שיפור תכולת הגידול באמצעות מקרו-דיסקציה של הגידול

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה להגדלת תכולת הגידול באחוזים של דגימות רקמה משובצות פרפין קבועות פורמלין.

Abstract

נוכחותן של רקמות לא סרטניות מזהמות ברקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) עלולה לערער מאוד את המחקרים הגנומיים. כאן אנו מתארים מקרודיסקציה, שיטה שנועדה להגדיל את תכולת הגידול באחוזים של דגימת רקמה על ידי הסרה וסילוק של רקמות לא רצויות לפני ביצוע מיצוי חומצות גרעין במורד הזרם. בלוקי רקמת FFPE נחתכו כדי לייצר מקטעי רקמה המותקנים על החלקה של 4-5 מיקרומטר. סעיף מייצג הוגש עבור צביעת המטוקסילין ואוסין (H&E) ולאחר מכן נבדק על ידי פתולוג מוסמך. במהלך הסקירה, הפתולוג זיהה וסימן את אזורי רקמת הגידול ב- H&E. לאחר השלמתו, נעשה שימוש ב-H&E המסומן כדי להנחות כריתה של החלקים הסדרתיים שאינם מוכתמים מאותו גוש רקמה. כדי להדגים את ההשפעות של מקרו-דיסקציה, רנ"א שחולץ מתוך לימפומות של תאי B גדולים (DLBCL) שעברו ניתוח מאקרו ולא נותחו, הופעלו על בדיקת ביטוי גנים דיגיטלית המסוגלת לקבוע את תת-הסוג DLBCL ואת מצב הטרנסלוקציה של BCL2. התוצאות הראו כי מקרו-דיסקציה שינתה את תת-הסוג או את קריאות מצב הטרנסלוקציה של BCL2 ב-60% מהדגימות שנבדקו. לסיכום, מקרודיסקציה היא שיטה פשוטה ויעילה לביצוע העשרת גידולים לפני מיצוי חומצות גרעין, שתוצר שלהן יכול לשמש בביטחון במחקרים גנומיים במורד הזרם.

Introduction

רקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE), שנאספו כחלק מתהליך האבחון הקליני הרגיל ונשמרו במאגרי רקמות קליניות, מייצגות משאב עצום למחקר אנושי, כולל חקר הסרטן¹. ככל שהבנתנו את המחלות האנושיות מעמיקה, מתברר יותר ויותר שמחלות, שנחשבו בעבר לישויות בודדות המבוססות על מאפיינים מורפולוגיים ואימונופנוטיפיים, מורכבות למעשה מתת-סוגים מולקולריים מובחנים הדורשים מבחני תת-טיפוס מולקולריים. כתוצאה מכך, מבחנים גנומיים בעלי רגישות גבוהה המסוגלים להבחין בתת-סוגים אלה הפכו לחשובים יותר ויותר². למרות שרקמות FFPE ידועות בכך שהן תואמות בצורה גרועה לטכניקות גנומיות עקב בעיות הקשורות לקיבוע, ככל שהטכנולוגיה והפרוטוקולים מתפתחים, טכניקות אלה הופכות תואמות יותר ויותר לפורמט רקמה זה הנמצא בכל מקום קליני ^3,4,5. עם זאת, רקמות FFPE הן לעתים קרובות תערובות של חומרים סרטניים ורקמות שאינם סרטניים, כאשר נוכחות של חומר שאינו סרטני היא לעתים קרובות לא רצויה ויכולה, אם קיים בשיעור גבוה, לערער באופן משמעותי ולהשפיע על תוצאות הניתוחים הגנומיים⁶. ואכן, תכולת גידול מינימלית של 60% משמשת לעתים קרובות לניתוחים כאלה, שבהם ניתן לשלול רקמות שאינן נופלות מסף זה, למרות שאחרת עמדו בקריטריונים למחקר⁷. זה יכול להיות בעייתי במיוחד במסגרות של מחלות נדירות, שבהן רקמות המטופלים יקרות וקשה לאסוף אותן במספרים גבוהים.

Macrodissection היא שיטה הממזערת את ההשפעות של תכולת גידול נמוכה על ידי הפחתת כמות הרקמה הרגילה³. הסרת חומר לא סרטני מבלבל כזה לפני מיצוי חומצות גרעין יכולה להגדיל באופן משמעותי את תכולת אחוז הגידול ובכך את טוהר הגידול של חומצות הגרעין המופקות. כריתת רקמות מסתמכת באופן קריטי על סקירה פתולוגית של מומחים, לפיה אזור הגידול מזוהה ומוקף על מקטע רקמה מוכתמת של המטוקסילין ואאוזין (H&E) שנוצר זה עתה על ידי פתולוג מוסמך⁸. לאחר מכן נעשה שימוש ב-H&E המעוגל כדי להנחות את ההסרה והאיסוף של רקמות לא רצויות ומטרה, בהתאמה. פרוטוקול זה מתאר את השלבים של מקרו-דיסקציה מסקירה פתולוגית דרך קצירת רקמות כפי שבוצע במעבדת הליבה הטכנית של משאב דגימת האיידס והסרטן (ACSR) במרפאת מאיו.

Protocol

כל הדגימות נאספו ונעשה בהן שימוש בהתאם לפרוטוקולי ה-IRB המאושרים של מאיו קליניק (PR16-000507 ו-PR2207-02).

1. הכנה לדוגמה

1. הפעילו את אמבט המים הצפים של הרקמות. הגדר את הטמפרטורה ל- 39 °C (75 °F) ואפשר למים להגיע לטמפרטורה. השרו מקלות איסוף מעץ באמבטיית המים.
2. זהה ואחזור את בלוקי רקמות ה-FFPE שיש לחתוך.
3. שקופיות מיקרוסקופיות לפני התווית באמצעות סמן קבוע בדרגה היסטולוגית שיכול לעמוד בשטיפות ממסים.
4. השתמש במיקרוטום כדי לחתוך את בלוקי ה- FFPE. חותכים לפחות 2 מקטעים בעלי פנים מלאות בעובי של 4-5 מיקרומטר לכל מקטע עבור כל בלוק (איור 1A).
5. העבירו את הסרט הטרי של חלקי הרקמות לאמבטיית הציפה של הרקמה שחוממה מראש לצורך הרכבת החלקה (איור 1B, C).
   הערה: המים החמים עוזרים "לגהץ" את הקמטים בחתכים (איור 1C).
6. טיפול רציף בכל מקטע, השתמש במלקחיים כדי לשבור מקטע בודד הרחק מהסרט (איור 1D).
7. אסוף את החלק הבודד על שקופית מיקרוסקופ מסומנת מראש.
   1. טבלו את החלקת המיקרוסקופ בזווית שמתחת למקטע, והניחו את המגלשה כך שקצה חתך הרקמה ייגע במגלשה (איור 1E).
   2. ברגע שבאים במגע עם החלקה של הרקמה, משכו את המגלשה מתארחית הציפה באיטיות כדי לאפשר לחלק הרקמה להתיישר כנגד המגלשה כשהיא יוצאת מהמים (איור 1F).
8. הר 1 קטע רקמה לכל שקופית וחזור על הפעולה עד שכל הקטעים נאספו.
9. אפשרו לחלקי הרקמה המותקנים על ההחלקה להתייבש ביסודיות בטמפרטורת החדר (RT).

2. סקירה פתולוגית

1. בצע צביעת H&E על מקטע רקמה מייצג אחד עבור כל בלוק⁹.
2. הגש את ה- H&Es המוכתמים הטריים לבדיקה פתולוגית על ידי פתולוג מוסמך על ידי מועצת המנהלים.
   הערה: במהלך הסקירה, הפתולוג קובע ורושם את תכולת הגידול באחוזים בכל רקמה ומקיף את אזור הגידול בכל שקופית H&E (ראו איור 2 ואיור 3, שורה 1). טבלה 1 מתארת את אחוז תכולת הגידול לפי תאים שנקבע במהלך הסקירה הפתולוגית של H&Es עבור דגימות A-E המוצגות באיור 3, שורה 1. חלקים עם <60% מתכולת הגידול דורשים ניתוח מאקרו⁷. מספר החלקים הדרושים למיצוי חומצות גרעין תלוי בגודל אזור הגידול המעוגל. אם לא נחתכו סעיפים מספיקים בסעיף 1 של הפרוטוקול ויתאפשרו קיצוצים נוספים, ייתכן שיהיה צורך לחתוך סעיפים נוספים.

3. דפראפיניזציה

1. במכסה אדים, מלאו מראש שני כלי ויטראז' מזכוכית עם היסטולוגיה לא מדוללת בדרגה d-Limonene או ממס מבוסס d-Limonene וצלחת ויטראז'ים מזכוכית אחת עם אתנול בדרגה מולקולרית לא מדוללת של 200 הוכחות.
   אזהרה: הימנעו ממגע d-Limonene עם העור והעיניים, הימנעו משאיפת אדים או ערפל והתרחקו ממקורות הצתה. הרחיקו אתנול מחום, ניצוצות ולהבות פקוחות, הימנעו משפיכה ומגע עם העור או העיניים, אווררו היטב והימנעו מנשימה של אדים.
   הערה: מלאו את הכלים מספיק כדי להטביע את השקופיות עם המדפים (איור 4A); 250 מ"ל נדרשים כדי למלא את הכלים המכתימים בני 20 השקופיות המוצגים. החליפו את שטיפות ה-d-Limonene והאתנול לאחר כל 40 שקופיות. D-Limonene (C₁₀H₁₆) הוא חומר חלופי, יעיל באופן דומה, ופחות רעיל לקסילן שהופך נפוץ יותר במתודולוגיות היסטולוגיות ומניב חומצת גרעין באיכות טובה לאחר מיצוי 10,11,12,13,14. למרות שפרוטוקול זה עשוי להתבצע באמצעות חלופות ידידותיות יותר לביו-ידידות¹⁵, ההשפעות שלהן, אם בכלל, על איכות חומצות הגרעין המופקות עדיין לא נקבעות.
2. מתלה את רקמת ה-FFPE הלא מוכתמת המותקנת מחליק לתוך מתלי ההחלקה של קופלין מזכוכית (איור 4A, inset).
3. להטביע את המגלשות המדפות בשטיפת d-Limonene 1 למשך 2 דקות; להתסיס בעדינות במשך 20 השניות הראשונות.
   הערה: כדי למזער את ההובלה בין שטיפות, בעת הסרת מתלה המגלשות מכביסה, אפשרו למתלה להתנקז לזמן קצר לפני שאתם מטפטפים בעדינות את החלק התחתון של המדף על נייר טישו כדי להסיר שטיפה עודפת.
4. להטביע את המגלשות המדפות בשטיפת D-Limonene לא מדוללת 2 למשך 2 דקות; להתסיס בעדינות במשך 20 השניות הראשונות. הסרה, ניקוז וקשקושים שוב את מתלה המדף.
5. להטביע את המגלשות המדפות בשטיפת האתנול למשך 2 דקות; להתסיס בעדינות במשך 20 השניות הראשונות. הסר את המדף והנח אותו על רקמה סופגת לניקוז. אפשרו למגלשות להתייבש באוויר במשך 10 דקות לפחות, אך לא יותר מ-2 שעות.

3. מקרו-דיסקציה

1. על הספסל, מלאו מראש צנצנת זכוכית קופלין ב-50 מ"ל של 3% גליצרול במים נטולי DNase/RNase
   הערה: החליפו את שטיפת הגליצרול לאחר כל 40 שקופיות.
2. קדם-תווית ומילוי מראש של 1.5 מ"ל מיקרו-צינוריות עם 160 μL של מאגר עיכול רקמות לכל מיקרו-צינורית.
   הערה: מיצוי חומצות גרעין שבוצעו לאחר מקרו-דיסקציה השתמשו בערכת מיצוי DNA/RNA FFPE (טבלת חומרים). לפיכך, מאגר עיכול הרקמה ששימש בפרוטוקול זה כלל 10 μL של פרוטאינאז K ו-150 μL של מאגר PKD.
3. עקבו אחר הסימונים הפתולוגיים על ה-H&E על גב שקופיות הרקמה המחורבנות.
   הערה: בהשוואה לרקמות שאינן מזוהות (איור 3, שורה 2 ואיור 4B), רקמות מופרדות הן לבנות ונראות מאוד לעין (איור 3, שורה 3 ואיור 4C). הנראות המוגברת ויכולת ההבחנה של תכונות רקמה דפראפינליות הן שמאפשרות מקרו-דיסקציה. הניחו את ה-H&E עם הפנים כלפי מטה על הספסל והניחו את החלקה הקדמית של המגלשה המחורבנת על גבו של הפתולוג התואם שסקר את H&E (איור 4D). יישרו את הרקמה הפגומה עם רקמת ה-H&E (איור 4E). התחקות אחר הסימונים של הפתולוג היא צעד קריטי בתהליך המאקרו-דיסקציה, ויש להקפיד על שחזור סימונים אלה בצורה מדויקת ככל האפשר. זה יכול להיות מאתגר במיוחד עבור רקמות קטנות או מנותקות, כגון דגימות B, D ו-E (איור 3, איור 4E ואיור 4E משובצים i). כדי לסייע במעקב, יש להשתמש בסמן עדין או כרסום דק במיוחד (איור 4E, inset ii) כדי להתחקות אחר הסימונים המצוירים על ידי הפתולוגים. מגבוני אתנול עשויים להיות שימושיים כדי להסיר שגיאות ולאפשר שחזור במידת הצורך.
4. סובבו את רקמת ההחלקה המסומנת כעת עם הפנים כלפי מעלה ועקבו אחר קו הסמן עם הפינה של סכין גילוח נקייה כדי לחתוך מראש את הקצוות של אזור הגידול.
5. טיפול רציף בכל שקופית, טבלו את השקופיות הפגומות בתמיסת הגליצרול 3%. ודאו שהרקמה שקועה לחלוטין לפני שאתם מסירים את השקופית באיטיות (איור 4F).
   הערה: מטרת טבילת הגליצרול היא להרטיב את הרקמה כדי לסייע באיסוף הרקמות, אך גם להפחית את הצטברות המטען הסטטי שעלול לגרום לדחייה בין הרקמה לבין המיקרו-צינורית הפלסטית שבה יש למקם את הרקמה שנאספה.
6. נגבו בעדינות את החלק האחורי של המגלשה עם רקמה כדי להסיר את תמיסת הגליצרול העודפת, והניחו את המגלשה על הספסל, תוך ניגוב הצד כלפי מטה. אפשרו לרקמות להתאוורר לזמן קצר במשך 1-2 דקות.
   הערה: נשיאת עודפי גליצרול בתהליך המיצוי עלולה להשפיע לרעה על התפוקה והאיכות של מיצוי חומצות גרעין. הרקמות צריכות להיות לחות מעט אך לא רטובות בעליל כאשר הן נאספות.
7. בהתאם למיקום אזור העניין של הגידול על המגלשה, השתמש בקצה השטוח של סכין הגילוח כדי (א) לאסוף ישירות את רקמת הגידול, תוך שימוש בתער כדי לגרד/לאסוף את הרקמה המעניינת את המגלשה, או (ב) להסיר ולהשליך תחילה רקמה שאינה סרטנית לפני איסוף רקמת הגידול המעניינת (איור 3).
   הערה: רקמה שנאספה נוטה לאסוף או להתגלגל בתחתית הלהב (איור 4G)
8. השתמשו במקל עץ כדי להסיר את הרקמה שנאספה מהלהב (איור 4H ו-inset) ולהעביר אותה למיקרו-צינורית המתאימה המסומנת מראש וממולאת מראש (איור 4I).
   הערה: חיץ העיכול משמש כדי "למשוך" את הרקמה מהעץ לבחור לתוך הנוזל.
9. המשך למיצוי חומצות גרעין.
   הערה: מיצויי חומצות גרעין הושלמו באמצעות ערכת מיצוי DNA/RNA FFPE בהתאם להוראות היצרן, וחומצות הגרעין שהתקבלו כומתו באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis. ה-RNA שנוצר הופעל על ה-DLBCL90 המבוסס על פרופיל גנים דיגיטליים המבוססים על פרופיל^{גנים בבדיקה 16}.

תוצאות

בסך הכל נחתכו 5 גושי רקמת FFPE של לימפומה גדולה של תאי B(DLBCL) מפוזרים, והמקטעים שהתקבלו נותחו או לא נותחו או לא לפני מיצוי חומצות גרעין. הרנ"א שחולץ הופעל על מבחן DLBCL90¹⁶. דגימות מקרו-מנותחות הופעלו פעמיים, פעם אחת באמצעות 5 μL של ריכוז מלאי RNA אך לא יותר מ-300 ננוגרם של קלט RNA כולל ופעם אחת באמצעות 5 μL של מלאי RNA מדולל כדי להתאים לכניסות ה-RNA של עמיתיהם שאינם מנותחים בהתאמה. תוצאות DLBCL90 מתוארות בטבלה 2.

DLBCL מורכב מ-3 תת-סוגים נפרדים של תאי מקור (COO) עם היענות טיפולית שונה, כלומר GCB, ABC וקבוצת ביניים המכונה לא מסווג או UNC^17,18. טרנסלוקציות המערבות MYC, BCL2 או BCL6 לבדן או בשילוב (מכה כפולה או משולשת) נצפות לעתים קרובות גם ב- DLBCL, במיוחד בתת-סוג^{GCB 19}. הבדיקה DLBCL90 היא הרחבה של קודמתה, הבדיקה הקלינית Lymph2Cx, ולכן היא מסוגלת לקבוע תת-סוג DLBCL COO, אך פותחה בעיקר כדי לזהות דגימות עם טרנסלוקציות של פגיעה כפולה (DH) הכוללות BCL2 תוך שימוש בביטוי גנים דיגיטלי כחלופה להכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH)^16,20. התוצאות בטבלה 2 מראות כי מקרו-דיסקציה שינתה את ה-COO או את הסטטוס DHITsig דורש 60% (3/5) מהדגימות שנבדקו.

מקרו-דיסקציה של מדגם A לא השפיעה על קריאת ה-COO, אך שינתה את קריאת ה-DHITsig מ-NEG ל-UNCLASS, ושינוי זה נצפה ללא קשר לקלט ה-RNA של הדגימה המאקרו-דיסקרטית ועם ציוני הסתברות דומים (0.224, 0.254). לעומת זאת, מקרו-דיסקציה של מדגם C לא השפיעה על קריאת ה-DHITsig, אך שינתה את קריאת ה-COO מ-GCB ל-UNC. שוב, שינוי זה נצפה ללא קשר לקלט RNA דגימתי מקרו-דיסקרטי. עם זאת, ב-0.117, הסתברות הקריאה של COO הייתה קרובה יותר לסף הקריאה של 0.1 עבור הדגימה המאקרו-מנותקת עם קלט RNA מופחת. בדומה לדגימה A, ניתוח מאקרו של מדגם E לא השפיע על קריאת ה-COO, אך שינה את קריאת ה-DHITsig. עם זאת, עבור מדגם E הקריאה השתנתה מ-UNCLASS ל-NEG ועשתה זאת ללא קשר לקלט ה-RNA לדוגמה שעבר ניתוח מאקרו עם קריאות הסתברות דומות באופן סביר (0.849, 0.833). יש לציין כי שינוי קריאה זה ל- DHITsig NEG הגיוני מבחינה ביולוגית בהתחשב בכך שדגימה E נמצאה ב- ABC-DLBCL, וטרנסלוקציות של פגיעה כפולה המערבות BCL2 דווחו כמצוות באופן בלעדי ב- GCB-DLBCL¹⁹.

איור 1: יצירת מקטעי רקמה המותקנים על שקופיות באמצעות מיקרוטום. (A) בלוק רקמת FFPE המוחזק במקומו על ידי צ'אק המיקרוטום וגזור כדי לייצר סרט של מקטעי רקמת FFPE רציפים. (ב) באמצעות מקלות עץ ספוגים מראש, הסרט נאסף מהמיקרוטום ומועבר לאמבטיית מים חמים. (C) חום המים מסייע לגהץ את הקמטים בסרט הרקמה. (ד) מקטעי רקמת FFPE בודדים מוסרים מסרט הרקמה על ידי הנחת מלקחיים סגורים בצומת של שני חלקים ופתיחת המלקחיים בעדינות, מה שמנתק מקטעים זה מזה. (E) מקטעים נאספים מהמים על ידי טבילת מגלשת זכוכית בזווית והזזה עדינה של הצד לכיוון קטע הרקמה עד שקצה הקטע נוגע במגלשת הזכוכית. (ו) ברגע שהשקופית והקטע נוגעים, הסר באיטיות את המגלשה מהמים, מה שמאפשר לחלק הרקמה ליפול על המגלשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: פתולוגיה וסקירה היסטולוגית של מקטעים מוכתמים בהמטוקסילין ובאאוזין (H&E). (A,B) מקטע רקמת H&E נתון לבדיקה מיקרוסקופית על ידי פתולוג מוסמך. (ג,ד) לאחר שהפתולוג ראה את כל הרקמה ומצא שהיא אינה 100% רקמת הגידול, הפתולוג ישתמש בסמן כדי להקיף את אזור הגידול של הרקמה. (ה,ו) החזקת H&E המסומן כנגד בלוק רקמת ה-FFPE המקורי מראה שלא כל הרקמה היא חומר גידולי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: דגימות רקמה. תמונה זו מדגימה את ה-H&Es המסומנים באופן פתולוגי והגידול (שורה 1), מקטעי רקמת FFPE לא מעובדים המותקנים על שקופיות (שורה 2), מקטעי רקמת FFPE המותקנים על שקופיות מופרדות באופן פתולוגי (שורה 3), מקטעי רקמת FFPE רכובים על שקופיות מופרדות באופן לא מעובד עם סימוני פתולוגיה שאותרו בחלק האחורי של השקופית (שורה 4), מקטעי רקמת FFPE המותקנים על שקופיות מפורקות ומאקרו-מובחנות (שורה 5) עבור 5 הדגימות (A-E) המשמשות להדגמת פרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: דפראפיניזציה וניתוח מאקרו של מקטעי רקמת FFPE: (A) במכסה אדים, רקמות FFPE המותקנות במדף שקופיות נשטפות בשתי שטיפות d-לימונן ושטיפת אתנול אחת. (ב,ג) לאחר הכביסה, כל הפרפין הוסר, ורק הרקמה נותרה על המגלשה, שכעת היא לבנה ונראית מאוד בהשוואה למקבילה שטופה מראש. (D) מקטע הרקמה המורכב על החלקה המנופחת ממוקם עם הפנים כלפי מטה על גב ה-H&E המסומן בהתאמה שלו. (E) לאחר מכן תוחמים את סימוני אזור הגידול על ה-H&E בחלק האחורי של המגלשה המנופחת באמצעות סמן קבוע עדין או דק במיוחד (F) מקטע הרקמה המסומן של החלקה המנופחת טבול לאחר מכן בשטיפת גליצרול כדי להרטיב את מקטע הרקמה לצורך איסוף. המגלשה מוסרת באיטיות מהגליצרול, וחלקה האחורי של המגלשה מנגב עם רקמה כדי להסיר עודפי גליצרול לפני הנחת רקמת ההחלקה עם הפנים כלפי מעלה על הספסל. (ז) באמצעות הצד השטוח של סכין גילוח נקי, הרקמה מנותחת במאקרודיסציה, והרקמה הלא רצויה מחוץ לסימוני הפתולוגים מושלכת לפני שהיא אוספת את רקמת העניין, המצטברת לאורך קצה הלהב. (H) מקל עץ משמש להסרת הרקמה שנאספה מקצה הלהב. (I) הרקמה מועברת לאחר מכן למאגר עיכול רקמות ממולא מראש במיקרו-צינורית, והיא מוכנה למיצוי חומצות גרעין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מזהה לדוגמה	רקמה שלמה (א)		שטח מעוגל של רקמה (b)		תכולת הגידול הכוללת של רקמה שלמה (c)	עלייה פיפל בתכולת הגידול על ידי מקרודיסקציה (d)	לא נותח מאקרו (ה)		מקרודיסקציה (f)
	% גידול בר קיימא	% אחר	% גידול בר קיימא	% אחר			# מתוך 5 μm שקופיות שחולצו	RNA conc (ng/μL)	# מתוך 5 μm שקופיות שחולצו	RNA conc (ng/μL)
דוגמה א'	60	40	75	25	45	1.7	2	19.0	4	58.3
דוגמה ב'	60	40	65	35	39	1.7	1	34.0	2	60.0
דוגמה ג'	40	60	65	35	26	2.5	1	13.7	2	46.2
דוגמה ד'	35	65	90	10	32	2.9	1	57.3	2	60.0
דוגמה ה'	20	80	30	70	6	5.0	3	25.2	3	44.6

טבלה 1: נתוני סקירת פתולוגיה. הטבלה מציגה (א) את אחוז הגידול בר-הקיימא בכל מקטע הרקמה לפי אזור, (ב) את אחוז הגידול בר-הקיימא באזור המקיף/מסומן על-ידי הפתולוג במהלך הסקירה על-ידי התאים, (ג) את התאיות הכוללת המשוערת של הגידול של כל הרקמה (א x ב), (ד) את העלייה הקיפולית המשוערת בתאי הגידול שהושגה באמצעות מקרו-דיסקציה, (e ו-f) מספר מקטעי הרקמה המורכבים על שקופיות FFPE של 5 מיקרומטרים לא מוכתמים שהופקו וריכוזי הרנ"א שהתקבלו כתוצאה מכך עבור דגימות תואמות שאינן מקרו-דיסקרטיות ומאקרו-מנותחות. % אחר מתייחס לכל הרקמות האחרות הקיימות בדגימה נתונה שאינה רקמת גידול ויכולה לכלול רקמת חיבור, פיברובלסטים סטרומליים, כלי דם וכן אלמנטים סטרומליים אחרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

מזהה לדוגמה		קלט RNA (ng)	DLBCL90 שיחת COO	DLBCL90 הסתברות שיחה	DHITsig שיחה	הסתברות DHITsig pos	הסתברות שלילית של DHITsig
לא ניתח מאקרו	דוגמה א'	95.0	GCB	0.000	נג	0.135	0.865
	דוגמה ב'	170.0	GCB	0.000	נג	0.032	0.968
	דוגמה ג'	68.5	GCB	0.028	נג	0.033	0.967
	דוגמה ד'	286.5	ABC	0.998	נג	0.002	0.998
	דוגמה ה'	126.0	ABC	0.989	UNCLASS	0.212	0.788
מקרודיסקציה	A_M לדוגמה	291.7	GCB	0.000	UNCLASS	0.224	0.776
	B_M לדוגמה	300.0	GCB	0.000	נג	0.016	0.984
	C_M לדוגמה	231.2	UNCLASS	0.210	נג	0.015	0.985
	D_M לדוגמה	300.0	ABC	0.999	נג	0.002	0.998
	E_M לדוגמה	223.2	ABC	0.987	נג	0.151	0.849
מקרודיסקציה ו-RNA מדולל	A_M לדוגמה	95.0	GCB	0.000	UNCLASS	0.254	0.746
	B_M לדוגמה	170.0	GCB	0.000	נג	0.023	0.977
	C_M לדוגמה	68.5	UNCLASS	0.117	נג	0.027	0.973
	D_M לדוגמה	286.5	ABC	0.999	נג	0.002	0.998
	E_M לדוגמה	126.0	ABC	0.995	נג	0.167	0.833

טבלה 2: תוצאות בדיקת ביטוי גנים דיגיטלי DLBCL90. חמש דגימות (A-E) לא נותחו מקרו-דיסקציה או נותחו לפני שבוצעו מיצויים של חומצות גרעין. הרנ"א שנוצר הופעל על מבחן DLBCL90, שעבורו נפח הקלט המרבי של ה-RNA הוא 5 μL. דגימות שלא נותחו הופעלו באמצעות 5 μL של RNA מלאי. כל דגימה שעברה ניתוח מאקרו הופעלה פעמיים באמצעות (א) 5 μL של RNA מלאי, אלא אם כן ניתן היה לבצע תצפיות של 60 ננוגרם/μL ו-(ב) 5 μL של RNA מלאי מדולל כדי להתאים לריכוזים/קלט של עמיתיהם שאינם מאוקרו-דיסקרטיים. הסיומת _M מציינת כי מדגם זה נותח מאקרו. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

רקמות FFPE הן לעתים קרובות תערובות הטרוגניות של רקמות גידול ולא סרטניות. בדיקות גנומיות ברגישות גבוהה הופכות שכיחות יותר ויותר הן במסגרות קליניות והן במסגרות מחקריות, אך ניתן לבלבל אותן על ידי נוכחות של רקמה מזהמת שאינה סרטנית. ואכן, תכולת גידול מינימלית של 60% מומלצת לעתים קרובות למחקרים גנומיים. אחוז הגידול יכול להיקבע על ידי אזור הרקמה שנכבש על ידי חומר הגידול או על ידי שיעור תאי הגידול בתוך הרקמה. למרות שגידול לפי אזור הוא מדד נפוץ לטוהר הגידול, הוא לא תמיד מתאר תיאור מדויק של הרקמה. שקול שתי רקמות, שתיהן עם 1000 תאים, מתוכם 500 הם תאי גידול. ברקמה A, 500 התאים שאינם סרטניים הם תאים סטרומליים עם נפחים דומים לאלה של תא הגידול. ברקמה זו, אחוז הגידול יכול להיחשב 50% הן על ידי התאים והן על ידי האזור. ברקמה B, 500 התאים שאינם סרטניים הם תאי שומן עם נפחים שהם פי 4 מזה של תא הגידול. ברקמה זו, אחוז הגידול הוא עדיין 50% לפי תאים אבל 20% לפי אזור. רקמה שלישית, רקמה C, מורכבת מ-500 תאי גידול ועוד 400 תאי שומן ו-800 תאים סטרומליים עם נפחים שהם פי 4 ופי 0.5 מתאי הגידול, בהתאמה. בהינתן ש-100 תאי שומן שווים לנפח של 800 תאים סטרומליים, אחוז הגידול של רקמה C הוא 29% לפי תאים (500/1700) אך עדיין 20% לפי אזור. רקמה D מורכבת גם מהתאים הגידוליים, השומן והסטרומליים עם יחסי נפח של 1x, 4x ו-0.1x. עם זאת, מספר התאים הוא 400, 10 ו- 720, בהתאמה. לפיכך, אחוז הגידול ברקמה D הוא 35% לפי תאים (400/1130) אך 78% לפי אזור. דוגמאות אלה הן פשטניות מדי ואינן משקפות הרכבי רקמות בעולם האמיתי, אלא מעבירות בבירור את החשיבות של הרכב הרקמות ואת ההבדל בין תכולת הגידול לפי אזור ולפי תאים. חשוב לציין, כשמדובר בהעשרת תכולת הגידול למיצוי חומצות גרעין במורד הזרם, תאיות הגידול היא התכונה החשובה יותר בשל הפוטנציאל המבלבל המוגבר של חילוץ חומר גנומי מיותר תאים שאינם סרטניים מאשר תאים סרטניים. זה לא רק מדגיש את הצורך להעריך את תכולת הגידול של רקמות במונחים של תאי אחוזים, אלא גם את הצורך לבלות רקמה לא רצויה על מנת למזער את כל ההשפעות השליליות הפוטנציאליות של הרקמה שאינה סרטנית. ישנן מספר שיטות זמינות להעשרת רקמות, כאשר העיקריות שבהן הן מקרודיסקציה ומיקרו-דיסקציה.

Macrodissection, השיטה המתוארת בפרוטוקול זה, היא מהירה יחסית, פשוטה ואינה דורשת ציוד יקר או מיוחד. למרות macrodissection יכול מאוד לשפר את התוכן הגידול, חשוב להבין כי זה לא לגמרי לחסל חומר שאינו גידול. מטרת המקרודיסקציה היא להעשיר את הרקמה המעניינת מספיק באמצעות הרחקה של רקמות לא רצויות על מנת להפחית את "הרעש" הנובע מרקמה לא רצויה, אשר בתורו יכול לשפר את האות של עניין מן הרקמה של עניין. לפיכך, העשרת גידול מתווכת מקרו-דיסקציה היא דרך לשפר את יחס האות לרעש על מנת לזהות טוב יותר סמנים בעלי עניין, במיוחד סמנים מולקולריים ספציפיים לגידול עם שפע נמוך או ביטוי לקוי. עם זאת, למאקרודיסקציה יש מגבלות בשל חוסר הדיוק המוצע על ידי כלים גסים כגון סכיני גילוח והיא רגישה לבעיות דיוק הנובעות מעובי הקו של סמן הפתולוג, כמו גם טעויות פוטנציאליות בעת התחקות אחר תיחום H&E של הפתולוגים. כפי שנרמז לעיל, לא ניתן להשיג 100% טוהר הגידול בשל נוכחותם של אלמנטים סטרומליים טבועים וגורמי גידול (כלומר, רקמת חיבור, פיברובלסטים סטרומליים, כלי דם, לימפוציטים תגובתיים שפירים, מקרופאגים) המוטמעים בתוך הגידול עצמו. ואכן, ממאירויות פולשניות רבות או מסתננות באופן מפוזר גורמות לתגובה סטרומלית דסמופלסטית חזקה, וכתוצאה מכך אשכולות של תאי גידול מעורבבים באופן אינטימי עם פיברובלסטים סטרומליים וסוגי תאים אחרים שאינם ניאופלסטיים; כאשר גידולים הקשורים לדפוס תגובה סטרומלי זה, כגון רקמות סרטן^{הלבלב 21}, עשויים להפיק תועלת רבה יותר ממיקרו-דיסקציה מונחית דיגיטלית מאשר ממיקרו-דיסקציה ידנית מאשר ממיקרו-דיסקציה ידנית.

מיקרו-דיסקציה ידנית מבוצעת תחת מיקרוסקופ כדי לסייע בזיהוי, כריתה ובידוד של תאים או אוכלוסיות ספציפיות של רקמות באמצעות מחט או אזמל ויש לה יתרון של דיוק מוגבר על פני^{מקרו-דיסקציה 22}. עם זאת, מיקרו-דיסקציה ידנית היא תהליך מייגע שחסר את העדינות הדרושה לרקמות מורכבות עם תכולת גידול נמוכה או תכונות מורכבות שאינן תואמות את הנתיחה הידנית. ניתן לנתח רקמות כאלה באמצעות שיטות אוטומטיות ברמת דיוק גבוהה כמו מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר. ואכן, הודגם כי מיקרו-דיסקציה מונחית דיגיטלית מניבה תכולת גידול באחוזים גבוהים יותר בהשוואה למקרו-דיסקציה ידנית ברקמות סרטן הלבלב²³. עם זאת, החסרונות של שיטות אוטומטיות מדויקות אלה, כגון הצורך בציוד מיוחד ויקר ואנשים מיומנים מאוד, הפריעו לשילובו בתהליכי עבודה. מחקר של de Bruin et al. שהשווה את ההשפעות של מקרודיסקציה ומיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LCM) על פרופיל ביטוי גנים מצא כי לדגימות LCM היו תפוקות RNA כוללות נמוכות (ממוצע של 30 ננוגרם) ונדרשו שני סבבים של הגברת mRNA כדי לעמוד בסף קלט ההכנה של ספריית cDNA²⁴. החוקרים מצאו כי פרופילי ביטוי הגנים של LCM שהתקבלו הושפעו מסבבי הגברת ה-mRNA יותר מאשר פרופילים מקרו-דיסקרטיים הושפעו מתרומות סטרומליות שאינן של הגידול, והגיעו למסקנה כי ניתן להשתמש במאקרו-דיסקציה כראוי כדי ליצור נתוני ביטוי גנים אמינים²⁴.

יתרון משמעותי של פרופיל ביטוי גנים דיגיטלי של NanoString, במיוחד כאשר עובדים עם RNA שמקורו ב-FFPE מושפל מאוד, הוא שהוא אינו דורש תהליכים תלויים אנזימטיים כגון הגברת RNA או הכנה של ספריות cDNA. עם זאת, בדיקות מותאמות בדרך כלל לתשומות בין 50-300 ננוגרם של סך ה-RNA^25,26, אשר, בהתבסס על הממצאים של de Bruin et ^al.24, ייתכן שאינן תואמות לרקמות שעברו מיקרו-דיסקציה מבלי להגדיל את קלט הרקמה; דרישה שלילית בעידן שבו דגימות רקמה נאספות יותר ויותר כביופסיות קטנות ולא כריתה כירורגית. קלטי הרנ"א ששימשו לבדיקת DLBCL90 נעו בין 68.5-300 ננוגרם הן עבור הרקמות המקרו-דיסקרטיות והן עבור הרקמות שלא נותחו. התוצאות מראות כי מקרו-דיסקציה הביאה לשינויי קריאה ב-60% מהדגימות שנבדקו, וכי שינויים אלה נצפו ללא קשר לקלט הרנ"א של הדגימות המאקרו-דיסקטיות. עם זאת, הסתברות ה-COO לקלט הרנ"א הנמוך אכן חצתה את סף הקריאה להסתברות COO GCB/UNC, כאשר הסף הוא 0 עד <0.1 עבור GCB, 0.1-0.9 עבור UNC, ו->0.9 עד 1.0 עבור שיחות ABC²⁰. תתי-הסוגים העיקריים של DLBCL COO הם GCB ו-ABC, המהווים 41% ו-44% מכלל מקרי ה-DLBCL, כאשר UNC מייצג קבוצת ביניים של השניים ו-ABC הוא^{האגרסיבי ביותר 20,27}. לפיכך, בעוד ששינוי הקריאה של COO עם ניתוח מאקרו של מדגם C לא גרם לשינוי גלוי בתת-סוג COO מ-GCB ל-ABC, השינוי מ-GCB ל-UNC עשוי להצביע על מעבר למחלה אגרסיבית יותר. יתר על כן, מחקרים אחרונים מצביעים על כך שתת-הסוג UNC אינו רק תת-סוג ביניים וכי הוא עשוי להיות בעל תכונות ספציפיות לתת-סוג ספציפי לניצול טיפולי²⁸. באופן דומה, ניתוח מאקרו של דגימות A ו-E לא גרם לשינויים גלויים בקריאות DHITsig מ-DH שלילי ל-DH חיובי, או להיפך. עם זאת, התנועות של דגימת GCB (מדגם A) מ-NEG ל-UNCLASS ומדגם ABC (דגימה E) מ-UNCLASS ל-NEG בעת חשיפת מאקרו מתאימות מבחינה ביולוגית, שכן טרנסלוקציות כפולות של פגיעה הכוללת BCL2 מדווחות כתופעת GCB¹⁹ בלבד. למרות שטרנסלוקציות מזוהות באופן מסורתי ובכל מקום על ידי FISH במסגרות קליניות, יש מומנטום הולך וגדל לזהות שיטה חלופית פחות מעורבת וגוזלת זמן לזיהוי שלהן. בדיקת DLBCL90 היא כלי חשוב הנותן מענה לצורך זה, כאשר הרציונל לשימוש בו מתחזק על ידי הממצא כי בדיקה זו מסוגלת לזהות טרנסלוקציות קריפטיות לבדיקות FISH המשמשות באבחון קליני²⁹.

פרוטוקול המאקרו-דיסקציה שתואר לעיל מתווה שיטה פשוטה המאפשרת לחוקרים להגדיל את תכולת הגידול של דגימות רקמה שבדרך כלל היו נופלות מתחת לסף קריטריוני ההכללה המקובלים במחקר. הכללת מקרו-דיסקציה בתהליך עבודה של מחקר מאפשרת לחוקרים להציל רקמות צפופות גידולים בצורה גרועה מהדרה של מחקרים על ידי הגדלת תכולת הגידול שלהם. בתורו, זה מאפשר ביטחון מוגבר כי הרנ"א וכתוצאה מכך eluates RNA ו- DNA מייצגים את הגידול תחת חקירה גנומית. אף על פי שקיימות שיטות מדויקות יותר לניתוח רקמות, עבור גידולים שגדלים בצורה רחבה יותר, לא פולשנית, דמוית יריעה או מוצקה, סביר להניח שמקרי-דיסקציה מספיקה. התוצאות שהוצגו כאן מדגישות את החשיבות של טוהר הגידול במבחנים גנומיים ובמקרו-דיסקציה ככלי אמין להשגת מטרה זו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
200-proof ethanol	Decon	2701
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit	Qiagen	80234	DNA/RNA FFPE extraction kit
Coplin pots	Various	x
DLBCL90 probes	NanoString	various	Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay
d-Limonene	VWR	89376-092
Forceps	Various	x
Glass micrscope slides	FisherBrand	12-550-15
Glycerol	VWR	0854-1L
Master kits	NanoString	various
Microtome	Leica	RM2265
Microtubes	Ambion	AM12400
NanoDrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W	Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation
nCounter	NanoString	x	Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay
Permanent marker	Electrib Microscope Sciences	72109-12
Razor blade dispenser	Electrib Microscope Sciences	71985-10
Razor blades	Electrib Microscope Sciences	71985-23
Tissue digestion buffer	Qiagen	80234
Ultrapure water	VWR	SH30538.02
Waterbath	Triangle Biomedical Sciences	TFB-120
Wooden stick	FisherBrand	22363158