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요약

마취된 마우스에서의 정제된 꼬리 정맥 횡단절(TVT) 출혈 모델은 혈우병성 출혈의 평가를 위한 민감한 생체내 방법이다. 이 최적화 된 TVT 출혈 모델은 혈액 손실과 출혈 시간을 종점으로 사용하여 다른 모델을 정제하고 사망을 종점으로 피합니다.

초록

꼬리 출혈 모델은 혈우병 연구에서 중요한 도구이며, 특히 procoagulant 효과의 평가를위한 것입니다. 꼬리 정맥 transection (TVT) 생존 모델은 FVIII의 임상 관련 용량에 대한 민감성으로 인해 많은 설정에서 선호되는 반면, 꼬리 클립 모델과 같은 다른 확립 된 모델은 더 높은 수준의 프로응고제 화합물을 필요로합니다. 생존을 종점으로 사용하지 않기 위해, 우리는 전체 실험 동안 혈액 손실과 출혈 시간을 종점 및 완전 마취로 확립하는 TVT 모델을 개발했습니다. 간단히 말해서, 마취 된 마우스는 꼬리가 온대 식염수 (37 ° C)에 잠겨있는 채로 위치되고 오른쪽 측면 꼬리 정맥에 시험 화합물과 함께 투여됩니다. 5 분 후, 왼쪽 측면 꼬리 정맥은 템플릿 가이드를 사용하여 횡단되고, 꼬리는 식염수로 되돌아 가며, 혈액을 수집하는 동안 모든 출혈 에피소드를 모니터링하고 40 분 동안 기록합니다. 부상 후 10 분, 20 분 또는 30 분에 출혈이 발생하지 않으면 젖은 거즈 면봉으로 절단을 두 번 닦아 혈전을 부드럽게 도전합니다. 40분 후, 혈액 손실은 식염수로 피흘린 헤모글로빈의 양에 의해 정량화된다. 이 빠르고 비교적 간단한 절차는 일관되고 재현 가능한 출혈을 초래합니다. TVT 생존 모델과 비교할 때, 약리학 적 개입에 대한 민감성을 손상시키지 않고보다 인간적인 절차를 사용합니다. 또한 두 성별을 모두 사용하여 3R의 원칙을 준수하여 사육해야하는 동물의 총 수를 줄일 수 있습니다. 출혈 모델의 잠재적 한계는 지혈의 확률적 특성이며, 이는 모델의 재현성을 감소시킬 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 수동 혈전 파괴는 모니터링 중에 혈전이 도전 받도록 보장하여 원발성 (혈소판) 지혈이 출혈을 멈추게합니다. 출혈 손상 모델의 카탈로그에 추가된이 추가는 표준화되고 인도적인 방식으로 procoagulant 효과를 특성화하는 옵션을 제공합니다.

서문

동물 모델은 혈우병의 발병 기전을 이해하고 치료 요법 및 치료법을 개발하고 테스트하는 데 필수적입니다. 인자 VIII 녹아웃 마우스 (F8-KO)는 혈우병 A 1,2의 연구에 널리 사용되는 모델이다. 이들 마우스는 질병의 주요 특징을 재분석 하고, 재조합 FVIII 제품 3,4,5 및 유전자 치료 전략 6,7과 같은 치료법의 개발에 널리 사용되어 왔다.

생체내에서 상이한 지혈성 화합물의 약리학적 효과를 평가하기 위한 다양한 출혈 손상 모델이 있다. 이러한 응고 모델 중 하나는 마우스 8,9,10,11,12,13,14에서 꼬리 정맥 횡단 생존 모델이며, 꼬리 횡단 후 삼출에서 생존하는 혈우병 마우스의 능력을 측정합니다. 이 방법은 40 년 전에도입 된 15 세 이상이며 여전히 9,16,17 명이 사용됩니다. 그러나이 모델은 생존을 종점으로 활용하고 최대 24 시간 동안 동물을 관찰해야하며, 그 동안 동물은 의식이 있으므로 통증과 고통을 경험할 수 있습니다.

꼬리 클립 모델 (꼬리 끝이라고도 함)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28과 같은 더 짧은 지속 시간 및 완전 마취하의 출혈 모델은 이전에 기술되었습니다. . 그럼에도 불구하고, 출혈 챌린지 후 혈액 손실의 완전한 정상화를 위해, 이들 모델은 임상적으로 투여된 것보다 훨씬 더 높은 전구응고 화합물 (예를 들어, FVIII)의 투여량을 필요로 한다29. 마취 하의 다른 손상 모델인 베나 사페나 출혈 방법은 낮은 용량의 프로응고제 화합물30에 민감하지만 혈전이 자주 중단되어야 하기 때문에 높은 수준의 실험자 개입이 필요합니다(제시된 모델에서 3회와 반대).

새로운 프로응고제 화합물을 시험하기 위한 공통 프로토콜로의 표준화는 실험실(31,32,33) 간의 데이터 비교를 크게 촉진할 것이다. TVT 모델에서, 연구 종점 (혈액 손실7,26, 출혈 시간9,34 및 생존율35,36)에 대한 공통된 합의는 아직 없으며, 실험 길이는 연구13에 따라 다릅니다.

우리의 주요 목표는 높은 재현성, 주문형 연구 가능성, 예방 적 치료, 생존 모델과 동등한 약리학 적 개입에 대한 민감성, 그러나 죽음이나 죽음에 가까운 죽음을 종점으로 사용하지 않는 최적화 된 모델을 설명하고 특성화하는 것입니다. 고통과 고통을 줄이기 위해, 동물들은 출혈 중에 의식해서는 안되며,보다 윤리적 인 종점이 구현되어야합니다37.

꼬리 클립 모델은 일반적으로 꼬리의 끝을 절단하거나, 예를 들어, 1-5 mm 18,19,20,21,23,24의 절단 또는 더 심한 변형에서, 꼬리 직경 약 1-3 mm 8,22,25에서 횡단하는 두 가지 변형 중 하나로 수행됩니다. . 이것은 측면 및 등쪽 정맥과 복부 동맥이 일반적으로 절단되기 때문에 결합 된 동맥 출혈을 일으키며, 일반적으로 절단이 클수록 procoagulant 화합물에 대한 민감도가 낮아집니다. 또한, 꼬리 끝이 절단되기 때문에, 동정맥 손상은 반대 조직없이 노출됩니다. 따라서, 적어도 이론적으로는, 가장 흔한 혈우병 출혈과 다르다.

이름에서 알 수 있듯이,이 논문에 설명 된 것과 같은 꼬리 정맥 횡단 모델에서 정맥 만 손상되어 독점적으로 정맥 출혈이 발생합니다. 혈관이 완전히 절단되지 않았기 때문에, 손상은 절단 모델에서보다 작을 것으로 예상되며, 혈전이 부착 될 수있는 절단 주위의 조직은 유지됩니다. 또한, 동맥과 반대로 정맥에 낮은 혈압이 있습니다. 이러한 요인들은 절단 모델에 비해 증가된 민감성에 기여하여, 출혈의 정상화가 임상적으로 관련된 대체 요법의 투여량, 예를 들어, 혈우병 A의 rFVIII를 사용하여 달성될 수 있도록 하며, 이는 전구응고제 치료 26,38,39의 효과의 크기 및 내구성을 평가하는데 유용하다.

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프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 Novo Nordisk A / S의 동물 복지 기관과 덴마크 동물 실험 검사원, 덴마크 식품, 농수산부의 승인을 받았습니다. 최적화된 40분 방법은 설계에 마취 및 투약 시간을 포함한다(그림 1). 이 절차를 위해서는 10-16 주 사이의 두 성별의 혈우병 마우스가 필요합니다.

1. 연구 전 준비

  1. 투약 용액을 올바른 농도로 준비하십시오.
  2. 수조를 시작하고 37°C로 가열한다. 혈액 수집을 위해 15 mL 원심분리 튜브를 식염수 (0.9% NaCl)로 채운다.
  3. 15 mL 식염수 튜브를 실험 시작 최소 15분 전에 가온된 베이스 플레이트의 구멍에 놓는다.
  4. 마우스를 확인하고 체중을 기록하십시오. 이것이 스트레스를 유발하고 연구에 영향을 줄 수 있으므로 필요한 것보다 더 많은 마우스를 다루지 마십시오.
  5. 진행하기 전에 흄 후드에 워크 스테이션을 준비하여 냅킨, 꼬리 홀더, 거즈, 주사기, 메스, 스톱워치 및 혈류 표기법 용지와 같은 모든 것이 도달 할 수 있도록하십시오.
  6. 가열판에 꼬리 표시와 절단 블록을 놓으십시오 - 차가운 블록은 정맥을 수축시켜 출혈에 영향을 미칩니다.

2. 마취

  1. 흄 후드 내부에서 이소플루란 마취 절차를 수행하십시오.
  2. 가스 기화기를 1 L/min 유량의 마취 챔버의 30%O2/70%N2O에서 초기에 5% 이소플루란으로 설정하십시오. 마취 챔버가 채워지도록 충분한 시간을 허용하십시오 (챔버 부피 및 가스 유량에 따라 약 5 분). 빠른 유도를 보장하십시오 (1 분 미만).
  3. 마우스가 의식을 잃을 때까지 마취실에 두십시오.
    참고: 챔버가 충분히 채워진 경우 분 이내에 이 문제가 발생해야 합니다.
  4. 페달 반사 (단단한 발가락 꼬집음)에 대한 고통스러운 반응이없는 상태에서 적절한 마취를 보장하십시오.
  5. 마우스를 가열 플레이트에 놓고 코가 코 콘에 있는지 확인하십시오.
  6. 마취를 30% O2/70% N2O에서2% 이소플루란의 유지 수준으로 감소시키고 열 손실을 줄이기 위해 마우스 위에 플라스틱 덮개를 놓는다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 적절한 눈 연고를 바르십시오.
  7. 꼬리 마크 블록을 사용하여 직경 2.5mm로 꼬리를 표시하십시오. 꼬리를 블록의 슬릿에 강제로 넣지 마십시오 - 꼭 맞아야합니다 (보충 그림 1)
  8. 정맥 내 (즉) 투여에 최적 인 따뜻한 꼬리 정맥을 보장하기 위해 적어도 5 분 동안 식염수 튜브에 꼬리를 넣으십시오.

3. 시험액의 투약

  1. 마취 마스크에 코가있는 꼬리 홀더에 마우스 하나를 놓습니다.
  2. 동물에게 관심있는 화합물 (이 경우, rFVIII)을 투여하고 즉시 스톱워치 (t = 0)를 시작하십시오.
  3. 마우스를 식염수 튜브의 꼬리가있는 가열 플레이트 위에 다시 놓습니다. 다른 마우스와 함께 절차를 반복하십시오.

4. 꼬리 정맥 횡단 수행

  1. 투여 후 정확히 5 분 후에 꼬리 정맥 transection을 수행하십시오. 꼬리를 절단 블록에 놓고 90° 회전하여 정맥을 노출시킵니다(보충 그림 2).
  2. 시험 용액이 투여 된 곳에서 반대쪽 / 정맥에서 절단을 수행하십시오.
  3. 꼬리를 잡고있는 절단 블록의 슬릿을 통해 # 11 메스 블레이드를 그려 출혈을 일으 킵니다. 스톱워치를 재설정하고 꼬리를 즉시 식염수로 되돌립니다.

5. 관찰 시간과 도전 과제

  1. 출혈을 관찰하고 40 분 동안 출혈의 시작과 중지에 주석을 달으십시오. 혈류 표기법 용지에 주석을 달으십시오.
    참고 : 출혈에 대한이 시각적 평가는 주관성으로 인해 약간 다를 수 있습니다.
  2. 일차 출혈은 절단이 이루어진 후 3 분 이내에 중단되어야합니다. 그렇지 않은 경우, 마우스를 실격시키고, 안락사시키고, 교체한다(원발성 출혈을 중단하지 않으면 vWF KO 마우스에서와 같이 너무 심한 손상 또는 원발성 지혈 결여를 나타낼 수 있다).
  3. 부상 후 10 분, 20 분 및 30 분에 출혈이 없으면 4-5 단계에 설명 된대로 꼬리 절단에 도전하십시오.
  4. 수조에 보관 된 별도의 튜브에서 따뜻한 식염수에 담근 거즈 면봉을 사용하십시오. 식염수에서 꼬리를 들어 올리고 젖은 거즈로 꼬리 컷 위의 원위 방향으로 부드럽게 두 번 닦으십시오.
  5. 각 도전 후, 즉시 꼬리를 식염수 튜브에 다시 잠급니다.
  6. t = 40 분에, 식염수 튜브에서 꼬리를 제거하여 혈액 수집을 중지하십시오.

6. 혈액 샘플링

  1. t = 40 분 후, 상기 상궤도 정맥으로부터 혈액 샘플을 수득한다.

7. 안락사

  1. 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시키는 동안 여전히 완전한 마취하에 있습니다.

8. 샘플의 처리

  1. 15 mL 혈액 수집 튜브를 식염수로 실온에서 5분 동안 4000 x g 에서 원심분리한다.
  2. 15 mL 튜브에서 상층액을 버리고 펠렛을 적혈구 (RBC) 용해 용액 2-14 mL에 재현탁 한 다음 가벼운 커피 색상에 도달 할 때까지 희석하십시오.
  3. 총 부피 (혈액의 부피 + 적혈구의 부피 (RBC) 용해 용액은 튜브의 졸업 마크를 사용하여 추가됨)에 유의하십시오.
  4. 희석액 2 mL를 헤모글로빈 튜브로 옮기고 헤모글로빈 분석이 이루어질 때까지 냉장 보관한다.
  5. 식염수 중의 헤모글로빈 농도를 측정하여 혈액 손실을 결정한다. 마이크로플레이트 리더 상에서 550 nm에서의 흡광도를 측정하였다(표 재료).
  6. 인간 헤모글로빈으로부터 제조된 표준 곡선 (표 물질)을 사용하여 흡광도를 nmol 헤모글로빈 으로 변환하고 RBC 용해 용액으로 희석을 보정한다.

9. 통계 분석

  1. 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 여기에 그래프 패드 프리즘 소프트웨어가 사용되었습니다. 다양한 연구를 통해 다음과 같은 통계 방법이 잘 수행되는 것으로 나타났습니다.
    참고: 혈액 손실, 출혈 시간, 노출, 혈소판 수 및 헤마토크릿을 분석하려면; Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 검정을 사용하여 (데이터는 연속적이지만 잔차의 분산 균질성이 없었기 때문에) Dunnett의 검정을 적용하여 다중 비교를 조정했습니다. Pearson의 검사는 출혈 시간, 혈액 손실 및 복용량 간의 상관 관계를 테스트하는 데 사용되었습니다. ED50 값을 결정하기 위해, 네 개의 파라미터 역로그(dose) 반응 방정식을 출혈 및 혈액 손실 데이터에 적합시켰다. 성별 효과를 분석하기 위해 양방향 ANOVA 테스트를 사용하여 Bonferroni 보정을 적용하여 다중 비교를 조정했습니다. 유의 수준은 P < 0.05로 정의되었다. 데이터는 SEM± 수단으로 표시됩니다.

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결과

최적화된 모델의 적용가능성을 평가하기 위해, 시판되는 재조합 인자 VIII 대체 요법 (rFVIII)을 투여한 F8-KO (C57BL 유전적 배경) 마우스에서 연구를 수행하였다; 네 가지 다른 복용량이 테스트되었습니다 : 1 IU / kg, 5 IU / kg, 10 IU / kg 및 20 IU / kg. 또한, C57BL 마우스를 양성 대조군으로 사용하여 F8-KO 마우스 및 야생형(WT) 그룹에서 상응하는 비히클(음성) 대조군을 시험하여 모델에서의 반응 범위를 평가하?...

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토론

꼬리 정맥 횡단 (TVT)의이 최적화 된 방법은 TVT 생존 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 동물은 전체 연구 기간 동안 완전히 마취되어 마우스 취급이 쉬워지고 동물 복지가 향상됩니다. 또한, TVT 생존 모델과 달리 야간 관찰이 필요하지 않으며,이 최적화 된 모델은 혈액 손실을 측정하고 40 분 동안 정확한 출혈 시간을 관찰 할 수있는 가능성을 제공합니다. 또한, 의식이있는 동물에서 출혈의 더 ?...

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공개

저자는이 연구가 수행 된 당시 Novo Nordisk A / S의 직원 및 / 또는 주주이거나 주주였습니다.

감사의 말

Esther Bloem과 Thomas Nygaard는 혈장에서 FVIII의 측정에 대한 지원을 인정 받았습니다. Bo Alsted는 템플릿 드로잉 및 가공 및 절단 블록으로 인정 받고 있습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
#11 Scalpel bladeSwann-Morton503
15 mL centrifuge tubesGreiner Bio-One, Austria188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosingBD Micro-Fine + U-100 insulin syringe320830
AdvateTakeda, JapanRecombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanolHartmann, Soft-Zellin999 979
CentrifugeOmnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawingsSupplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solutionLysebio, ABX Diagnostics906012
Gauze
Haematological analyserSysmexCT-2000iv
Heating lamp on standPhillipsIR250
Heating pad with thermostatCMAmodel 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependentHemoCue, DenmarkHemoCue calibrator, 707037Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction boxSigma Delta Dameca
IsofluraneBaxter26675-46-7
Magnifier with lightsEschenbach
Measuring template (Aluminum)Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawingsSupplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tipsFinnpipette
PhotometerMolecular Devices Corporation, CA, USASpectraMax 340 photometer
Prism SoftwareGraphPad, San Diego, CA, USAVersion 9.0.1
Saline 0.9% NaClFresenius Kabi, Sweden883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suctionVacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostatTYP 3/8 Julabo

참고문헌

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