使用埃及伊蚊的高分辨率熔融分析进行CRISPR/Cas9诱变后的Indel检测

摘要

本文详细介绍了快速鉴定CRISPR / Cas9诱导的内嵌的方案，以及使用高分辨率熔体分析选择蚊子 埃及伊蚊 中的突变系。

摘要

随着转录激活子样效应核酸酶（TALENs）、锌指核酸酶（ZFNs）和归巢内切酶（HEEs）等系统的建立，蚊子基因编辑已成为几个实验室的常规。最近，簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）技术为精密基因组工程提供了一种更简单，更便宜的替代方案。在核酸酶作用之后，DNA修复途径将修复断裂的DNA末端，通常会引入插入。然后，这些框架外突变用于理解靶生物体中的基因功能。然而，一个缺点是突变个体没有显性标记，这使得突变等位基因的鉴定和跟踪具有挑战性，特别是在许多实验所需的尺度上。

高分辨率熔体分析（HRMA）是鉴定核酸序列变异的简单方法，并利用PCR熔融曲线来检测此类变异。这种后PCR分析方法使用荧光双链DNA结合染料，其仪器具有温度斜坡控制数据捕获功能，并且易于缩放为96孔板格式。这里描述的是一个简单的工作流程，使用HRMA快速检测CRISPR / Cas9诱导的indels并在蚊子 Ae.埃及伊蚊中建立突变系。至关重要的是，所有步骤都可以用少量的腿部组织进行，并且不需要牺牲生物体，从而允许在基因分型后进行遗传杂交或表型测定。

引言

作为登革热¹、寨卡²和基孔肯雅热³ 等病原体的载体，以及疟疾寄生虫⁴，蚊子对人类构成重大的公共卫生威胁。对于所有这些疾病，传播干预的重点是控制蚊媒。研究在病原体的允许性，蚊子适应性，存活率，繁殖和对杀虫剂的抵抗力等方面的重要基因是制定新的蚊子控制策略的关键。出于这些目的，蚊子的基因组编辑正在成为一种普遍的做法，特别是随着诸如HE，ZFN，TALENs以及最近带有Cas9的CRISPR等技术的发展。基因编辑菌株的建立通常涉及携带所需突变的个体在几代人内回交，以尽量减少脱靶和创始人（瓶颈）效应，然后交叉杂合子个体以产生纯合子或跨杂合子系。在没有显性标记的情况下，分子基因分型在这个过程中是必要的，因为在许多情况下，不能检测到杂合突变体的明确表型性状。

虽然测序是基因型表征的黄金标准，但在数百或数千个个体中进行测序会产生获得结果所需的大量成本，劳动力和时间，这对于蚊子等寿命较短的生物体尤其重要。常用的替代方法包括 Surveyor 核酸酶测定^法5 （SNA）、T7E1 测定^法6 和高分辨率熔融分析（HRMA，已于 ⁷ 中回顾）。SNA和T7E1都使用切除不匹配碱基的内切酶。当杂合突变基因组的突变区域被扩增时，来自突变体和野生型等位基因的DNA片段被退火以产生不匹配的双链DNA（dsDNA）。SNA通过酶切特异性内切酶和简单的琼脂糖凝胶电泳检测是否存在错配。或者，HRMA使用由dsDNA结合荧光染料检测的dsDNA的热力学特性，染料的解离温度根据突变的存在和类型而变化。HRMA已被用于检测单核苷酸多态性（SNPs）⁸，斑马鱼的突变基因分型⁹，微生物应用¹⁰和植物遗传研究¹¹等。

本文介绍了HRMA，这是一种由CRISPR/ Cas9技术产生的突变蚊子进行分子基因分型的简单方法。与替代技术相比，HRMA的优势包括1）灵活性，因为它已被证明对各种基因有用，广泛的凹槽大小，以及不同凹槽大小与杂合子，纯合子和跨杂合子分化之间的区别^12，13，14，2）成本，因为它基于常用的PCR试剂，以及3）节省时间， 因为它可以在短短几个小时内完成。此外，该协议使用一个小的身体部位（腿）作为DNA的来源，允许蚊子在基因分型过程中存活下来，允许建立和维持突变系。

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研究方案

1. 单核苷酸多态性（SNP）、HRMA引物设计和引物验证

1. 野生型实验室群落蚊子的SNP鉴定
   1. 选择目标外显子以破坏适当的多肽翻译。
      注意:靶标应靠近起始密码子或蛋白质功能所需的关键残基。外显子越短（例如，≤200碱基），靶向和分析就越困难。避免在靠近外显子边界的地方进行编辑，因为这会迫使其中一个HRMA引物穿过内含子或进入内含子。这是不可取的，因为这些地区的SNP率往往要高得多。
   2. 底漆设计
      1. 转到NCBI Blast - Primer Blast网站¹⁵，将所选 的外显子 复制并粘贴到页面顶部的框中，|选择 PCR产物尺寸 （确保它包含大部分外显子）|选择 生物体。
      2. 单击 "高级参数|选择 （对于 PCR 产品 Tm）并添加 60 （最佳温度为 60 °C） |获取 引物。将其他参数保留为默认值。
   3. 从野生型实验室菌落中获取基因组DNA（gDNA）。留出10只蚊子，用_CO2麻醉它们，然后将它们放在冰上的培养皿中，使它们保持不活动状态。设置10个管，其中包含0.5μL用于从组织中释放DNA的试剂和20μL稀释缓冲液，两者都在 材料表中建议的DNA释放试剂盒中提供。
   4. 使用镊子从一只蚊子身上取出一条腿，并将其放入DNA释放试剂稀释溶液的相应管中（从步骤1.1.3开始），将腿完全浸没在溶液中。对剩余的蚊子重复此步骤，用70%乙醇擦拭镊子，然后再进行下一个。
   5. 将含腿的溶液在室温下孵育2-5分钟，然后在98°C下孵育2分钟，并在建立PCR反应时使其冷却。
      注意:含有释放的gDNA的板可以储存在-20°C，并且方案可以在此时暂停。
   6. 准备10个包含10μL2x PCR预混液的试管，引物至0.5μM最终浓度，分子级水至最终体积为20μL，并将1μL稀释的样品转移到每个试管中。按照以下循环参数进行PCR:98°C 5分钟，40次循环98°C持续5秒，60°C 30秒，72°C每kb20秒;最终延伸72°C1分钟。
   7. 用酶纯化PCR产物，以降解残留的PCR引物，并对过量的dNTP或任何柱净化试剂盒进行去磷酸化。继续对样品进行测序。
   8. 分析每个电泳图是否存在双峰/模糊碱基，并使用适当的退化基码在每个序列中手动调整基数调用。
      注意:此步骤必须在多序列比对之前执行，因为碱基调用软件通常会选择更突出的峰值作为"真"碱基调用，从而给人一种没有SNP的错误印象。
   9. 使用材料表中列出的比对软件SeqMan Pro或其他开源比对软件（如ClustalW16或T-Coffee17）执行多序列比对。
      1. 打开对齐软件|单击 "添加序列 |选择所需的序列，然后单击 "添加 |选择所有序列后，单击" 完成"。
      2. 单击" 组装 "以执行对齐。要打开对齐，请单击 Contig 1 并分析对齐并识别 SNP（图 1）。
         注:作为步骤1.1.3-1.1.6的替代方法，PCR可以从从散装样品（来自>10个体）获得的分离基因组DNA中进行。测序扩增子可以直接分析是否存在在电泳图中表现为双峰的SNP，尽管罕见的SNP将更难检测。
   10. 按照¹⁸中描述的方案设计3-5个单向导RNA（sgRNA），避免含有上述任何SNP的区域。
2. 热塑性预处理底漆设计
   1. 使用^mFold19测试外显子序列，以确定在PCR过程中可能形成的二级结构。
      1. 转到 UNAFold Web Server |点击 mFold |在下拉菜单中，单击 "应用程序 | DNA折叠形式。
      2. 在框中输入 序列名称 并粘贴 外显子。
      3. 将折叠温度改为 60°C;在 离子条件下，将[Mg ⁺⁺]更改为 1.5 ，在单位上切换到 mM;点击 折叠DNA。
      4. 在 输出上，在 结构 1 下方，单击 pdf 以打开圆形结构图。
   2. 转到 NCBI 喷砂 - 底漆 ^Blast15 了解底漆设计。
   3. 将步骤 1.1 中通过测序确定的选定外显子序列（包含最少数量的 SNP 或无 SNP 的序列）复制并粘贴到页面顶部的框中。
   4. 使用 符号< > 标记和排除包含 SNP、目标位点和可能形成二级结构的区域的序列。
   5. 选择 PCR产物大小 在80和150 bp之间，然后选择 生物体。
      注意:可以成功使用较大的片段大小（~300 bp）。然而，较长的扩增子可能会降低在一个或几个碱基对中不同的序列之间的灵敏度。
   6. 点击 获取入门书。选择2-3对引物进行测试（理想情况下，引物位点距离任何CRISPR靶点≥20-50 bp）。
3. 入门验证
   1. 使用单个个体的 gDNA 进行梯度 PCR。
      1. 准备预混液，并在单独的试管中除去一个用于非模板对照（NTC）的样品。将模板添加到剩余的预混液中，并等分到96孔板中。
      2. 遵循循环参数:98 °C 30 s，98 °C 的 34 次循环 10 s，55–65 °C 30 s，72 °C 15 s;最终延伸72°C10分钟。
      3. 根据以下参数生成热熔体曲线:变性步骤 95 °C 持续 1 分钟，在 60 °C 退火 1 分钟，在 75 °C 和 95 °C 之间以 0.2 °C 为增量检测熔体曲线，每个温度的保持时间为 10 s。
         注:应仅使用具有单个热熔体曲线的退火温度。
4. 继续通过胚胎注射产生突变系，如¹²中所述。

2. 从蚊子腿上制备基因组DNA

1. 在蛹阶段按性别将_G1 蚊子分开，以便它们在基因分型之前不会交配，并确保年龄匹配的野生型控制蚊子可用于参考和回交。同样地将他们分开。
2. 收集所需的材料（图2A），并准备一个96孔PCR板，其中0.5μLDNA释放试剂和20μL稀释缓冲液（来自gDNA释放试剂盒）每个人进行基因分型（图2B）并将其留在冰上。为NTC保留两种反应。
3. 标记蚊子小瓶（果蝇 小瓶）的托盘，以便96板上的每个孔对应于托盘中相应的蚊子小瓶。
4. 用_CO2麻醉_G1蚊子，并将它们放在玻璃培养皿中以保持镇静（图2C，D）。麻醉并将8只野生型蚊子放入第二个培养皿中。
5. 用70%乙醇擦拭一对镊子，并取出蚊子的后腿之一（图2E，F）。
6. 将腿浸没在DNA释放试剂溶液中，将蚊子放入相应的小瓶中，然后用海绵将其关闭（图2G，H）。
7. 用70%乙醇再次擦拭镊子，然后继续从下一只蚊子身上取下腿。重复步骤2.5-2.7，直到96孔板完成。
   注意:用70%乙醇擦拭镊子很重要。这最大限度地减少了DNA交叉污染。
8. 用光学PCR板密封板密封板（图2I），并在室温（RT）下孵育含有腿的96孔板2-5分钟，然后在98°C下孵育2分钟。在制备PCR混合物时，让板冷却至室温。
   注意:整个过程通常需要3-4小时。如果蚊子必须在小瓶中保存超过预期持续时间（特别是≥1天），请与每只蚊子一起放置一小块葡萄干（或糖和水的来源），以确保蚊子在长时间的孵化期间存活。

3. 人力资源管理

1. 进行 PCR 检测。
   1. 为每个反应制备含有以下组分的预混液:10μL2x缓冲液（来自gDNA释放试剂盒），0.5μM每个引物，1μLEvaGreen染料，0.4μL聚合酶（来自gDNA释放试剂盒），并用分子级水完成至19μL。
   2. 使用多通道移液器，将19μL预混液转移到每个孔中。将1μL含有第2部分中制备的蚊子DNA的DNA释放溶液转移到板中（图3A）。用光学PCR板密封板密封板。
   3. 按照循环参数进行PCR:98°C持续5分钟，39次循环98°C持续10秒，所选退火温度（72°C）30秒;最终延伸72°C2分钟。
2. 根据以下参数生成热熔体曲线:变性步骤 95 °C 持续 1 分钟，在 60 °C 退火 1 分钟，在 75 °C 和 95 °C 之间以 0.2 °C 为增量检测熔体曲线，每个温度的保持时间为 10 s。请参阅 补充材料 和 补充图S1-S5 ，详细了解使用CFX96实时系统运行HRMA的软件设置。
3. 检查熔体曲线（图3B）。将 wild 类型控件分配给引用分类。
   注:软件（参见 材料表）会自动规范化数据，并为不同的熔体曲线指定带有颜色的聚类。
4. 在96孔模板上用相应的颜色标记不同的聚类（图3C）。
5. 选择具有感兴趣曲线的个体，将其从管中取出，然后回溯（图3D）。给交配的雌性喂血并收集_G2 卵。

4. 通过桑格测序进行序列验证

1. 使用酶从孔中用选定的蚊子（从3.1节中制备的板）纯化PCR产物，使用酶降解残留的PCR引物，并对过量的dNTPs进行去磷酸化。或者，使用任何色谱柱净化试剂盒并继续对样品进行测序。
   注意:当 PCR 产物尺寸较小 （≤200 bp） 时，直接测序可能更具挑战性。在这种情况下，设计引物以扩增包含靶位点的较大片段（≥250 bp），并使用96孔板中的DNA通过PCR扩增（步骤2.2）。
2. 使用跟踪查看器软件分析和识别内嵌（图 4）。或者，Poly Peak Parser ^software20 可以帮助检测杂合个体的突变。
   1. 转到 Poly Peak 解析器网站，从" 浏览 "菜单上的突变个体中选择序列，然后将参考序列复制并粘贴到框中。
      注意:交替等位基因和参考之间的对齐将自动显示在屏幕的右侧。

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结果

使用CRISPR / Cas9技术获得含有 AaeZIP11 （推定的铁转运蛋白²¹）和 myo-fem （与飞行肌肉相关的女性偏倚肌球蛋白基因¹³）突变的蚊子，使用HRMA进行基因分型，并进行序列验证（图5）。 图5A 和 图5C 分别显示了 AeEZIP11 和 肌-fem 突变样品的HRM曲线以及野生型对照的归一化荧?...

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讨论

高分辨率熔融分析为鉴定CRISPR/Cas9技术在载体蚊子 埃及伊蚊中产生的内含物提供了一种简单快速的解决方案。它提供了灵活性，使蚊子的基因分型能够突变，从飞行肌肉到铁代谢等多种基因^13，14。从样品采集到最终分析，HRMA可以在几个小时内完成。引物设计需要额外的时间，并且还取决于接收任何所需测序结果（用于鉴定SNP）、序列分析和引物...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol			70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates	VWR	82006-636	For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates			House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96	Bio Rad		PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs	VWR	490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit	New England Biolabs	E1050S
Glass Petri Dish	VWR	89001-246	150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates	Bio-rad	HSP9665	For HRMA
Multi-channel pipettor (P10)	Integra Biosciences	4721
Multi-channel pipettor (P300)	Integra Biosciences	4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific	VWR	37000-548	To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape	Bio-rad	2239444	To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools)	Thermo Fisher	F140WH	For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers	Genesee	59-128W
Precision Melt Analysis Software	Bio Rad	1845025	Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro	DNAstar Lasergene software		For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor	Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm	WPI	14098
White foam plugs	VWR	60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee	32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue	Genesee	59-164B