Tam Anestezi Uygulanan Hemofili A Farelerinde Kuyruk Ven Transeksiyonu Kanama Modeli

Özet

Anestezi uygulanan farelerde rafine kuyruk veni transeksiyonu (TVT) kanama modeli, hemofilik kanamanın değerlendirilmesinde duyarlı bir in vivo yöntemdir. Bu optimize edilmiş TVT kanama modeli, kan kaybını ve kanama süresini bitiş noktaları olarak kullanır, diğer modelleri rafine eder ve son nokta olarak ölümden kaçınır.

Özet

Kuyruk kanaması modelleri, hemofili araştırmalarında, özellikle prokoagülan etkilerin değerlendirilmesinde önemli araçlardır. Kuyruk veni transeksiyonu (TVT) sağkalım modeli, klinik olarak ilgili FVIII dozlarına duyarlılık nedeniyle birçok ortamda tercih edilirken, kuyruk klipsi modeli gibi diğer yerleşik modeller daha yüksek seviyelerde prokoagülan bileşikler gerektirir. Sağkalımı son nokta olarak kullanmaktan kaçınmak için, tüm deney boyunca kan kaybını ve kanama süresini son nokta ve tam anestezi olarak belirleyen bir TVT modeli geliştirdik. Kısaca, anestezi uygulanan fareler, ılıman saline (37 ° C) batırılmış kuyruk ile yerleştirilir ve sağ lateral kuyruk damarındaki test bileşiği ile dozlanır. 5 dakika sonra, sol lateral kuyruk damarı bir şablon kılavuzu kullanılarak transekte edilir, kuyruk saline geri döndürülür ve kan toplanırken tüm kanama bölümleri izlenir ve 40 dakika boyunca kaydedilir. Yaralanma sonrası 10 dakika, 20 dakika veya 30 dakika kanama meydana gelmezse, kesiği ıslak bir gazlı bezle iki kez silerek pıhtıya hafifçe meydan okunur. 40 dakika sonra, kan kaybı, saline kanan hemoglobin miktarı ile ölçülür. Bu hızlı ve nispeten basit prosedür, tutarlı ve tekrarlanabilir kanamalarla sonuçlanır. TVT sağkalım modeline kıyasla, farmakolojik müdahaleye duyarlılıktan ödün vermeden daha insancıl bir prosedür kullanır. Ayrıca, her iki cinsiyeti de kullanmak, yetiştirilmesi gereken toplam hayvan sayısını azaltarak, 3R'lerin ilkelerine bağlı kalarak mümkündür. Kanama modellerinde potansiyel bir sınırlama, hemostazın stokastik doğasıdır ve bu da modelin tekrarlanabilirliğini azaltabilir. Buna karşı koymak için, manuel pıhtı bozulması, izleme sırasında pıhtıya meydan okunmasını sağlar ve primer (trombosit) hemostazın kanamayı durdurmasını önler. Kanama yaralanması modelleri kataloğuna yapılan bu ekleme, prokoagülan etkileri standartlaştırılmış ve insancıl bir şekilde karakterize etme seçeneği sunar.

Giriş

Hayvan modelleri, hemofilinin patogenezini anlamak ve tedavi rejimleri ve terapileri geliştirmek ve test etmek için gereklidir. Faktör VIII nakavt fare (F8-KO), hemofili A ^1,2 çalışması için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Bu fareler hastalığın temel özelliklerini özetler ve rekombinant FVIII ürünleri 3,4,5 ve gen terapisi stratejileri ^6,7 gibi tedavilerin ^{geliştirilmesinde} yaygın olarak kullanılmaktadır.

Farklı hemostatik ....

Protokol

Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler Novo Nordisk A/S'deki Hayvan Refahı Kurumu ve Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği, Danimarka Gıda, Tarım ve Balıkçılık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır. Optimize edilmiş 40 dakikalık yöntem, tasarımda anestezi ve dozlama süresini içerir (Şekil 1). Bu işlem için 10-16 haftalıkken her iki cinsiyetten hemofilik fareler gereklidir.

1. Çalışma öncesi hazırlıklar

1. Dozaj çözeltilerini doğru konsantrasyonlarda hazırlayın.
2. Su banyosunu başlatın ve 37 ° C'ye ısıtın. Kan alımı için 15 mL santrifüj tüplerini salin (% 0.9 NaCl) ile doldurun.
3. 15 mL t....

Sonuçlar

Optimize edilmiş modelin uygulanabilirliğini değerlendirmek için, ticari olarak temin edilebilen bir rekombinant faktör VIII replasman tedavisi (rFVIII) ile uygulanan F8-KO (C57BL genetik arka plan) farelerinde bir çalışma yapılmıştır; dört farklı doz test edildi: 1 IU / kg, 5 IU / kg, 10 IU / kg ve 20 IU / kg. Ayrıca, modeldeki yanıt aralığını değerlendirmek için pozitif kontrol grubu olarak C57BL fareleri kullanarak F8-KO farelerde ve vahşi tip (WT) grubunda karşılık gelen araç (negatif) kont.......

Tartışmalar

Bu optimize edilmiş kuyruk veni transeksiyonu (TVT) yöntemi, TVT sağkalım yöntemine kıyasla birçok avantaja sahiptir. Hayvanlar, tüm çalışma süresi boyunca tamamen anestezi altına alınır, bu da fare kullanımını kolaylaştırır ve hayvan refahını arttırır. Ayrıca, TVT hayatta kalma modelinin aksine, gece boyunca gözlem gerekli değildir ve bu optimize edilmiş model, kan kaybını ölçme ve 40 dakika boyunca tam kanama süresini gözlemleme imkanı sunar. Ayrıca, bilinçli hayvanlarda daha uzun .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo