通过肿瘤大解剖增强肿瘤含量

摘要

该协议提出了一种增加福尔马林固定石蜡包埋组织样品肿瘤含量百分比的方法。

摘要

福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中存在污染性非肿瘤组织会极大地破坏基因组研究。在这里，我们描述了宏观切割，这是一种旨在通过在进行下游核酸提取之前去除和消除不需要的组织来增加组织标本肿瘤含量百分比的方法。切片FFPE组织块以产生4-5μm的载玻片安装组织切片。提交了具有代表性的苏木精和曙红（H&E）染色部分，随后由董事会认证的病理学家进行审查。在审查期间，病理学家识别并标记了H&E中的肿瘤组织区域。完成后，使用标记的H&E来指导从同一组织块中切除连续未染色的切片。为了证明大解剖的效果，从匹配的大解剖和非解剖的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中提取的RNA在能够确定DLBCL亚型和BCL2易位状态的数字基因表达测定上运行。结果显示，在检查的样本中，宏观解剖改变了亚型或BCL2易位状态调用。总之，大解剖是在核酸提取之前进行肿瘤富集的简单有效的方法，其产物可以放心地用于下游基因组研究。

引言

福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，作为正常临床诊断过程的一部分收集并保留在临床组织库中，代表了人类研究的巨大资源，包括癌症研究¹。随着我们对人类疾病的理解的加深，越来越清楚的是，以前被认为是基于形态学和免疫表型特征的单一实体的疾病实际上由需要分子亚型测定的不同分子亚型组成。因此，能够识别这些亚型的高灵敏度基因组测定变得越来越重要².尽管FFPE组织因与固定相关的问题而与基因组技术的兼容性较差而闻名，但随着技术和方案的发展，这些技术与这种临床上无处不在的组织形式^{越来越兼容3，4，5}。然而，FFPE组织通常是肿瘤和非肿瘤组织材料的混合物，其中非肿瘤材料的存在通常是不需要的，并且如果以高比例存在，可以显着破坏和影响基因组分析的结果⁶。事实上，此类分析经常使用60%的最低肿瘤含量，其中可以排除低于该阈值的组织，尽管其他方面符合研究标准⁷。这在罕见疾病环境中尤其成问题，因为患者组织非常珍贵且难以大量收集。

大解剖是一种通过减少正常组织的数量来最小化低肿瘤含量影响的方法³。在提取核酸之前去除这种混杂的非肿瘤物质可以显着增加肿瘤百分比含量，从而增加提取的核酸的肿瘤纯度。组织切除术严重依赖于专家病理学检查，其中肿瘤区域由董事会认证的病理学家⁸鉴定并环绕在新鲜生成的苏木精和曙红（H&E）染色的组织切片上。然后使用圆形的H&E分别指导不需要的和目标组织的去除和收集。该协议描述了在梅奥诊所的艾滋病和癌症标本资源（ACSR）技术核心实验室进行的从病理学检查到组织收获的宏观解剖步骤。

研究方案

所有样本均按照批准的梅奥诊所IRB协议（PR16-000507和PR2207-02）收集和使用。

1. 样品制备

1. 打开组织浮水浴。将温度设置为39°C，让水达到温度。将木制收集棒浸泡在水浴中。
2. 识别并检索要切片的FFPE组织块。
3. 使用组织学级永久性标记物对显微镜载玻片进行预标记，该标记器可承受溶剂洗涤。
4. 使用切片机切开FFPE块。为每个块以每段4-5μm的厚度切割至少2个全面切片（图1A）。
5. 将新鲜切割的组织切片带转移到预热的组织浮液浴中以进行载玻片安装（图1B，C）。
   注意:温水有助于"熨烫"出各部分的皱纹（图1C）。
6. 按顺序处理每个部分，使用镊子将单个部分从功能区中分离出来（图1D）。
7. 在预先标记的显微镜载玻片上收集单个切片。
   1. 以切片下方一定角度浸没显微镜载玻片，定位载玻片，使组织切片的边缘接触载玻片（图1E）。
   2. 一旦与组织切片接触，将载玻片缓慢地从浮液槽中拉出，以使组织切片在从水中出来时拉直与载玻片齐平（图1F）。
8. 每张载玻片安装1个组织切片并重复，直到收集完所有切片。
9. 让载玻片安装的组织切片在室温（RT）下彻底干燥。

2. 病理回顾

1. 对每个块⁹的一个代表性组织切片进行H&E染色。
2. 提交新染色的H&E，由董事会认证的病理学家进行病理学检查。
   注意:在审查期间，病理学家确定并记录每个组织中的肿瘤含量百分比，并在每个H&E载玻片上圈出肿瘤区域（参见 图2 和 图3，第1行）。 表1 概述了在 图3第1行所示的样品A-E的H&Es病理学检查期间通过细胞性确定的肿瘤含量百分比。肿瘤含量<60%的切片需要宏观解剖⁷。核酸提取所需的切片数量取决于圆形肿瘤区域的大小。如果在协议的第1节中削减了不充分的部分，并且有可能进一步削减，则可能需要削减其他部分。

3. 脱咖啡因化

1. 在通风橱中，用未稀释的组织学等级的d-柠檬烯或d-柠檬烯基溶剂预填充两个玻璃染色培养皿，并用未稀释的200防分子级乙醇预填充1个玻璃染色皿。
   注意:避免d-柠檬烯与皮肤和眼睛接触，避免吸入蒸气或喷雾，并远离火源。保持乙醇远离热源，火花和明火，避免溢出和接触皮肤或眼睛，通风良好，避免吸入蒸气。
   注:将培养皿装满足以淹没架状载玻片（图4A）;需要 250 mL 来填充所示的 20 玻片染色培养皿。每40次载玻片后更换d-柠檬烯和乙醇洗涤。D-柠檬烯（C₁₀H₁₆）是二甲苯的替代物，同样有效且毒性较小的脱蜡剂，在组织学方法中变得越来越普遍，并且在提取后产生高质量的核酸^{10，11，12，13，14}。尽管可以使用更生物友好的替代方案¹⁵进行该方案，但它们对提取的核酸质量的影响（如果有的话）仍有待确定。
2. 将未染色的FFPE纸巾安装载玻片放入玻璃Coplin载玻片架中（图4A，插图）。
3. 将架状载玻片浸入d-柠檬烯洗涤1中2分钟;轻轻搅拌前20秒。
   注:为了尽量减少洗涤之间的残留物，从洗涤中取出载玻片架时，先让滑梯架暂时排空，然后轻轻地将机架底部轻拍在纸巾上以除去多余的洗涤物。
4. 将架子载玻片浸入未稀释的D-柠檬烯洗涤2中2分钟;轻轻搅拌前20秒。卸下，沥干并再次轻拍机架。
5. 将架载玻片浸入乙醇洗涤中2分钟;轻轻搅拌前20秒。取下支架并将其放在吸水组织上以排出。让载玻片风干至少10分钟，但不超过2小时。

3. 宏观解剖

1. 在工作台上，在科普林玻璃罐中预装50毫升3%甘油，加入不含DNA酶/RNase的水中
   注意:每40张载玻片后更换甘油洗涤液。
2. 预标记和预填充1.5 mL微量管，每个微管160μL组织消化缓冲液。
   注意:大解剖后进行的核酸提取使用DNA / RNA FFPE提取试剂盒（材料表）。因此，该方案中使用的组织消解缓冲液由10 μL蛋白酶K和150 μL PKD缓冲液组成。
3. 将H&E上的病理标记追踪到脱蜡组织载玻片的背面。
   注意:与非脱蜡组织（图3，第2行和 图4B）相比，脱蜡的组织是白色的并且非常明显（图3，第3行和 图4C）。正是这种对去链烷化组织特征的可见性和可辨别性提高，才允许进行宏观解剖。将H&E面朝下放在工作台上，并将脱蜡载玻片的正面放在匹配的病理学家审查的H&E的背面（图4D）。将脱蜡的组织与H&E组织对齐（图4E）。追踪病理学家的标记是宏观解剖过程中的关键步骤，应注意尽可能准确地再现这些标记。这对于小的和/或断开的组织（例如样品B，D和E）可能特别具有挑战性（图3， 图4E和 图4E 插图i）。为了帮助追踪，应使用墨色细或超细笔尖标记物（图4E，插图ii）来追踪病理学家绘制的标记。乙醇湿巾可能有助于消除错误并允许在需要时进行回溯。
4. 将现在标记的脱蜡化载玻片组织正面朝上转动，并用干净的剃须刀片的角划线标记物的线，以预先切割肿瘤区域的边缘。
5. 依次处理每张载玻片，将脱蜡的载玻片浸入3%甘油溶液中。在缓慢取出载玻片之前，确保组织完全浸没（图4F）。
   注意:甘油浸渍的目的是阻尼组织以帮助组织收集，但也减少静电荷的积聚，静电荷可能导致组织和必须放置收集组织的塑料微管之间的排斥。
6. 用纸巾轻轻擦拭载玻片的背面以除去多余的甘油溶液，然后将载玻片放在工作台上，面朝下擦拭。让纸巾短暂晾晒1-2分钟。
   注意:将过量的甘油带入提取过程会对核酸提取的产量和质量产生负面影响。收集时，组织应略微潮湿，但不会明显湿润。
7. 根据感兴趣的肿瘤区域在载玻片上的位置，使用剃须刀片的平边（a）直接收集肿瘤组织，使用剃须刀从载玻片上刮擦/收集感兴趣的组织，或（b）在收集感兴趣的肿瘤组织之前首先移除并丢弃非肿瘤组织（图3）。
   注:收集的组织倾向于在刀片底部聚集或卷起（图4G）
8. 使用木棍从刀片中取出收集的组织（图4H 和插图），并将其转移到适当的预标记和预填充的微管（图4I）。
   注意:消化缓冲液用于将组织从木制镐"拉"到液体中。
9. 继续进行核酸提取。
   注意:根据制造商的说明，使用DNA / RNA FFPE提取试剂盒完成核酸提取，并使用紫外可见分光光度计对产生的核酸进行定量。所得RNA在基于数字基因表达谱分析的DLBCL90测定¹⁶上运行。

结果

共切片5个弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）FFPE组织块，所得切片在核酸提取前进行大解剖或不进行。提取的RNA在DLBCL90测定¹⁶上运行。大解剖样品运行两次，一次使用5μL的RNA储备浓度，但不超过300ng的总RNA输入，一次使用5μL稀释的RNA储备以匹配其各自未解剖对应物的RNA输入。表 2 概述了 DLBCL90 结果。

DLBCL由3种不同的起源细胞（COO）亚型组成，具有不同的治疗反应性，即GCB，ABC和称为未分类或UNC^17，18的中间组。在 DLBCL 中也经常观察到涉及 MYC、BCL2 和/或 BCL6 单独或联合（双重或三次命中）的易位，特别是在 GCB 亚型¹⁹ 中。DLBCL90 测定是其前身淋巴2Cx 临床测定的扩展，因此能够进行 DLBCL COO 亚型测定，但主要开发用于使用数字基因表达作为荧光原位杂交 （FISH） 替代方案来鉴定含有涉及 BCL2 的双重命中 （DH） 易位的样品 ^16，20。 表2 中的结果表明，宏观切割改变了COO或DHITsig状态，需要60%（3/5）的样本。

样本A的大解剖对COO调用没有影响，但将DHITsig调用从NEG更改为UNCLASS，并且无论大解剖样本RNA输入如何并且具有相似的概率评分（0.224，0.254），都观察到这种变化。相比之下，样本 C 的宏观剖析对 DHITsig 调用没有影响，但将 COO 调用从 GCB 更改为 UNC。同样，无论宏观解剖的样品RNA输入如何，都观察到这种变化。然而，在0.117时，对于RNA输入减少的大解剖样品，COO呼叫概率更接近0.1的呼叫阈值。与样本 A 类似，样本 E 的宏解剖对 COO 调用没有影响，但更改了 DHITsig 调用。然而，对于样本E，调用从UNCLASS更改为NEG，并且无论具有合理相似概率调用（0.849，0.833）的大解剖样本RNA输入如何，都这样做了。值得注意的是，这种对 DHITsig NEG 的调用更改具有生物学意义，因为样本 E 被发现为 ABC-DLBCL，并且据报道，在 GCB-DLBCL¹⁹ 中仅观察到涉及 BCL2 的双重命中易位。

图1:使用切片机生成幻灯片安装的组织切片 （A）FFPE组织块由切片机卡盘固定到位并切割以产生连续FFPE组织切片的带状物。（B）使用预先浸泡的木棍，从切片机中收集丝带并将其转移到温水浴中。（C）水的温暖有助于消除组织带中的折痕。（D）通过将闭合的镊子放在两个部分的交界处并轻轻打开镊子，将单个FFPE组织切片从组织带中取出，镊子将切片彼此分开。（E）通过以一定角度浸没载玻片并从水中收集切片，然后轻轻地将侧面向组织切片移动，直到切片的边缘接触到载玻片。（F）一旦载玻片和切片接触，慢慢地将载玻片从水中取出，使组织切片与载玻片齐平。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:苏木精和曙红 （H&E） 染色切片的病理学和组织学综述 （A，B） H&E 组织切片由董事会认证的病理学家进行显微镜检查。（三、四）一旦病理学家查看了整个组织并发现它不是100%的肿瘤组织，病理学家将使用标记物来包围组织的肿瘤区域。（英，女）将标记的H&E与原始FFPE组织块保持在一起表明并非所有组织都是肿瘤物质。 请点击此处查看此图的大图。

图3:组织样本。 该图像显示了病理学检查和肿瘤标记的H&Es（第1行），未处理的载玻片安装FFPE组织切片（第2行），去蜡化的载玻片安装的FFPE组织切片（第3行），去链烷化的载玻片安装的FFPE组织切片，并在载玻片背面追踪病理标记（第4行），用于演示该协议的5个样品（A-E）的去链烷化和宏观解剖的载玻片安装FFPE组织切片（第5行）。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:FFPE 组织切片的脱蜡和宏观解剖: （A） 在通风橱中，安装在载玻片架中的 FFPE 组织在两次 d-柠檬烯洗涤和一次乙醇洗涤中洗涤。（乙、丙）洗涤后，所有的石蜡都被去除了，只有组织留在载玻片上，与预洗的对应物相比，切片现在是白色的，并且非常明显。（D）将脱蜡的载玻片安装的组织切片面朝下放置在其匹配的标记H&E的背面（E）然后使用精细或超细的笔尖永久标记物在脱脂载玻片的背面追踪H&E上的肿瘤区域标记（F）然后将标记的脱脂化载玻片安装的组织切片浸入甘油洗涤液中以抑制组织切片以进行收集。将载玻片从甘油中缓慢取出，并用纸巾擦拭载玻片的背面以除去多余的甘油，然后将载玻片纸面朝上放在工作台上。（G）使用干净的剃须刀片的平坦面，对组织进行宏观解剖，并在收集感兴趣的组织之前丢弃病理学家标记之外的不需要的组织，其沿着刀片的边缘聚集。（H）使用木棍从刀片边缘取出收集的组织。（I）然后将组织转移到预先标记的微管预填充组织消化缓冲液中，并准备进行核酸提取。 请点击此处查看此图的大图。

样品编号	整个组织 （a）		组织圆周面积 （b）		整个组织的总肿瘤含量（c）	通过大解剖增加肿瘤含量（d）	未宏观解剖 （e）		宏观解剖 （f）
	活肿瘤百分比	% 其他	活肿瘤百分比	% 其他			提取的 5 μm 载玻片数量	核糖核酸浓度（纳克/微升）	提取的 5 μm 载玻片数量	核糖核酸浓度 （纳克/微升）
示例 A	60	40	75	25	45	1.7	2	19.0	4	58.3
样品 B	60	40	65	35	39	1.7	1	34.0	2	60.0
示例 C	40	60	65	35	26	2.5	1	13.7	2	46.2
样品 D	35	65	90	10	32	2.9	1	57.3	2	60.0
样品 E	20	80	30	70	6	5.0	3	25.2	3	44.6

表1:病理学检查数据。 该表显示（a）按区域划分的整个组织切片中活肿瘤的百分比，（b）病理学家在细胞性审查期间圈出/标记的区域内活肿瘤的百分比，（c）整个组织的估计整体肿瘤细胞性（a x b），（d）通过大解剖实现的肿瘤细胞性的估计倍数增加， （e和f）提取的5μm未染色FFPE载玻片组织切片的数量以及匹配的非大解剖和大解剖样品的所得RNA浓度。%Other是指存在于给定样品中的所有其他组织，这些组织不是肿瘤组织，可以包括结缔组织，基质成纤维细胞，血管以及其他固有的基质元素。 请按此下载此表格。

样品编号		核糖核酸输入（纳克）	德宝90首席运营官电话	呼叫概率	德希奇电话	DHITS 位置概率	二次歧义否定概率
未宏解剖	示例 A	95.0	断续器	0.000	尼格	0.135	0.865
	样品 B	170.0	断续器	0.000	尼格	0.032	0.968
	示例 C	68.5	断续器	0.028	尼格	0.033	0.967
	样品 D	286.5	美国广播公司	0.998	尼格	0.002	0.998
	样品 E	126.0	美国广播公司	0.989	非阶级	0.212	0.788
宏观解剖	示例A_M	291.7	断续器	0.000	非阶级	0.224	0.776
	示例B_M	300.0	断续器	0.000	尼格	0.016	0.984
	示例C_M	231.2	非阶级	0.210	尼格	0.015	0.985
	示例D_M	300.0	美国广播公司	0.999	尼格	0.002	0.998
	示例E_M	223.2	美国广播公司	0.987	尼格	0.151	0.849
大解剖 / RNA 稀释	示例A_M	95.0	断续器	0.000	非阶级	0.254	0.746
	示例B_M	170.0	断续器	0.000	尼格	0.023	0.977
	示例C_M	68.5	非阶级	0.117	尼格	0.027	0.973
	示例D_M	286.5	美国广播公司	0.999	尼格	0.002	0.998
	示例E_M	126.0	美国广播公司	0.995	尼格	0.167	0.833

表2:DLBCL90数字基因表达测定结果。 在进行核酸提取之前，五个样品（A-E）要么没有进行大解剖，要么大解剖。所得RNA在DLBCL90测定中运行，其最大RNA输入体积为5μL。使用（a）5μL储备RNA运行每个大切割样品两次，除非可以等分试样为60 ng / μL，以及（b）稀释5μL储备RNA以匹配其非大解剖对应物的浓度/输入。后缀_M表示该样本已进行宏观解剖。 请按此下载此表格。

讨论

FFPE组织通常是肿瘤和非肿瘤组织的异质性外加物。高灵敏度基因组测试在临床和研究环境中变得越来越普遍，但可能会因存在污染性非肿瘤组织而混淆。事实上，基因组研究经常推荐60%的最低肿瘤含量。肿瘤百分比可以通过肿瘤物质占据的组织面积或组织内肿瘤细胞的比例来确定。虽然按面积划分的肿瘤是衡量肿瘤纯度的常用指标，但它并不总是描绘组织的准确描述。考虑两个组织，都有1000个细胞，其中500个是肿瘤细胞。在组织A中，500个非肿瘤细胞是基质细胞，其体积与肿瘤细胞的体积相似。在该组织中，肿瘤的百分比可以通过细胞性和面积被认为是50%。在组织B中，500个非肿瘤细胞是脂肪细胞，其体积是肿瘤细胞的4倍。在该组织中，肿瘤的百分比仍然是细胞量的50%，但面积的百分比为20%。第三个组织，组织C，由500个肿瘤细胞加上400个脂肪细胞和800个基质细胞组成，其体积分别为肿瘤细胞的4倍和0.5倍。给定100个脂肪细胞等于800个基质细胞的体积，组织C的肿瘤百分比是细胞数的29%（500/1700），但仍然是20%的面积。组织D也由肿瘤，脂肪和基质细胞组成，体积比为1x，4x和0.1x。但是，像元数分别为 400、10 和 720。因此，组织D的肿瘤百分比是细胞量的35%（400/1130），但面积是78%。这些例子过于简单化，不能反映现实世界的组织组成，但清楚地传达了组织组成的重要性以及肿瘤含量与面积和细胞性之间的差异。重要的是，当涉及到富集肿瘤含量以进行下游核酸提取时，肿瘤细胞性是更重要的属性，因为从比肿瘤细胞更多的非肿瘤细胞中提取基因组物质的混杂潜力更高。这不仅强调了根据细胞百分比评估组织肿瘤含量的必要性，而且还强调了切除不需要的组织以最小化非肿瘤组织的任何潜在负面影响的必要性。有几种方法可用于组织富集，主要有宏观解剖和显微解剖。

宏观解剖是该协议中描述的方法，相对快速，简单，并且不需要昂贵或专用的设备。虽然大解剖可以大大提高肿瘤含量，但重要的是要了解它不能完全消除非肿瘤物质。宏观解剖的目的是通过排除不需要的组织来充分丰富感兴趣的组织，以减少来自不需要组织的"噪声"，这反过来又可以增强来自目标组织的目标信号。因此，大解剖介导的肿瘤富集是一种增强信噪比的方法，以便更好地检测感兴趣的标志物，特别是具有低丰度或表达不良的肿瘤特异性分子标志物。然而，由于剃须刀片等粗糙工具缺乏精度，宏观解剖具有局限性，并且容易受到病理学家标记物线厚度引起的精度问题的影响，以及在追踪病理学家H&E分界线时的潜在错误。如上所述，由于肿瘤本身存在固有的和诱导肿瘤的基质元素（即结缔组织，基质成纤维细胞，血管，良性反应性淋巴细胞，巨噬细胞）的存在，因此不可能达到100%的肿瘤纯度。事实上，许多侵袭性或弥漫性浸润性恶性肿瘤诱导强大的促结缔组织增生基质反应，导致肿瘤细胞簇与基质成纤维细胞和其他非肿瘤细胞类型紧密混合;其中与这种基质反应模式相关的肿瘤，例如胰腺癌组织²¹，可能更多地受益于数字引导的显微解剖，而不是手动大解剖。

手动显微切割在显微镜下进行，以帮助使用针头或手术刀识别，解剖和分离组织特异性细胞或群体，并且具有比宏观切割²²更高的精度的优点。然而，手动显微切割是一个费力的过程，缺乏肿瘤内容物低或与手动解剖不相容的复杂特征所需的精细度。这些组织可以使用高精度的自动化方法进行解剖，例如激光捕获显微切割。事实上，与胰腺癌组织中的手动大解剖相比，数字引导的显微解剖已被证明会产生更高百分比的肿瘤内容物²³。然而，这些高精度自动化方法的缺点，例如需要专门的，昂贵的设备和训练有素的人员，阻碍了其纳入工作流程。de Bruin等人比较大解剖和激光捕获显微切割（LCM）对基因表达谱的影响的研究发现，LCM样品的总RNA产量较低（平均30 ng），并且需要两轮mRNA扩增才能满足cDNA文库制备输入阈值²⁴。作者发现，所得的LCM基因表达谱受mRNA扩增次数的影响大于大解剖谱受非肿瘤基质贡献的影响，并得出结论，大解剖可以充分用于产生可靠的基因表达数据²⁴。

NanoString数字基因表达谱分析的一个显着优点，特别是在处理高度降解的FFPE衍生RNA时，是它不需要酶依赖性过程，例如RNA扩增或cDNA文库的制备。然而，测定通常针对总RNA^25，26的50-300 ng之间的输入进行优化，根据de Bruin等人的^{发现，如果不}增加组织输入，则可能与显微解剖组织不兼容;在组织样本越来越多地作为小型活检而不是手术切除收集的时代，这是一个不利的需求。用于DLBCL90测定的RNA输入范围为68.5-300 ng，适用于大解剖和非解剖组织。结果表明，大解剖导致60%的检查样品的呼叫变化，并且无论大解剖样品的RNA输入如何，都观察到这些变化。但是，低 RNA 输入的 COO 概率确实侵犯了 COO GCB/UNC 概率调用阈值，其中 GCB 的阈值为 0 到 <0.1，UNC 的阈值为 0.1-0.9，ABC 调用的阈值为 >0.9 到^1.0。主要的DLBCL COO亚型是GCB和ABC，分别占所有DLBCL病例的41%和44%，UNC代表了两者中的中间组，ABC是最积极的^20，27。因此，虽然首席运营官在样本C宏观剖析时的呼叫变化并没有导致COO亚型从GCB到ABC的明显变化，但从GCB到UNC的变化可能表明向更具侵袭性的疾病的转变。此外，最近的研究表明，UNC亚型不仅仅是一个中间亚型，它可能潜在地具有亚型特异性治疗可利用的属性²⁸。同样，对样本A和E的宏观解剖不会导致DHITsig呼叫从DH阴性到DH阳性的明显变化，反之亦然。然而，在宏观解剖后，全球氯苯样品（样品A）从国家核向UNCLASS的移动和ABC样品（样品E）从联合国国际原子能机构到国家毒品和免疫基金的移动在生物学上是适当的，因为据报道，涉及BCL2的双重命中易位完全是全球氯代苯现象¹⁹。尽管FISH在临床环境中传统上普遍检测到易位，但人们越来越倾向于确定一种替代的较少参与和耗时的检测方法。DLBCL90测定是满足这一需求的重要工具，其中其使用的基本原理因发现该测定能够检测临床诊断中使用的FISH探针的隐晦易位²⁹而得到加强。

上述宏观解剖方案概述了一种简单的方法，使研究人员能够增加组织样本的肿瘤含量，这些成分通常低于常用的研究纳入标准阈值。在研究工作流程中包括宏观解剖使研究人员能够通过增加肿瘤含量来挽救肿瘤致密性较差的组织免受研究排除。反过来，这可以提高所得RNA和DNA洗脱代表基因组研究下的肿瘤的信心。虽然确实存在其他更精确的组织解剖方法，但对于以更扩张，非浸润，片状或固体方式生长的肿瘤，宏观解剖可能就足够了。这里介绍的结果强调了肿瘤纯度在基因组测定和宏观切割中作为实现这一目标的可靠工具的重要性。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
200-proof ethanol	Decon	2701
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit	Qiagen	80234	DNA/RNA FFPE extraction kit
Coplin pots	Various	x
DLBCL90 probes	NanoString	various	Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay
d-Limonene	VWR	89376-092
Forceps	Various	x
Glass micrscope slides	FisherBrand	12-550-15
Glycerol	VWR	0854-1L
Master kits	NanoString	various
Microtome	Leica	RM2265
Microtubes	Ambion	AM12400
NanoDrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W	Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation
nCounter	NanoString	x	Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay
Permanent marker	Electrib Microscope Sciences	72109-12
Razor blade dispenser	Electrib Microscope Sciences	71985-10
Razor blades	Electrib Microscope Sciences	71985-23
Tissue digestion buffer	Qiagen	80234
Ultrapure water	VWR	SH30538.02
Waterbath	Triangle Biomedical Sciences	TFB-120
Wooden stick	FisherBrand	22363158