完全麻酔血友病Aマウスにおける尾静脈切除出血モデル

要約

麻酔をかけたマウスにおける精製尾静脈切除(TVT)出血モデルは、血友病出血の評価のための敏感な in vivo 法である。この最適化されたTVT出血モデルは、失血と出血時間をエンドポイントとして使用し、他のモデルを改良し、死亡をエンドポイントとして回避します。

要約

尾出血モデルは、血友病研究、特に凝固促進効果の評価において重要なツールである。尾静脈切断(TVT)生存モデルは、臨床的に関連する用量のFVIIIに対する感受性のために多くの設定で好まれてきたが、テールクリップモデルなどの他の確立されたモデルは、より高いレベルの凝固促進化合物を必要とする。生存をエンドポイントとして使用しないようにするために、我々は失血と出血時間をエンドポイントとして確立し、実験全体を通して完全な麻酔を確立するTVTモデルを開発しました。簡単に説明すると、麻酔をかけたマウスは、尾部を温食塩水(37°C)に沈めて位置決めし、右側尾静脈に試験化合物を投与する。5分後、テンプレートガイドを使用して左側尾静脈をトランスセクトし、尾を生理食塩水に戻し、血液を採取しながらすべての出血エピソードを40分間監視および記録する。傷害後10分、20分、または30分で出血が起こらない場合、湿ったガーゼ綿棒で切り傷を2回拭くことによって血餅に優しく挑戦する。40分後、失血は生理食塩水に採血されたヘモグロビンの量によって定量化される。この迅速かつ比較的簡単な手順は、一貫性のある再現性のある出血をもたらす。TVT生存モデルと比較して、薬理学的介入に対する感受性を損なうことなく、より人道的な手順を使用する。さらに、3Rの原則に従って、繁殖する必要がある動物の総数を減らして、両方の性別を使用することが可能です。出血モデルにおける潜在的な制限は、止血の確率的性質であり、モデルの再現性を低下させる可能性がある。これに対抗するために、手動血餅破壊は、モニタリング中に血餅が挑戦されることを保証し、原発性(血小板)止血が出血を止めるのを防ぎます。出血傷害モデルのカタログへのこの追加は、標準化された人道的な方法で凝固促進効果を特徴付けるオプションを提供する。

概要

動物モデルは、血友病の病因を理解し、治療レジメンおよび治療法を開発および試験するために不可欠である。第VIII因子ノックアウトマウス(F8-KO)は、血友病A ^1,2の研究に広く使用されているモデルである。これらのマウスは、疾患の主要な特徴を再現し、組換えFVIII産物³、⁴、⁵および遺伝子治療戦略^6、7などの治療法の開発に広く使用されている。

インビボで異なる止血化合物の薬理学的効果を評価するための様々な出血傷害モデルがある。これらの凝固モデルの1つは、マウス⁸、⁹、^10、11、^12、13、¹⁴における尾静脈切除生存モデルであり^、尾部離反後に放血を生き延びる血友病マウスの能力を測定する。この方法は40年以上前に導入され15、現在も^9,16,17で使用されています。しかし、このモデルは生存をエンドポイントとして利用し、動物が意識的であり、したがって痛みや苦痛を経験することができる最大24時間にわたって動物の観察を必要とする。

テールクリップモデル(テールチップとしても知られている)8、18、¹⁹、20、^21、22、23、²⁴、^25、26、²⁷、²⁸など、より短い持続時間および完全麻酔下の出血モデルは、以前に説明されている.それにもかかわらず、出血チャレンジ後の失血の完全な正常化のためには、これらのモデルは、臨床的に投与されたものよりもはるかに高い用量の凝固促進化合物(例えば、FVIII)を必要とする²⁹。麻酔下での別の傷害モデルである大静脈サフェナ出血法は、低用量の凝固促進剤化合物³⁰に感受性であるが、血餅を頻繁に破壊しなければならないため(提示されたモデルでは3回とは対照的に)、高レベルの実験者の介入が必要である。

新しい凝固促進剤化合物を試験するための共通プロトコールに向けた標準化は、実験室間のデータ比較を大いに容易にするであろう³¹、^32、33。TVTモデルでは、研究されたエンドポイント(失血^7,26、出血時間^9,34、生存率^35,36)に関する共通の合意はまだなく、実験の長さは研究^{間で異なる13}。

