꼬리 정맥 transection 출혈 모델 완전 마취 혈우병 A 마우스에서

요약

마취된 마우스에서의 정제된 꼬리 정맥 횡단절(TVT) 출혈 모델은 혈우병성 출혈의 평가를 위한 민감한 생체내 방법이다. 이 최적화 된 TVT 출혈 모델은 혈액 손실과 출혈 시간을 종점으로 사용하여 다른 모델을 정제하고 사망을 종점으로 피합니다.

초록

꼬리 출혈 모델은 혈우병 연구에서 중요한 도구이며, 특히 procoagulant 효과의 평가를위한 것입니다. 꼬리 정맥 transection (TVT) 생존 모델은 FVIII의 임상 관련 용량에 대한 민감성으로 인해 많은 설정에서 선호되는 반면, 꼬리 클립 모델과 같은 다른 확립 된 모델은 더 높은 수준의 프로응고제 화합물을 필요로합니다. 생존을 종점으로 사용하지 않기 위해, 우리는 전체 실험 동안 혈액 손실과 출혈 시간을 종점 및 완전 마취로 확립하는 TVT 모델을 개발했습니다. 간단히 말해서, 마취 된 마우스는 꼬리가 온대 식염수 (37 ° C)에 잠겨있는 채로 위치되고 오른쪽 측면 꼬리 정맥에 시험 화합물과 함께 투여됩니다. 5 분 후, 왼쪽 측면 꼬리 정맥은 템플릿 가이드를 사용하여 횡단되고, 꼬리는 식염수로 되돌아 가며, 혈액을 수집하는 동안 모든 출혈 에피소드를 모니터링하고 40 분 동안 기록합니다. 부상 후 10 분, 20 분 또는 30 분에 출혈이 발생하지 않으면 젖은 거즈 면봉으로 절단을 두 번 닦아 혈전을 부드럽게 도전합니다. 40분 후, 혈액 손실은 식염수로 피흘린 헤모글로빈의 양에 의해 정량화된다. 이 빠르고 비교적 간단한 절차는 일관되고 재현 가능한 출혈을 초래합니다. TVT 생존 모델과 비교할 때, 약리학 적 개입에 대한 민감성을 손상시키지 않고보다 인간적인 절차를 사용합니다. 또한 두 성별을 모두 사용하여 3R의 원칙을 준수하여 사육해야하는 동물의 총 수를 줄일 수 있습니다. 출혈 모델의 잠재적 한계는 지혈의 확률적 특성이며, 이는 모델의 재현성을 감소시킬 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 수동 혈전 파괴는 모니터링 중에 혈전이 도전 받도록 보장하여 원발성 (혈소판) 지혈이 출혈을 멈추게합니다. 출혈 손상 모델의 카탈로그에 추가된이 추가는 표준화되고 인도적인 방식으로 procoagulant 효과를 특성화하는 옵션을 제공합니다.

서문

동물 모델은 혈우병의 발병 기전을 이해하고 치료 요법 및 치료법을 개발하고 테스트하는 데 필수적입니다. 인자 VIII 녹아웃 마우스 (F8-KO)는 혈우병 A ^1,2의 연구에 널리 사용되는 모델이다. 이들 마우스는 질병의 주요 특징을 재분석 하고, 재조합 FVIII 제품 3,4,5 및 유전자 치료 전략 ^6,7과 같은 치료법의 개발에 널리 사용되어 왔다.

생체내에서 상이한 지혈성 화합물의 약리학적 효과를 평가하기 위한 다양한 출혈 손상 모델이 있다. 이러한 응고 모델 중 하나는 마우스 8,9,10,11,12,13,14에서

프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 Novo Nordisk A / S의 동물 복지 기관과 덴마크 동물 실험 검사원, 덴마크 식품, 농수산부의 승인을 받았습니다. 최적화된 40분 방법은 설계에 마취 및 투약 시간을 포함한다(그림 1). 이 절차를 위해서는 10-16 주 사이의 두 성별의 혈우병 마우스가 필요합니다.

1. 연구 전 준비

1. 투약 용액을 올바른 농도로 준비하십시오.
2. 수조를 시작하고 37°C로 가열한다. 혈액 수집을 위해 15 mL 원심분리 튜브를 식염수 (0.9% NaCl)로 채운다.
3. 15 mL 식염수 튜브를 실험 시작 최소 15분 전에 가온된 베이스 플레이트의 구멍에 놓는다.
4. 마우스를 확인하고 체중을 기록하십시오. 이것이 스트레스를 유발하고 연구에 영향을 줄 수 있으므로 필요한 것보다 더 많은 마우스를 다루지 마십시오.
5. 진행하기 전에 흄 후드에 워크 스테이션을 준비하여 냅킨, 꼬리 홀더, 거즈, 주사기, 메스, 스톱워치 및 혈류 표기법 용지와 같은 모든 것이 도달 할 수 있도록하십시오.
6. 가열판에 꼬리 표시와 절단 블록을 놓으십시오 - 차가운 블록은 정맥을 수축시켜 출혈에 영....

결과

최적화된 모델의 적용가능성을 평가하기 위해, 시판되는 재조합 인자 VIII 대체 요법 (rFVIII)을 투여한 F8-KO (C57BL 유전적 배경) 마우스에서 연구를 수행하였다; 네 가지 다른 복용량이 테스트되었습니다 : 1 IU / kg, 5 IU / kg, 10 IU / kg 및 20 IU / kg. 또한, C57BL 마우스를 양성 대조군으로 사용하여 F8-KO 마우스 및 야생형(WT) 그룹에서 상응하는 비히클(음성) 대조군을 시험하여 모델에서의 반응 범위를 평가하?.......

토론

꼬리 정맥 횡단 (TVT)의이 최적화 된 방법은 TVT 생존 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 동물은 전체 연구 기간 동안 완전히 마취되어 마우스 취급이 쉬워지고 동물 복지가 향상됩니다. 또한, TVT 생존 모델과 달리 야간 관찰이 필요하지 않으며,이 최적화 된 모델은 혈액 손실을 측정하고 40 분 동안 정확한 출혈 시간을 관찰 할 수있는 가능성을 제공합니다. 또한, 의식이있는 동물에서 출혈의 더 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo