Mejorar el contenido tumoral a través de la macrodisección tumoral

Resumen

Este protocolo presenta un método para aumentar el porcentaje de contenido tumoral de las muestras de tejido incrustadas en parafina fijadas en formalina.

Resumen

La presencia de tejidos no tumorales contaminantes en tejidos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE) puede socavar en gran medida los estudios genómicos. Aquí describimos la macrodisección, un método diseñado para aumentar el porcentaje de contenido tumoral de una muestra de tejido mediante la eliminación y eliminación de tejido no deseado antes de realizar extracciones de ácido nucleico aguas abajo. Los bloques de tejido FFPE se seccionaron para producir secciones de tejido montadas en diapositivas de 4-5 μm. Se presentó una sección representativa para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y posteriormente fue revisada por un patólogo certificado por la junta. Durante la revisión, el patólogo identificó y marcó las regiones de tejido tumoral en el H&E. Una vez completado, el H&E demarcado se utilizó para guiar la resección de las secciones no teñidas en serie del mismo bloque de tejido. Para demostrar los efectos de la macrodisección, el ARN extraído de linfomas difusos de células B grandes (DLBCL) macrodiseccionados y no disecados emparejados se ejecutó en un ensayo de expresión génica digital capaz de determinar el subtipo DLBCL y el estado de translocación BCL2. Los resultados mostraron que la macrodisección cambió el subtipo o las llamadas de estado de translocación BCL2 en el 60% de las muestras examinadas. En conclusión, la macrodisección es un método simple y efectivo para realizar el enriquecimiento tumoral antes de las extracciones de ácido nucleico, cuyo producto se puede utilizar con confianza en estudios genómicos posteriores.

Introducción

Los tejidos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE), recolectados como parte del proceso de diagnóstico clínico normal y retenidos en repositorios de tejidos clínicos, representan un vasto recurso para la investigación en humanos, incluida la investigación del cáncer¹. A medida que nuestra comprensión de la enfermedad humana se profundiza, se está volviendo cada vez más claro que las enfermedades, que anteriormente se pensaba que eran entidades únicas basadas en características morfológicas e inmunofenotípicas, de hecho se componen de distintos subtipos moleculares que requieren ensayos de subtipificación molecular. En consecuencia, los ensayos genómicos de alta sensibilidad capaces de discernir estos subtipos se han vuelto cada vez más importantes². Aunque los tejidos FFPE son conocidos por ser poco compatibles con las técnicas genómicas debido a problemas relacionados con la fijación, a medida que la tecnología y los protocolos evolucionan, estas técnicas son cada vez más compatibles con este formato de tejido clínicamente ubicuo ^3,4,5. Sin embargo, los tejidos FFPE son a menudo mezclas de materiales tisulares tumorales y no tumorales, donde la presencia de material no tumoral es a menudo no deseada y puede, si está presente en una proporción alta, socavar e impactar significativamente los resultados de los análisis genómicos⁶. De hecho, se utiliza con frecuencia un contenido tumoral mínimo del 60% para tales análisis, donde se pueden excluir los tejidos que no alcanzan este umbral, a pesar de cumplir con los criterios del estudio⁷. Esto puede ser particularmente problemático en entornos de enfermedades raras, donde los tejidos de los pacientes son preciosos y difíciles de recolectar en grandes cantidades.

La macrodisección es un método que minimiza los efectos del bajo contenido tumoral al reducir la cantidad de tejido normal³. La eliminación de dicho material no tumoral confuso antes de la extracción de ácido nucleico puede aumentar significativamente el contenido porcentual del tumor y, por lo tanto, la pureza tumoral de los ácidos nucleicos extraídos. La resección tisular se basa críticamente en la revisión patológica de expertos, en la que la región del tumor se identifica y se rodea en una sección de tejido teñido de hematoxilina y eosina (H&E) recién generada por un patólogo certificado por la junta⁸. El H&E con círculos se utiliza para guiar la eliminación y la recolección de tejidos no deseados y objetivo, respectivamente. Este protocolo describe los pasos de la macrodisección desde la revisión patológica hasta la recolección de tejidos como se realiza en el Laboratorio Técnico Básico del Recurso de Muestras de SIDA y Cáncer (ACSR) en la Clínica Mayo.

Protocolo

Todas las muestras se recolectaron y utilizaron de conformidad con los protocolos IRB aprobados de Mayo Clinic (PR16-000507 y PR2207-02).

1. Preparación de la muestra

1. Encienda el baño de agua de flotación de tejidos. Ajuste la temperatura a 39 °C y deje que el agua llegue a la temperatura. Remoje los palos de recolección de madera en el baño de agua.
2. Identifique y recupere los bloques de tejido FFPE que se van a seccionar.
3. Portaobjetos de microscopio pre-etiqueta utilizando un marcador permanente de grado histológico que puede soportar lavados con solvente.
4. Utilice un microtomo para seccionar los bloques FFPE. Cortar al menos 2 secciones de cara completa a un espesor de 4-5 μm por sección para cada bloque (Figura 1A).
5. Transfiera la cinta recién cortada de las secciones de tejido al baño de flotación de tejido precalentado para el montaje de la diapositiva (Figura 1B, C).
   NOTA: El agua tibia ayuda a "planchar" las arrugas en las secciones (Figura 1C).
6. Al manejar cada sección secuencialmente, use fórceps para separar una sola sección de la cinta de opciones (Figura 1D).
7. Recoja la sección única en un portaobjetos de microscopio preetiquetado.
   1. Sumerja el portaobjetos del microscopio en un ángulo debajo de la sección, colocando el portaobjetos de tal manera que el borde de la sección de tejido toque el portaobjetos (Figura 1E).
   2. Una vez en contacto con la sección de tejido, saque el portaobjetos del baño de flotación lentamente para permitir que la sección de tejido se enderece al ras contra el portaobjetos a medida que emerge del agua (Figura 1F).
8. Monte 1 sección de tejido por diapositiva y repita hasta que se hayan recogido todas las secciones.
9. Permita que las secciones de tejido montadas en deslizamiento se sequen completamente a temperatura ambiente (RT).

2. Revisión patológica

1. Realice tinciones de H&E en una sección de tejido representativa para cada bloque⁹.
2. Envíe el H&Es recién teñido para su revisión patológica por un patólogo certificado por la junta.
   NOTA: Durante la revisión, el patólogo determina y registra el porcentaje de contenido tumoral en cada tejido y rodea el área del tumor en cada diapositiva de H&E (consulte la Figura 2 y la Figura 3, Fila 1). La Tabla 1 describe el porcentaje de contenido tumoral por celularidad determinado durante la revisión patológica del H&Es para las muestras A-E que se muestran en la Figura 3, Fila 1. Las secciones con <60% de contenido tumoral requieren macrodisección⁷. El número de secciones necesarias para la extracción de ácidos nucleicos depende del tamaño del área tumoral en círculo. Si se cortaron secciones insuficientes en la sección 1 del protocolo y es posible realizar más cortes, es posible que sea necesario cortar secciones adicionales.

3. Desparafinación

1. En una campana extractora, rellene previamente dos platos de tinción de vidrio con d-limoneno de grado histológico sin diluir o un disolvente a base de d-limoneno y 1 plato de tinción de vidrio con etanol de grado molecular sin diluir a prueba de 200.
   PRECAUCIÓN: Evite el contacto del d-limoneno con la piel y los ojos, evite la inhalación de vapor o niebla y manténgase alejado de las fuentes de ignición. Mantenga el etanol alejado del calor, las chispas y las llamas abiertas, evite derrames y contacto con la piel o los ojos, ventile bien y evite respirar vapores.
   NOTA: Llene los platos lo suficiente como para sumergir los toboganes en estanterías (Figura 4A); Se requieren 250 ml para llenar los platos de tinción de 20 diapositivas que se muestran. Reemplace los lavados de d-limoneno y etanol después de cada 40 diapositivas. El D-limoneno (C₁₀H₁₆) es un agente desparafinante alternativo, igualmente efectivo y menos tóxico al xileno que se está volviendo más común en las metodologías histológicas y produce ácido nucleico de buena calidad después de la extracción 10,11,12,13,14. Aunque este protocolo puede realizarse utilizando alternativas más biopáticas¹⁵, aún no se han determinado sus efectos, si los hay, sobre la calidad de los ácidos nucleicos extraídos.
2. Rack de los deslizadores montados en tejido FFPE sin teñir en los bastidores deslizantes coplin de vidrio (Figura 4A, recuadro).
3. Sumergir los toboganes trasiegados en d-Limonene lavar 1 durante 2 min; agitar suavemente durante los primeros 20 s.
   NOTA: Para minimizar el arrastre entre lavados, al retirar el estante de toboganes de un lavado, permita que el estante escurra brevemente antes de frotar suavemente el fondo del estante en papel de seda para eliminar el exceso de lavado.
4. Sumergir los portaobjetos en racked en D-Limonene wash 2 sin diluir durante 2 min; agitar suavemente durante los primeros 20 s. Retire, escurra y vuelva a frotar la rejilla.
5. Sumergir los portaobjetos en el lavado de etanol durante 2 min; agitar suavemente durante los primeros 20 s. Retire la rejilla y colóquela sobre un tejido absorbente para drenar. Deje que los toboganes se sequen al aire durante al menos 10 minutos, pero no más de 2 h.

3. Macrodisección

1. En el banco, llene previamente un frasco de vidrio Coplin con 50 ml de glicerol al 3% en agua libre de DNasa / RNasa
   NOTA: Reemplace el lavado de glicerol después de cada 40 diapositivas.
2. Pre-etiquetar y precargar microtubos de 1,5 ml con 160 μL de tampón de digestión tisular por microtubo.
   NOTA: Las extracciones de ácido nucleico realizadas después de la macrodisección utilizaron un kit de extracción de ADN/ARN FFPE (Tabla de Materiales). Por lo tanto, el tampón de digestión tisular utilizado en este protocolo comprendía 10 μL de proteinasa K y 150 μL de tampón PKD.
3. Rastree las marcas patológicas en el H&E en la parte posterior de los portaobjetos de tejido desparafinado.
   NOTA: En comparación con los tejidos no desparafinados (Figura 3, Fila 2 y Figura 4B), los tejidos desparafinados son blancos y altamente visibles (Figura 3, Fila 3 y Figura 4C). Es esta mayor visibilidad y discernibilidad de las características del tejido desparafinado lo que permite la macrodisección. Coloque el H&E boca abajo en el banco y coloque la parte delantera del tobogán desparafinado contra la parte posterior del patólogo emparejado revisado H&E (Figura 4D). Alinear el tejido desparafinado con el tejido H&E (Figura 4E). El rastreo de las marcas del patólogo es un paso crítico en el proceso de macrodisección, y se debe tener cuidado de reproducir estas marcas con la mayor precisión posible. Esto puede ser particularmente difícil para tejidos pequeños y/o desconectados, como las muestras B, D y E (Figura 3, Figura 4E y Figura 4E recuadro i). Para ayudar al rastreo, se debe usar un marcador de tinta fina o ultrafina (Figura 4E, recuadro ii) para rastrear las marcas dibujadas por el patólogo. Las toallitas de etanol pueden ser útiles para eliminar errores y permitir el rastreo si es necesario.
4. Gire el tejido deslizante ahora marcado desparafinado boca arriba y trace la línea del marcador con la esquina de una cuchilla de afeitar limpia para cortar previamente los bordes del área del tumor.
5. Manejando cada diapositiva secuencialmente, sumerja las diapositivas desparafinadas en la solución de glicerol al 3%. Asegúrese de que el tejido esté completamente sumergido antes de retirar el portaobjetos lentamente (Figura 4F).
   NOTA: El propósito de la inmersión de glicerol es humedecer el tejido para ayudar a la recolección de tejido, pero también para reducir la acumulación de carga estática que puede causar repulsión entre el tejido y el microtubo de plástico en el que se debe colocar el tejido recolectado.
6. Limpie suavemente la parte posterior de la diapositiva con un pañuelo desechable para eliminar el exceso de solución de glicerol y coloque la diapositiva en el banco, limpiada de lado hacia abajo. Deje que los tejidos se aireen brevemente durante 1-2 min.
   NOTA: La transferencia del exceso de glicerol en el proceso de extracción puede afectar negativamente el rendimiento y la calidad de las extracciones de ácidos nucleicos. Los tejidos deben estar ligeramente húmedos pero no visiblemente húmedos cuando se recogen.
7. Dependiendo de dónde se encuentre el área de interés del tumor en el portaobjetos, use el borde plano de la hoja de afeitar para (a) recolectar directamente el tejido tumoral, usando la maquinilla de afeitar para raspar / recolectar el tejido de interés del portaobjetos, o (b) extraer y desechar el tejido no tumoral primero antes de recolectar el tejido tumoral de interés (Figura 3).
   NOTA: El tejido recolectado tiende a acumularse o enrollarse en la parte inferior de la cuchilla (Figura 4G)
8. Use un palo de madera para extraer el tejido recolectado de la cuchilla (Figura 4H y recuadro) y transfiéralo al microtubo preetiquetado y precargado apropiado (Figura 4I).
   NOTA: El tampón de digestión sirve para "tirar" del tejido de la púa de madera hacia el líquido.
9. Proceder a la extracción de ácido nucleico.
   NOTA: Las extracciones de ácido nucleico se completaron utilizando el kit de extracción de ADN / ARN FFPE según las instrucciones del fabricante, y los ácidos nucleicos resultantes se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro UV-vis. El ARN resultante se ejecutó en el ensayo DLBCL90 basado en perfiles de expresión génica digital¹⁶.

Resultados

Se seccionaron un total de 5 bloques de tejido FFPE de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), y las secciones resultantes se macrodiseccionaron o no antes de la extracción de ácido nucleico. El ARN extraído se ejecutó en el ensayo DLBCL90¹⁶. Las muestras macrodiseccionadas se ejecutaron dos veces, una vez utilizando 5 μL de concentración de stock de ARN pero no más de 300 ng de entrada total de ARN y una vez usando 5 μL de stock de ARN diluido para que coincida con las entradas de ARN de sus respectivas contrapartes no diseccionadas. Los resultados de DLBCL90 se describen en la Tabla 2.

DLBCL está compuesto por 3 subtipos distintos de células de origen (COO) con diferente capacidad de respuesta terapéutica, a saber, GCB, ABC y un grupo intermedio conocido como no clasificado o UNC^17,18. Las translocaciones que involucran MYC, BCL2 y/o BCL6 solo o en combinación (doble o triple golpe) también se observan con frecuencia en DLBCL, particularmente en el subtipo^{GCB 19}. El ensayo DLBCL90 es una expansión de su predecesor, el ensayo clínico Lymph2Cx, y por lo tanto es capaz de determinar el subtipo DLBCL COO, pero se desarrolló principalmente para identificar muestras que albergan translocaciones de doble golpe (DH) que involucran BCL2 utilizando la expresión génica digital como alternativa a la hibridación fluorescente in situ (FISH)^16,20. Los resultados de la Tabla 2 muestran que la macrodisección cambió el COO o el estado de DHITsig requiere el 60% (3/5) de las muestras examinadas.

La macrodisección de la muestra A no tuvo ningún efecto en la llamada de COO, pero cambió la llamada de DHITsig de NEG a UNCLASS, y este cambio se observó independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodiseccionada y con puntuaciones de probabilidad similares (0,224, 0,254). Por el contrario, la macrodisección de la muestra C no tuvo ningún efecto en la llamada de DHITsig, pero cambió la llamada de COO de GCB a UNC. Una vez más, este cambio se observó independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodiseccionada. Sin embargo, en 0.117, la probabilidad de llamada de COO estaba más cerca del umbral de llamada de 0.1 para la muestra macrodiseccionada con entrada de ARN reducida. Al igual que la muestra A, la macrodisección de la muestra E no tuvo ningún efecto en la llamada de COO, pero cambió la llamada de DHITsig. Sin embargo, para la muestra E, la llamada cambió de UNCLASS a NEG y lo hizo independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodiseccionada con llamadas de probabilidad razonablemente similares (0.849, 0.833). En particular, este cambio de llamada a DHITsig NEG tiene sentido biológico dado que la muestra E se encontró a ABC-DLBCL, y se ha informado que las translocaciones de doble golpe que involucran BCL2 se observan exclusivamente en GCB-DLBCL¹⁹.

Figura 1: Generación de secciones de tejido montadas en diapositivas utilizando un microtomo. (A) Bloque de tejido FFPE sostenido en su lugar por el mandril del microtomo y cortado para producir una cinta de secciones secuenciales de tejido FFPE. (B) Usando palos de madera pre-empapados, la cinta se recoge del microtomo y se transfiere a un baño de agua tibia. (C) El calor del agua ayuda a planchar los pliegues en la cinta de tejido. (D) Las secciones individuales de tejido FFPE se eliminan de la cinta de tejido colocando pinzas cerradas en la unión de dos secciones y abriendo suavemente las pinzas, lo que separa las secciones entre sí. (E) Las secciones se recogen del agua sumergiendo un portaobjetos de vidrio en ángulo y moviendo suavemente el lado hacia la sección de tejido hasta que el borde de la sección toque el portaobjetos de vidrio. (F) Una vez que la diapositiva y la sección estén tocando, retire lentamente la diapositiva del agua, permitiendo que la sección de tejido caiga al ras contra la diapositiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Revisión patológica e histológica de una sección teñida de hematoxilina y eosina (H&E). (A, B) La sección de tejido de H&E es sometida a revisión microscópica por un patólogo certificado por la junta. (C,D) Una vez que el patólogo ha visto todo el tejido y ha encontrado que no es 100% tejido tumoral, el patólogo utilizará un marcador para rodear el área tumoral del tejido. (E,F) Mantener el H&E marcado contra el bloque de tejido FFPE original muestra que no todo el tejido es material tumoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Muestras de tejido. Esta imagen muestra los H&Es patológicamente revisados y marcados con tumores (Fila 1), secciones de tejido FFPE montadas en diapositivas no procesadas (Fila 2), secciones de tejido FFPE desparafinadas montadas en diapositivas (Fila 3), secciones de tejido FFPE desparafinadas montadas en diapositivas con marcas de patología trazadas en la parte posterior de la diapositiva (Fila 4), secciones de tejido FFPE desparafinadas y macrodiseccionadas montadas en diapositivas (Fila 5) para las 5 muestras (A-E) utilizadas para demostrar este protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Desparafinación y macrodisección de secciones de tejido FFPE: (A) En una campana de humos, los tejidos FFPE montados en un estante deslizante se lavan en dos lavados d-limoneno y un lavado de etanol. (B,C) Después del lavado, se ha eliminado toda la parafina y solo queda el tejido en el portaobjetos, que ahora es blanco y altamente visible en comparación con su contraparte prelavada. (D) La sección de tejido desparafinada montada en un portaobjetos se coloca boca abajo en la parte posterior de su marca H&E. (E) Las marcas del área tumoral en el H&E se trazan en la parte posterior del portaobjetos desparafinado utilizando un marcador permanente fino o ultrafino (F) La sección de tejido marcada con deslizamiento desparafinado se sumerge en un lavado de glicerol para humedecer la sección de tejido para la recolección. El portaobjetos se retira lentamente del glicerol, y la parte posterior del portaobjetos se limpia con un pañuelo desechable para eliminar el exceso de glicerol antes de colocar el tejido del portaobjetos boca arriba en el banco. (G) Usando el lado plano de una cuchilla de afeitar limpia, el tejido se macrodisecciona y el tejido no deseado fuera de las marcas del patólogo se descarta antes de recolectar el tejido de interés, que se reúne a lo largo del borde de la cuchilla. (H) Se utiliza un palo de madera para extraer el tejido recogido del borde de la cuchilla. (I) El tejido se transfiere a un tampón de digestión de tejido precargado de microtubos preetiquetado y está listo para la extracción de ácido nucleico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ID de muestra	Tejido entero (a)		Área de tejido con círculos (b)		Contenido tumoral general de tejido entero (c)	Aumento del pliegue en el contenido tumoral por macrodisección (d)	No macrodiseccionado (e)		Macrodiseccionado (f)
	% Tumor viable	% Otros	% Tumor viable	% Otros			# de diapositivas de 5 μm extraídas	CONC de ARN (ng/μL)	# de diapositivas de 5 μm extraídas	CONC de ARN (ng/μL)
Ejemplo A	60	40	75	25	45	1.7	2	19.0	4	58.3
Ejemplo B	60	40	65	35	39	1.7	1	34.0	2	60.0
Ejemplo C	40	60	65	35	26	2.5	1	13.7	2	46.2
Ejemplo D	35	65	90	10	32	2.9	1	57.3	2	60.0
Ejemplo E	20	80	30	70	6	5.0	3	25.2	3	44.6

Tabla 1: Datos de revisión patológica. La tabla muestra (a) el porcentaje de tumor viable en toda la sección de tejido por área, (b) el porcentaje de tumor viable en el área rodeada / marcada por el patólogo durante la revisión por celularidad, (c) la celularidad tumoral global estimada de todo el tejido (a x b), (d) el aumento estimado del pliegue en la celularidad tumoral logrado con macrodisección, e y f) el número de secciones de tejido ffPE no teñidas de 5 μm sin teñir extraídas y las concentraciones de ARN resultantes para muestras no macrodiseccionadas y macrodiseccionadas compatibles. % Otro se refiere a todos los demás tejidos presentes en una muestra dada que no es tejido tumoral y puede incluir tejido conectivo, fibroblastos estromales, vasos sanguíneos y otros elementos estromales inherentes. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

ID de muestra		Entrada de ARN (ng)	Llamada de COO de DLBCL90	Probabilidad de llamada DLBCL90	Llamada de DHITsig	Probabilidad de DHITsig pos	DHITsig neg probabilidad
No macrodiseccionado	Ejemplo A	95.0	Gcb	0.000	Neg	0.135	0.865
	Ejemplo B	170.0	Gcb	0.000	Neg	0.032	0.968
	Ejemplo C	68.5	Gcb	0.028	Neg	0.033	0.967
	Ejemplo D	286.5	Abecedario	0.998	Neg	0.002	0.998
	Ejemplo E	126.0	Abecedario	0.989	UNCLASS	0.212	0.788
Macrodiseccionado	Ejemplo A_M	291.7	Gcb	0.000	UNCLASS	0.224	0.776
	Ejemplo B_M	300.0	Gcb	0.000	Neg	0.016	0.984
	Ejemplo C_M	231.2	UNCLASS	0.210	Neg	0.015	0.985
	Ejemplo D_M	300.0	Abecedario	0.999	Neg	0.002	0.998
	Ejemplo E_M	223.2	Abecedario	0.987	Neg	0.151	0.849
Macrodiseccionado y ARN diluido	Ejemplo A_M	95.0	Gcb	0.000	UNCLASS	0.254	0.746
	Ejemplo B_M	170.0	Gcb	0.000	Neg	0.023	0.977
	Ejemplo C_M	68.5	UNCLASS	0.117	Neg	0.027	0.973
	Ejemplo D_M	286.5	Abecedario	0.999	Neg	0.002	0.998
	Ejemplo E_M	126.0	Abecedario	0.995	Neg	0.167	0.833

Tabla 2: Resultados del ensayo de expresión génica digital DLBCL90. Cinco muestras (A-E) no fueron macrodiseccionadas o macrodiseccionadas antes de que se realizaran extracciones con ácido nucleico. El ARN resultante se ejecutó en el ensayo DLBCL90, para el cual el volumen máximo de entrada de ARN es de 5 μL. Las muestras no macrodiseccionadas se ejecutaron utilizando 5 μL de ARN madre. Cada muestra macrodiseccionada se ejecutó dos veces utilizando (a) 5 μL de ARN de stock a menos que fueran posibles alícuotas de 60 ng/μL y (b) 5 μL de ARN stock diluido para igualar las concentraciones/entrada de sus contrapartes no macrodiseccionadas. El sufijo _M denota que esa muestra fue macrodiseccionada. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Los tejidos FFPE son con frecuencia mezclas heterogéneas de tejidos tumorales y no tumorales. Las pruebas genómicas de alta sensibilidad son cada vez más frecuentes tanto en entornos clínicos como de investigación, pero pueden confundirse por la presencia de tejido no tumoral contaminante. De hecho, con frecuencia se recomienda un contenido mínimo de tumores del 60% para los estudios genómicos. El porcentaje de tumor se puede determinar por el área de tejido ocupada por el material tumoral o por la proporción de células tumorales dentro del tejido. Aunque el tumor por área es una métrica comúnmente utilizada para la pureza del tumor, no siempre retrata una descripción precisa del tejido. Considere dos tejidos, ambos con 1000 células, de las cuales 500 son células tumorales. En el tejido A, las 500 células no tumorales son células estromales con volúmenes similares a los de la célula tumoral. En este tejido, el porcentaje de tumor puede considerarse 50% tanto por celularidad como por área. En el tejido B, las 500 células no tumorales son células grasas con volúmenes que son 4 veces mayores que los de la célula tumoral. En este tejido, el porcentaje tumoral sigue siendo del 50% por celularidad pero del 20% por área. Un tercer tejido, el tejido C, está compuesto por 500 células tumorales más 400 células grasas y 800 células estromales con volúmenes que son 4x y 0,5x el de las células tumorales, respectivamente. Dado que 100 células grasas equivalen al volumen de 800 células estromales, el porcentaje de tumor de tejido C es del 29% por celularidad (500/1700), pero aún así del 20% por área. El tejido D también se compone del tumor, la grasa y las células del estroma con proporciones de volumen de 1x, 4x y 0.1x. Sin embargo, el número de células es 400, 10 y 720, respectivamente. Así, el porcentaje tumoral de tejido D es del 35% por celularidad (400/1130) pero del 78% por área. Estos ejemplos son demasiado simplistas y no reflejan composiciones de tejidos del mundo real, pero transmiten claramente la importancia de la composición de tejidos y la diferencia entre el contenido tumoral por área y por celularidad. Es importante destacar que, cuando se trata de enriquecer el contenido tumoral para la extracción de ácido nucleico aguas abajo, la celularidad tumoral es el atributo más importante debido al mayor potencial de confusión de la extracción de material genómico de más células no tumorales que las células tumorales. Esto no solo subraya la necesidad de evaluar el contenido tumoral de los tejidos en términos de porcentaje de celularidad, sino también la necesidad de extirpar el tejido no deseado para minimizar cualquier posible efecto negativo del tejido no tumoral. Hay varios métodos disponibles para el enriquecimiento de tejidos, siendo los principales la macrodisección y la microdisección.

La macrodisección, el método descrito en este protocolo, es relativamente rápido, simple y no requiere equipo costoso o especializado. Aunque la macrodisección puede mejorar en gran medida el contenido tumoral, es importante comprender que no elimina completamente el material no tumoral. El propósito de la macrodisección es enriquecer suficientemente el tejido de interés a través de la exclusión de tejido no deseado para reducir el "ruido" derivado del tejido no deseado, lo que a su vez puede mejorar la señal de interés del tejido de interés. Por lo tanto, el enriquecimiento tumoral mediado por macrodisección es una forma de mejorar la relación señal-ruido para detectar mejor los marcadores de interés, particularmente los marcadores moleculares específicos del tumor con baja abundancia o mala expresión. Sin embargo, la macrodisección tiene limitaciones debido a la falta de precisión que ofrecen las herramientas gruesas como las cuchillas de afeitar y es susceptible a problemas de precisión derivados del grosor de la línea del marcador del patólogo, así como a posibles errores al rastrear las demarcaciones de H&E de los patólogos. Como se mencionó anteriormente, no es posible lograr una pureza tumoral del 100% debido a la presencia de elementos estromales inherentes e inductores de tumores (es decir, tejido conectivo, fibroblastos estromales, vasos sanguíneos, linfocitos reactivos benignos, macrófagos) incrustados dentro del propio tumor. De hecho, muchas neoplasias malignas invasivas o de infiltración difusa inducen una respuesta estroma desmoplástica robusta, lo que resulta en grupos de células tumorales que están íntimamente mezcladas con fibroblastos estromales y otros tipos de células no neoplásicas; donde los tumores asociados con este patrón de reacción estromal, como los tejidos de cáncer de páncreas²¹, pueden beneficiarse más de la microdisección guiada digitalmente que de la macrodisección manual.

La microdisección manual se realiza bajo un microscopio para ayudar a la identificación, disección y aislamiento de células o poblaciones específicas de tejidos utilizando una aguja o bisturí y tiene la ventaja de una mayor precisión sobre la macrodisección²². Sin embargo, la microdisección manual es un proceso laborioso que carece de la delicadeza necesaria para tejidos complejos con bajo contenido tumoral o características intrincadas que son incompatibles con la disección manual. Dichos tejidos se pueden diseccionar utilizando métodos automatizados de alta precisión como la microdisección de captura láser. De hecho, se ha demostrado que la microdisección guiada digitalmente produce un mayor porcentaje de contenido tumoral en comparación con la macrodisección manual en los tejidos de cáncer de páncreas²³. Sin embargo, los inconvenientes de estos métodos automatizados de alta precisión, como la necesidad de equipos especializados y costosos y personas altamente capacitadas, han obstaculizado su incorporación en los flujos de trabajo. Un estudio realizado por de Bruin et al. comparando los efectos de la macrodisección y la microdisección de captura láser (LCM) en el perfil de expresión génica encontró que las muestras de LCM tenían bajos rendimientos totales de ARN (promedio de 30 ng) y requerían dos rondas de amplificación de ARNm para cumplir con el umbral de entrada de preparación de la biblioteca de ADNc²⁴. Los autores encontraron que los perfiles de expresión génica LCM resultantes se vieron afectados por las rondas de amplificación de ARNm más que los perfiles macrodiseccionados se vieron afectados por las contribuciones estromales no tumorales y concluyeron que la macrodisección podría usarse adecuadamente para generar datos confiables de expresión génica²⁴.

Una ventaja significativa del perfil de expresión génica digital nanoString, particularmente cuando se trabaja con ARN derivado de FFPE altamente degradado, es que no requiere procesos dependientes enzimáticos como la amplificación de ARN o la preparación de bibliotecas de ADNc. Sin embargo, los ensayos suelen estar optimizados para entradas entre 50-300 ng de ARN total^25,26, que, según los hallazgos de De Bruin et ^al.24, pueden no ser compatibles con tejidos microdisecados sin aumentar la entrada tisular; una demanda desfavorable en una era en la que las muestras de tejido se recogen cada vez más como biopsias pequeñas en lugar de resecciones quirúrgicas. Las entradas de ARN utilizadas para el ensayo DLBCL90 variaron de 68.5-300 ng tanto para los tejidos macrodiseccionados como para los no disecados. Los resultados muestran que la macrodisección dio lugar a cambios de llamada en el 60% de las muestras examinadas y que estos cambios se observaron independientemente de la entrada de ARN de las muestras macrodiseccionadas. Sin embargo, la probabilidad de COO para la baja entrada de ARN invadió el umbral de llamada de probabilidad COO GCB / UNC, donde los umbrales son de 0 a <0.1 para GCB, 0.1-0.9 para UNC y >0.9 a 1.0 para llamadas ABC²⁰. Los principales subtipos de COO de DLBCL son GCB y ABC, que representan el 41% y el 44% de todos los casos de DLBCL, con UNC representando un grupo intermedio de los dos y ABC siendo el^{más agresivo 20,27}. Por lo tanto, mientras que el cambio de llamada de COO a la macrodisección de la muestra C no causó un cambio franco en el subtipo de COO de GCB a ABC, el cambio de GCB a UNC puede sugerir un cambio hacia una enfermedad más agresiva. Además, estudios recientes indican que el subtipo UNC no es simplemente un subtipo intermedio y que potencialmente puede poseer atributos terapéuticamente explotables específicos del subtipo²⁸. Del mismo modo, la macrodisección de las muestras A y E no causó cambios francos en las llamadas de DHITsig de DH negativo a DH positivo, o viceversa. Sin embargo, los movimientos de una muestra de GCB (muestra A) de NEG a UNCLASS y una muestra abc (muestra E) de UNCLASS a NEG en macrodisección son biológicamente apropiados, ya que se informa que las translocaciones de doble impacto que involucran BCL2 son un fenómeno exclusivamente GCB¹⁹. Aunque las translocaciones son detectadas tradicional y ubicuamente por FISH en entornos clínicos, existe un impulso creciente para identificar un método alternativo menos involucrado y lento para su detección. El ensayo DLBCL90 es una herramienta importante que aborda esta necesidad, donde la justificación de su uso se ve reforzada por el hallazgo de que este ensayo es capaz de detectar translocaciones crípticas a sondas FISH utilizadas en diagnósticos clínicos²⁹.

El protocolo de macrodisección descrito anteriormente describe un método simple que permite a los investigadores aumentar el contenido tumoral de muestras de tejido que normalmente caerían por debajo de los umbrales de los criterios de inclusión de estudios comúnmente utilizados. La inclusión de la macrodisección en el flujo de trabajo de un estudio permite a los investigadores rescatar tejidos pobremente densos en tumores de la exclusión del estudio al aumentar su contenido tumoral. A su vez, esto permite una mayor confianza en que los eluidos de ARN y ADN resultantes representan el tumor bajo investigación genómica. Aunque existen otros métodos más precisos para la disección de tejidos, para los tumores que crecen de una manera más expansiva, no infiltrativa, similar a una lámina o sólida, la macrodisección es probablemente suficiente. Los resultados presentados aquí resaltan la importancia de la pureza tumoral en los ensayos genómicos y la macrodisección como una herramienta confiable para lograrlo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
200-proof ethanol	Decon	2701
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit	Qiagen	80234	DNA/RNA FFPE extraction kit
Coplin pots	Various	x
DLBCL90 probes	NanoString	various	Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay
d-Limonene	VWR	89376-092
Forceps	Various	x
Glass micrscope slides	FisherBrand	12-550-15
Glycerol	VWR	0854-1L
Master kits	NanoString	various
Microtome	Leica	RM2265
Microtubes	Ambion	AM12400
NanoDrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W	Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation
nCounter	NanoString	x	Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay
Permanent marker	Electrib Microscope Sciences	72109-12
Razor blade dispenser	Electrib Microscope Sciences	71985-10
Razor blades	Electrib Microscope Sciences	71985-23
Tissue digestion buffer	Qiagen	80234
Ultrapure water	VWR	SH30538.02
Waterbath	Triangle Biomedical Sciences	TFB-120
Wooden stick	FisherBrand	22363158