私たちの主な目的は、高い再現性、オンデマンドおよび予防的治療の研究の可能性、生存モデルと同等の薬理学的介入に対する感受性、それでも死亡または臨死をエンドポイントとして使用しない最適化されたモデルを記述し、特徴付けることです。痛みや苦痛を軽減するために、動物は出血中に意識を持つべきではなく、より倫理的なエンドポイントを実装する必要があります³⁷。

テールクリップモデルは、一般に、尾の先端を切断するか、例えば、1〜5mmの切断、例えば、1〜5mmの切断、1〜5mmの切断、¹〜^3mmの^{切断、または}より重篤な変形では、尾の直径約1〜3mm^の8,22,25でトランセクトする²つの変形のいずれかで実施される。.これは、側静脈および背静脈および腹側動脈が通常切断されるため、複合動静脈出血を引き起こし、一般に、切断が大きいほど、凝固促進剤化合物に対する感受性を低下させる。さらに、尾先が切断されるので、動静脈損傷は、任意の反対の組織なしで露出する。したがって、少なくとも理論的には、最も一般的な血友病出血とは異なっている。

名前が示すように、この論文に記載されているような尾静脈切断モデルでは静脈のみが損傷し、したがって排他的に静脈出血をもたらす。血管は完全に切断されていないため、損傷は切断モデルよりも小さいと予想され、血餅が付着する可能性のある切断の周囲の組織は保持される。さらに、動脈とは対照的に静脈の血圧が低い。これらの因子は、切断モデルに対する感受性の増加に寄与し、その結果、臨床的に関連する用量の補充療法、例えば血友病AにおけるrFVIIIを用いて出血の正常化を達成することができ、これは凝固促進剤治療の効果の大きさおよび持続性を評価するのに有用である26,38,39。

プロトコル

この議定書に記載されているすべての手順は、Novo Nordisk A/Sの動物福祉機関、およびデンマーク食品農業水産省のデンマーク動物実験検査官によって承認されています。最適化された40分の方法には、麻酔と投与時間が設計に含まれています(図1)。この手順には、10〜16週齢の両性の血友病マウスが必要である。

1. 学習前の準備

1. 正しい濃度で投薬溶液を調製する。
2. ウォーターバスを開始し、37°Cに加熱する。 採血用の15 mL遠沈管に生理食塩水(0.9% NaCl)を充填します。
3. 実験開始の少なくとも15分前に、加温したベースプレートの穴に15mL生理食塩水チューブを置く。
4. マウスを特定し、その体重を記録します。マウスを必要以上に扱うことは、ストレスを引き起こし、研究に影響を与える可能性があるため、避けてください。
5. ナプキン、テールホルダー、ガーゼ、注射器、メス、ストップウォッチ、血流表記用紙など、すべてが手の届くところにあるように、ヒュームフードにワークステーションを準備してください。
6. テールマークと切断ブロックを加熱プレートに置きます - 冷たいブロックは静脈を収縮させ、それによって出血に影響を与えます。

2.麻酔

1. ヒュームフード内でイソフルラン麻酔処置を行う。
2. ガス気化器を、1 L/分の流量で麻酔チャンバ内の30%O₂/70%_N2O中の最初に5%イソフルランに設定する。麻酔チャンバが充填されるのに十分な時間(チャンバの容積とガス流量に応じて約5分)を待ちます。迅速な誘導(1分未満)を確保します。
3. マウスを意識を失うまで麻酔室に入れる。
   注:これは、チャンバーが十分に満たされている場合、1分以内に発生します。
4. ペダル反射(しっかりしたつま先のピンチ)に対する痛みを伴う反応がないことによって、適切な麻酔を確実にする。
5. マウスを加熱プレートの上に置き、鼻が鼻錐形にあることを確認します。
6. 麻酔を30%O2/70_%N2O中の₂%イソフルランの維持レベルまで下げ、マウスの上にプラスチックカバーを置いて熱の損失を減らす。麻酔下での乾燥を防ぐために、適切な眼軟膏を塗布する。
7. テールマークブロックを使用して、直径2.5mmのテールにマークを付けます。尾部をブロック内のスリットに無理に押し込まないでください - ぴったりとフィットする必要があります(補足図1)
8. 尾部を生理食塩水チューブに少なくとも5分間入れて、静脈内投与に最適な暖かい尾静脈を確保します。

3. 試験液の投与

1. マウス1匹をテールホルダーに入れ、鼻を麻酔マスクに入れます。
2. 動物に目的の化合物(この場合はrFVIII)を投与し、直ちにストップウォッチを開始します(t = 0)。
3. マウスを加熱プレートに戻し、尾を生理食塩水チューブに入れます。他のマウスでこの手順を繰り返します。

4. 尾静脈切除術の実施

1. 投薬後正確に5分で尾静脈切除を行う。切断ブロックに尾部を置き、90°回転させて静脈を露出させます(補足図2)。
2. 試験液を投与した場所とは反対側/静脈に切断を行います。
3. #11メスの刃を尾を保持する切断ブロックのスリットに通して出血を作り出します。ストップウォッチをリセットし、すぐに尾を生理食塩水に戻します。

5. 観測時間と課題

1. 出血を観察し、40分を通して出血の開始と停止に注釈を付けます。血流表記用紙に注釈を付けます。
   注:出血のこの視覚的評価は、主観性のためにわずかに異なる場合があります。
2. 一次出血は、切断が行われた後3分以内に停止しなければならない。そうでない場合は、マウスを失格にし、安楽死させ、交換する(一次出血を止められないと、vWF KOマウスのように、重篤すぎる傷害または原発性止血の欠如を示す可能性がある)。
3. 負傷後10分、20分、および30分で出血がない場合は、手順4〜5で説明したようにテールカットに挑戦してください。
4. 水浴に保管された別のチューブから暖かい生理食塩水に浸したガーゼ綿棒を使用してください。尾を生理食塩水から持ち上げ、濡れたガーゼで尾の切り傷の遠位方向に2回軽く拭きます。
5. 各チャレンジの後、すぐに尾を再び生理食塩水管に再沈めてください。
6. t=40分で、生理食塩水チューブから尾を抜いて採血を停止します。

6. 採血

1. t=40分後、眼窩上静脈から血液サンプルを得る。

7. 安楽死

1. 完全な麻酔下にある間に子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。

8. サンプルの処理

1. 15 mL採血管を生理食塩水で4000 x g で室温で5分間遠心分離する。
2. 15 mLチューブから上清を捨て、ペレットを2〜14 mLの赤血球(RBC)溶解溶液に再懸濁し、明るいコーヒー色に達するまで希釈する。
3. なお、全体積(血液の体積+チューブ上の目盛りマークを用いて添加した赤血球(RBC)溶解液の体積)。
4. 希釈液2mLをヘモグロビンチューブに移し、ヘモグロビン分析が終わるまで冷蔵する。
5. 生理食塩水中のヘモグロビン濃度を測定することによって失血を決定する。マイクロプレートリーダー(材料表)上で550nmにおける吸光度を測定する。
6. ヒトヘモグロビンから調製した標準曲線(材料表)を用いて吸光度をnmolヘモグロビンに変換し、RBC溶解溶液による希釈を補正する。

9. 統計分析

1. 適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。ここでは、GraphPad Prismソフトウェアが使用されました。一連の研究にわたって、以下の統計的方法が良好に機能することが判明した。
   注:失血を分析するために, 出血時間, 暴露, 血小板数, とヘマトクリット;Brown-Forsythe検定とウェルチ分散分析を使用して、(データは連続的であったが残差の分散均質性はなかったため)、多重比較のために調整するためにダネット検定を適用した。ピアソンの検定は、出血時間、失血、および用量の間の相関関係を試験するために使用された。_ED50 値を決定するために、4パラメータの逆対数(用量)応答式を出血および失血データに当てはめました。性別効果を分析するために、二元配置分散分析検定を使用し、ボンフェローニ補正を適用して多重比較を調整しました。有意水準はP<0.05と定義した。データはSEMの手段として表示±ます。

結果

最適化されたモデルの適用性を評価するために、市販の組換え第VIII因子補充療法(rFVIII)を投与したF8−KO(C57BL遺伝的背景)マウスにおいて研究を実施した。1IU/kg、5IU/kg、10IU/kg、および20IU/kgの4つの異なる用量が試験された。さらに、陽性対照群としてC57BLマウスを用いたF8-KOマウスおよび野生型(WT)群における対応するビヒクル(陰性)対照を試験し、モデルにおける応答範囲を評価した。

ディスカッション

尾静脈切断(TVT)のこの最適化された方法は、TVT生存法と比較していくつかの利点を有する。動物は研究期間全体にわたって完全に麻酔をかけられるため、マウスの取り扱いが容易になり、動物の健康が向上します。さらに、TVT生存モデルとは異なり、一晩の観察は必要なく、この最適化されたモデルは、失血を測定し、40分にわたって正確な出血時間を観察する可能性を提供する。また、意識...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo