de los 3 minutos posteriores a la realización del corte. Si este no es el caso, descalificar al ratón, sacrificar y reemplazar (no detener la hemorragia primaria puede indicar una lesión demasiado grave o falta de hemostasia primaria, como en los ratones vWF KO).
3. Si no hay sangrado a los 10 minutos, 20 minutos y 30 minutos después de la lesión, desafíe el corte de la cola como se describe en los pasos 4-5.
4. Use un hisopo de gasa empapado en solución salina tibia de un tubo separado que se mantiene en el baño de agua. Levante la cola de la solución salina y limpie suavemente dos veces con la gasa húmeda en una dirección distal sobre el corte de la cola.
5. Después de cada desafío, vuelva a sumergir inmediatamente la cola en el tubo salino nuevamente.
6. A t = 40 min, detenga la recolección de sangre retirando la cola del tubo salino.

6. Muestreo de sangre

1. Después de t = 40 min, obtenga muestras de sangre de la vena supraorbitaria.

7. Eutanasia

1. Eutanasiar a los ratones por dislocación cervical mientras aún están bajo anestesia completa.

8. Tratamiento de muestras

1. Centrifugar los tubos de extracción de sangre de 15 ml con solución salina a 4000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
2. Deseche el sobrenadante de los tubos de 15 ml, vuelva a suspender el pellet en 2-14 ml de solución lisadora de eritrocitos (RBC) y luego diluya hasta que alcance un color de café claro.
3. Tenga en cuenta el volumen total (volumen de sangre + volumen de solución de lisado de eritrocitos (RBC) agregado utilizando las marcas de graduación en el tubo).
4. Transfiera 2 ml de la dilución a un tubo de hemoglobina y refrigere hasta el análisis de hemoglobina.
5. Determine la pérdida de sangre midiendo la concentración de hemoglobina en la solución salina. Mida la absorbancia a 550 nm en un lector de microplacas (Tabla de Materiales).
6. Convertir la absorbancia a nmol de hemoglobina utilizando una curva estándar preparada a partir de hemoglobina humana (Tabla de Materiales) y corregir la dilución con solución lisante de glóbulos rojos.

9. Análisis estadísticos

1. Analice los datos utilizando el software adecuado. Aquí se utilizó el software GraphPad Prism. En una variedad de estudios, se encontró que los siguientes métodos estadísticos tuvieron un buen desempeño.
   NOTA: Para analizar la pérdida de sangre, el tiempo de sangrado, la exposición, los recuentos de plaquetas y el hematocrito; Se utilizó la prueba ANOVA de Brown-Forsythe y Welch, (ya que los datos eran continuos pero sin homogeneidad de varianza de los residuos) aplicando la prueba de Dunnett para ajustar las comparaciones múltiples. Se utilizó una prueba de Pearson para detectar correlaciones entre el tiempo de sangrado, la pérdida de sangre y las dosis. Para determinar los valores de ED₅₀ , se ajustó una ecuación de respuesta de registro inverso (dosis) de cuatro parámetros a los datos de sangrado y pérdida de sangre. Para analizar el efecto de género, se utilizó una prueba ANOVA bidireccional, aplicando la corrección de Bonferroni para ajustar las comparaciones múltiples. El nivel de significancia se definió como P < 0,05. Los datos se muestran como medios ± SEM.

Resultados

Para evaluar la aplicabilidad del modelo optimizado, se realizó un estudio en ratones F8-KO (fondo genético C57BL) administrados con una terapia de reemplazo de factor VIII recombinante disponible comercialmente (rFVIII); se probaron cuatro dosis diferentes: 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg y 20 UI/kg. Además, probamos el control correspondiente del vehículo (negativo) en ratones F8-KO y el grupo de tipo salvaje (WT) utilizando ratones C57BL como grupo de control positivo para evaluar el rango de respuesta en el modelo.

Discusión

Este método optimizado de transección de la vena de la cola (TVT) tiene varias ventajas en comparación con el método de supervivencia de TVT. Los animales están completamente anestesiados durante toda la duración del estudio, lo que facilita el manejo del ratón y aumenta el bienestar animal. Además, a diferencia del modelo de supervivencia TVT, no se requiere observación nocturna, y este modelo optimizado ofrece la posibilidad de medir la pérdida de sangre y observar el tiempo exacto de sangrado durante 40 min....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo