Detecção indel seguindo CRISPR/Cas9 Mutagenesis usando análise de derretimento de alta resolução no mosquito Aedes aegypti

Resumo

Este artigo detalha um protocolo para identificação rápida de indels induzidos pelo CRISPR/Cas9 e seleção de linhas mutantes no mosquito Aedes aegypti utilizando análise de derretimento de alta resolução.

Resumo

A edição de genes de mosquitos tornou-se rotina em vários laboratórios com o estabelecimento de sistemas como nucleases efeitos (TALENs) de ativação de transcrição, núcleos de dedo de zinco (ZFNs) e endonucleases (HEs). Mais recentemente, a tecnologia de repetições palindômicas curtas interespaçadas regularmente (CRISPR)/CRISPR(Cas9) ofereceu uma alternativa mais fácil e barata para a engenharia de genomas de precisão. Após a ação nuclease, as vias de reparação de DNA consertarão as extremidades de DNA quebradas, muitas vezes introduzindo indels. Essas mutações fora do quadro são então usadas para entender a função genética nos organismos alvo. Uma desvantagem, no entanto, é que indivíduos mutantes não carregam nenhum marcador dominante, tornando a identificação e o rastreamento de alelos mutantes desafiadores, especialmente em escalas necessárias para muitos experimentos.

A análise de derretimento de alta resolução (HRMA) é um método simples para identificar variações nas sequências de ácido nucleico e utiliza curvas de fusão pcr para detectar tais variações. Este método de análise pós-PCR usa corantes fluorescentes de ligação de DNA de dupla fita com instrumentação que tem capacidade de captura de dados de controle de rampa de temperatura e é facilmente dimensionado para formatos de placas de 96 poços. Descrito aqui é um simples fluxo de trabalho utilizando o HRMA para a detecção rápida de indeles induzidos pelo CRISPR/Cas9 e o estabelecimento de linhas mutantes no mosquito Ae. aegypti. Criticamente, todas as etapas podem ser realizadas com uma pequena quantidade de tecido da perna e não requerem o sacrifício do organismo, permitindo que cruzes genéticas ou ensaios de fenotipagem sejam realizados após a genotipagem.

Introdução

Como vetores de patógenos como os vírus da ^dengue1, ^zika2 e ^chikungunya3, bem como parasitas maláricos4, os mosquitos representam uma ameaça significativa à saúde pública para os seres humanos. Para todas essas doenças, há um foco substancial de intervenção de transmissão no controle de mosquitos vetores. O estudo dos genes importantes, por exemplo, na permissividade aos patógenos, na aptidão dos mosquitos, na sobrevivência, na reprodução e na resistência aos inseticidas é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias de controle de mosquitos. Para tais efeitos, a edição de genomas em mosquitos está se tornando uma prática comum, especialmente com o desenvolvimento de tecnologias como HEs, ZFNs, TALENs e, mais recentemente, CRISPR com Cas9. O estabelecimento de cepas editadas por genes normalmente envolve o backcrossing de indivíduos que carregam as mutações desejadas por algumas gerações para minimizar efeitos fora do alvo e fundador (gargalo), seguido pela travessia de indivíduos heterozigosos para gerar linhas homozigosas ou trans-heterozigosas. Na ausência de um marcador dominante, a genotipagem molecular é necessária nesse processo porque, em muitos casos, não podem ser detectados traços fenotípicos claros para mutantes heterozigosos.

Embora o sequenciamento seja o padrão-ouro para a caracterização genotipípica, realizar isso em centenas, ou possivelmente milhares de indivíduos, representa custos significativos, mão-de-obra e tempo necessários para obter resultados, o que é especialmente crítico para organismos com vida útil curta, como mosquitos. Alternativas comumente utilizadas são Surveyor nuclease ^assay5 (SNA^{), ensaio} T7E1 e análise de derretimento de alta resolução (HRMA, revisado ⁱⁿ⁷). Tanto o SNA quanto o T7E1 usam endonucleases que apenas se descompatem bases incompatíveis. Quando uma região mutante mutante mutada do genoma mutante heterozigoso é amplificada, fragmentos de DNA de alelos mutantes e do tipo selvagem são enais para fazer DNA de dupla cadeia incompatível (dsDNA). A SNA detecta a presença de incompatibilidades via digestão com uma endonuclease específica de incompatibilidade e eletroforese de gel de agarose simples. Alternativamente, o HRMA utiliza as propriedades termodinâmicas do dsDNA detectadas por corantes fluorescentes de ligação dsDNA, com a temperatura de dissociação do corante variando com base na presença e tipo de mutação. O HRMA tem sido utilizado para a detecção de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs)⁸, genotipagem mutante de peixe-zebra9, aplicações microbiológicas10 e pesquisa genética ^vegetal11, entre outros.

Este artigo descreve o HRMA, um método simples de genotipagem molecular para mosquitos mutantes gerado pela tecnologia CRISPR/Cas9. As vantagens do HRMA sobre técnicas alternativas incluem 1) flexibilidade, pois tem sido comprovadamente útil para vários genes, uma ampla gama de tamanhos indel, bem como a distinção entre diferentes tamanhos indel e heterozigous, homozygous e trans-heterozygous diferenciação12,13,14, 2) custo, pois é baseado em reagentes PCR comumente usados, e 3) economia de tempo, como pode ser realizado em apenas algumas horas. Além disso, o protocolo utiliza uma pequena parte do corpo (uma perna) como fonte de DNA, permitindo que o mosquito sobreviva ao processo de genotipagem, permitindo o estabelecimento e manutenção de linhas mutantes.

Protocolo

1. Digitalização para polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs), projeto de primer HRMA e validação do primer

1. Identificação do SNP em mosquitos de colônia de laboratório silvestre
   1. Selecione o exon de destino para interromper a tradução adequada do polipeptídeo.
      NOTA: O alvo deve estar próximo do códon inicial ou entre os principais resíduos necessários para a função proteica. Quanto menor o exon (por exemplo, ≤200 bases), mais difícil é mirar e analisar. Evite editar perto dos limites de um exon, pois isso força um dos primers do HRMA a atravessar um intron ou estar em um intron. Isso é indesejável porque as taxas de SNP tendem a ser muito maiores nessas regiões.
   2. Design primer
      1. Vá para o site NCBI Blast - Primer ^Blast15, copie e cole o exon escolhido na caixa no topo da página | escolher o tamanho do produto PCR (certifique-se de que engloba a maior parte do exon) | escolher o organismo.
      2. Clique em Parâmetros Avançados | Opte (por PCR Product Tm) e adicione 60 (para uma temperatura ótima de 60 °C) | Pegue primers. Mantenha os outros parâmetros como padrão.
   3. Obtenha DNA genômico (gDNA) da colônia de laboratório silvestre. Reserve 10 mosquitos, anestesia-os com _CO2, e coloque-os em uma placa de Petri no gelo para mantê-los inativos. Configure 10 tubos contendo 0,5 μL do reagente para liberação de DNA do tecido e 20 μL de tampão de diluição, ambos fornecidos no kit de liberação de DNA sugerido na Tabela de Materiais.
   4. Remova uma perna de um único mosquito usando fórceps e coloque-a em um tubo correspondente de uma solução diluída do reagente de liberação de DNA (a partir da etapa 1.1.3), submergindo completamente a perna na solução. Repita esta etapa com os mosquitos restantes, limpando os fórceps com 70% de etanol antes de prosseguir para o próximo.
   5. Incubar a solução contendo perna à temperatura ambiente por 2-5 min, depois a 98 °C por 2 min, e deixe esfriar durante a configuração da reação do PCR.
      NOTA: As placas contendo o gDNA liberado podem ser armazenadas a -20 °C, e o protocolo pode ser pausado neste momento.
   6. Prepare 10 tubos contendo 10 μL de 2x PCR Master Mix, primers para uma concentração final de 0,5 μM e água de grau molecular para um volume final de 20 μL, e transfira 1 μL da amostra diluída para cada tubo. Executar PCR seguindo estes parâmetros de ciclismo: 98 °C 5 min, 40 ciclos de 98 °C para 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s por kb; prorrogação final de 72 °C para 1 min.
   7. Purifique os produtos PCR com uma enzima para degradar os primers PCs residuais e desfosforilar o excesso de dNTPs ou qualquer kit de limpeza de coluna. Continue sequenciando as amostras.
   8. Analise cada eletroferograma para a presença de picos duplos/bases ambíguas e ajuste as chamadas base manualmente em cada sequência usando o código base degenerado apropriado.
      NOTA: Esta etapa deve ser executada antes do alinhamento de sequência múltipla, pois é comum que o software de chamada base selecione o pico mais proeminente como a chamada base "verdadeira", dando a falsa impressão de uma ausência de SNPs.
   9. Execute um alinhamento de sequência múltipla usando o software de alinhamento, SeqMan Pro, listado na Tabela de Materiais ou outro software de alinhamento de código aberto, como ClustalW16 ou T-Coffee17.
      1. Abra o software de alinhamento | clique em Adicionar sequências | selecione as sequências desejadas e clique em Adicionar | uma vez que todas as sequências são escolhidas, clique em Done.
      2. Clique em Montar para executar o alinhamento. Para abrir o alinhamento, clique em Contig 1 e analise o alinhamento e identifique os SNPs (Figura 1).
         NOTA: Como alternativa às etapas 1.1.3-1.1.6, o PCR pode ser realizado a partir de DNA genômico isolado obtido a partir de amostras a granel (derivadas de indivíduos >10). Amplicons sequenciados podem ser analisados diretamente para a presença de SNPs que aparecem como picos duplos no eletroferograma, embora SNPs raros sejam mais difíceis de detectar.
   10. Projeto 3-5 rnas de guia único (sgRNAs), evitando regiões contendo qualquer SNP identificado acima, seguindo o protocolo descrito em ¹⁸.
2. Design de primer HRMA
   1. Teste a sequência de exon para a possível formação de estruturas secundárias durante a PCR usando ^mFold19.
      1. Vá para o | do Servidor Web do UNAFold clique em mFold | no menu suspenso, clique em Aplicativos | Forma dobrável de DNA.
      2. Digite o nome da sequência na caixa e cole o exon.
      3. Alterar a temperatura dobrável para 60 °C; nas condições Iônicas, alterar [Mg⁺⁺] para 1,5 e mudar unidades para mM; clique no DNA do Fold.
      4. Em Saída, abaixo Estrutura 1, clique em pdf para abrir os Lotes de Estrutura Circular.
   2. Vá para NCBI Blast - Primer ^Blast15 para design primer.
   3. Copie e cole a sequência de exon selecionada determinada pelo sequenciamento na etapa 1.1 (a sequência que contém o menor número de SNPs ou nenhum SNPs) na caixa na parte superior da página.
   4. Use o símbolo < > para marcar e excluir sequências que contenham SNPs, o local de destino e regiões com possível formação de estrutura secundária.
   5. Selecione o tamanho do produto PCR entre 80 e 150 bp e escolha o organismo.
      NOTA: Tamanhos de fragmentos maiores podem ser usados com sucesso (~300 bp). No entanto, amplicons mais longos podem diminuir a sensibilidade entre sequências diferentes em um ou apenas alguns pares de base.
   6. Clique em Obter Primers. Selecione 2-3 pares de primers a serem testados (idealmente, os sites primer estão ≥20-50 bp de qualquer local alvo CRISPR).
3. Validação do primer
   1. Execute um PCR gradiente usando gDNA de um único indivíduo.
      1. Prepare uma mistura mestre e remova uma amostra para o controle não-modelo (NTC) em um tubo separado. Adicione o modelo à mistura principal restante e aliquot em uma placa de 96 poços.
      2. Siga os parâmetros de ciclismo: 98 °C 30 s, 34 ciclos de 98 °C para 10 s, 55-65 °C 30 s, 72 °C 15 s; prorrogação final de 72 °C para 10 min.
      3. Gerar perfis de derretimento térmico seguindo os parâmetros: etapa de desinaturação 95 °C por 1 min, ressarem 60 °C por 1 min, detecção de curva de derretimento entre 75 °C e 95 °C em incrementos de 0,2 °C, com tempo de espera de 10 s a cada temperatura.
         NOTA: Apenas temperaturas de resaramento com um único perfil de derretimento térmico devem ser usadas.
4. Prossiga para gerar as linhas mutantes com injeções de embriões como descrito em ¹².

2. Preparação de DNA genômico a partir de pernas de mosquito

1. Separe os mosquitos _G1 por sexo na fase pupal para que eles não acasalem antes da genotipagem, e certifique-se de que mosquitos de controle do tipo selvagem e combinados com a idade estarão disponíveis para serem usados para referências e backcrosses. Sexo-separá-los da mesma forma.
2. Reúna os materiais necessários (Figura 2A) e prepare uma placa PCR de 96 poços com 0,5 μL do reagente de liberação de DNA e 20 μL de tampão de diluição (do kit de liberação gDNA) por indivíduo para ser genótipado (Figura 2B) e deixe-o no gelo. Reserve duas reações para ntc.
3. Rotule uma bandeja para frascos de mosquito (frascos de Drosophila ) para que cada poço na placa de 96 corresponde ao respectivo frasco de mosquito na bandeja.
4. Anestesiar os mosquitos _G1 com _CO2 e colocá-los em uma placa de vidro petri para mantê-los sedados (Figura 2C,D). Anestesiar e colocar 8 mosquitos selvagens em uma segunda placa de Petri.
5. Limpe um par de pinças com 70% de etanol e remova uma das pernas traseiras do mosquito (Figura 2E,F).
6. Submergir a perna na solução de reagente de liberação de DNA, colocar o mosquito no frasco correspondente e fechá-lo com uma esponja (Figura 2G,H).
7. Limpe as pinças novamente com 70% de etanol e proceda com a remoção da perna do próximo mosquito. Repita as etapas 2.5-2.7 até que a placa de 96 poços esteja concluída.
   NOTA: É importante limpar a pinça com 70% de etanol. Isso minimiza a contaminação cruzada do DNA.
8. Sele a placa com uma vedação óptica de placa PCR (Figura 2I) e incubar a placa de 96 poços contendo as pernas em temperatura ambiente (RT) por 2-5 min e depois a 98 °C por 2 min. Deixe a placa esfriar para RT durante o preparo da mistura PCR.
   NOTA: Todo o processo normalmente leva de 3 a 4 horas. Se os mosquitos devem ser mantidos nos frascos por mais tempo do que a duração esperada (especialmente ≥1 dia), coloque um pequeno pedaço de passa (ou fonte de açúcar e água) com cada mosquito para garantir a sobrevivência dos mosquitos durante incubações prolongadas.

3. HRMA

1. Executar PCR.
   1. Prepare uma mistura mestre contendo os seguintes componentes por cada reação: 10 μL de tampão de 2x (do kit de liberação gDNA), 0,5 μM de cada primer, 1 μL de corante EvaGreen, 0,4 μL de polimerase (do kit de liberação gDNA) e completo a 19 μL com água de grau molecular.
   2. Usando um pipet multicanal, transfira 19 μL da mistura mestre em cada poço. Transferir 1 μL da solução de liberação de DNA contendo DNA de mosquito preparado na seção 2 para a placa (Figura 3A). Sele a placa com uma vedação óptica de placa PCR.
   3. Realize o PCR seguindo os parâmetros de ciclismo: 98 °C para 5 min, 39 ciclos de 98 °C para 10 s, a temperatura de ressarcial escolhida (72 °C) para 30 s; prorrogação final 72 °C por 2 min.
2. Gerar perfis de derretimento térmico seguindo os parâmetros: etapa de desinaturação 95 °C por 1 min, ressarem 60 °C por 1 min, detecção de curva de derretimento entre 75 °C e 95 °C em incrementos de 0,2 °C, com tempo de espera de 10 s a cada temperatura. Consulte o Material Suplementar e a Figura Suplementar S1-S5 para obter uma descrição detalhada da configuração do software para execução do HRMA usando o sistema cfx96 em tempo real.
3. Examine os perfis de derretimento (Figura 3B). Atribua controle de tipo selvagem ao cluster de referência.
   NOTA: O software (ver a Tabela de Materiais) normaliza automaticamente os dados e designa clusters com cores para diferentes curvas de fusão.
4. Marque os diferentes clusters com cores correspondentes no modelo de 96 poços (Figura 3C).
5. Selecione os indivíduos com curvas de interesse, remova-os dos tubos e backcross (Figura 3D). Alimentam as fêmeas acasaladas e coletam ovos _G2 .

4. Verificação de sequência por sequenciamento Sanger

1. Purifique o produto PCR dos poços com mosquitos selecionados (a partir da placa preparada na seção 3.1), utilizando uma enzima para degradar os primers de PCR residuais e desfosforilarar o excesso de dNTPs. Alternativamente, use qualquer kit de limpeza de coluna e proceda com o sequenciamento das amostras.
   NOTA: O sequenciamento direto pode ser mais desafiador quando o tamanho do produto PCR é pequeno (≤200 bp). Nesses casos, projete primers para amplificar fragmentos maiores que englobam o local alvo (≥250 bp) e amplificar por PCR usando o DNA na placa de 96 poços (etapa 2.2).
2. Analisar e identificar os indels usando o software de visualização de rastreamento (Figura 4). Alternativamente, o software Poly Peak ^Parser20 pode ajudar a detectar a mutação em indivíduos heterozigosos.
   1. Acesse o site do Poly Peak Parser, selecione a sequência dos indivíduos mutantes no menu Procurar e copie e cole a sequência de referência na caixa.
      NOTA: O alinhamento entre o alelo alternativo e a referência aparecerá automaticamente no lado direito da tela.

Resultados

Mosquitos contendo mutações nos genes AaeZIP11 (transporte de ferro putativo21) e mio-fem (gene de miosina tendenciosa da fêmea relacionado aos músculos ^{de voo13}) foram obtidos utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9, genótipo usando HRMA e sequência verificada (Figura 5). As amostras mutantes Figura 5A e Figura 5C mostram a intensidade de fluorescência normalizada...

Discussão

A análise de derretimento de alta resolução oferece uma solução simples e rápida para a identificação de indels gerados pela tecnologia CRISPR/Cas9 no mosquito vetor Ae. aegypti. Ele fornece flexibilidade, permitindo a genotipagem de mosquitos mutados para uma ampla gama de genes, desde o músculo de voo até o metabolismo do ferro e mais ^13,14. O HRMA pode ser realizado em apenas algumas horas, desde a coleta de amostras até as análises finais...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol			70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates	VWR	82006-636	For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates			House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96	Bio Rad		PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs	VWR	490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit	New England Biolabs	E1050S
Glass Petri Dish	VWR	89001-246	150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates	Bio-rad	HSP9665	For HRMA
Multi-channel pipettor (P10)	Integra Biosciences	4721
Multi-channel pipettor (P300)	Integra Biosciences	4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific	VWR	37000-548	To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape	Bio-rad	2239444	To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools)	Thermo Fisher	F140WH	For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers	Genesee	59-128W
Precision Melt Analysis Software	Bio Rad	1845025	Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro	DNAstar Lasergene software		For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor	Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm	WPI	14098
White foam plugs	VWR	60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee	32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue	Genesee	59-164B