모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출

요약

이 문서에서는 CRISPR/Cas9에 의해 유도된 인델의 신속한 식별을 위한 프로토콜과 고해상도 용융 분석을 사용하여 모기 Aedes aegypti 의 돌연변이 라인을 선택하는 것에 대해 자세히 설명합니다.

초록

모기 유전자 편집은 전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제(ZFNs), 호밍 엔토뉴리스(HEs)와 같은 시스템을 구축하여 여러 실험실에서 일상화되고 있다. 최근에는 정기적으로 간격이 있는 짧은 palindromic 반복(CRISPR)/CRISPR 관련 단백질 9(Cas9) 기술이 정밀 게놈 엔지니어링을 위한 보다 쉽고 저렴한 대안을 제시했습니다. 핵작용에 따라 DNA 수리 경로는 깨진 DNA 끝을 고치고 종종 인델을 도입합니다. 이러한 프레임 외 돌연변이는 표적 유기체에서 유전자 기능을 이해하는 데 사용됩니다. 그러나 단점은 돌연변이 개인이 지배적인 마커를 가지고 있지 않으며, 특히 많은 실험에 필요한 비늘에서 돌연변이 알을 식별하고 추적하는 데 어려움을 겪고 있다는 것입니다.

고해상도 용융 해석(HRMA)은 핵산 서열의 변이를 식별하고 PCR 용융 곡선을 활용하여 이러한 변이를 검출하는 간단한 방법입니다. 이 포스트 PCR 분석 방법은 온도 램프 제어 데이터 캡처 기능을 가지고 쉽게 96 웰 플레이트 형식으로 확장되는 계측과 형광 이중 좌초 DNA 결합 염료를 사용합니다. 여기에 설명된 CRISPR/Cas9 유도 인델의 신속한 검출과 모기 Ae. aegypti에 돌연변이 선의 확립을 위해 HRMA를 사용하는 간단한 워크플로우입니다. 비판적으로, 모든 단계는 다리 조직의 소량으로 수행 될 수 있으며 유전 성 후 수행 될 유전 십자가 또는 phenotyping 애술을 허용, 유기체를 희생 할 필요가 없습니다.

서문

뎅기열¹, ^Zika2 및 chikungunya3 바이러스와 같은 병원체의 벡터로, 말라리아 기생충⁴, 모기는 인간에게 중요한 공중 위생 위협을 나타냅니다. 이러한 모든 질병에 대 한, 모기 벡터의 제어에 전송 개입의 상당한 초점이 있다. 예를 들어 병원균, 모기 적합성, 생존, 번식 및 살충제에 대한 내성에 대한 관건성에서 중요한 유전자에 대한 연구는 새로운 모기 통제 전략을 개발하기위한 핵심입니다. 이러한 목적을 위해, 모기에 있는 게놈 편집은 특히 HEs, ZFN, TALENs와 같은 기술의 발달과 함께, 특히, Cas9를 가진 CRISPR와 같은 기술의 발달과 함께 일반적인 사례가 되고 있습니다. 유전자 편집균의 설립은 전형적으로 오프 표적 및 설립자 (병목 현상) 효력을 극소화하기 위하여 몇몇 세대에 대한 원하는 돌연변이를 운반하는 개별을 백교차하는 관련시킵니다, 동형질 또는 이테로지구우스 선을 생성하는 이종화구우스 개별을 교차하는 뒤에. 지배적 인 마커의 부재에서, 분자 지음은 많은 경우에, 이종화 척 돌연변이에 대한 명확한 현상 특성을 검출 할 수 없기 때문에이 과정에서 필요합니다.

시퀀싱은 지노티픽 특성화를 위한 금본위제이지만, 수백 명 또는 수천 명의 개인에게 이 것을 수행하는 것은 상당한 비용, 인건비 및 결과를 얻는 데 필요한 시간을 초래하며, 이는 모기와 같은 수명이 짧은 유기체에게 특히 중요합니다. 일반적으로 사용되는 대안은 측량체 뉴클레아제 분석⁵ (SNA), T7E1 ^분석6 및 고해상도 용융 분석 (HRMA^{, 검토 7})입니다. SNA와 T7E1은 모두 일치하지 않는 베이스만 갈라주는 엔도니슬리스를 사용합니다. 이종수 돌연변이 게놈의 돌연변이 부위가 증폭되면 돌연변이 및 야생 형 알레의 DNA 단편이 불일치된 이중 좌초 DNA(dsDNA)를 만들기 위해 어닐링됩니다. SNA는 불일치 별 엔도누리스와 간단한 아가로즈 젤 전기포고로 소화를 통해 불일치의 존재를 감지합니다. 대안적으로, HRMA는 dsDNA 결합 형광염료에 의해 검출된 dsDNA의 열역학적 특성을 사용하며, 염료의 분리 온도는 돌연변이의 존재 및 유형에 따라 변화한다. HRMA는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)⁸, 얼룩말 ^fish9, 미생물 응용 프로그램¹⁰ 및 식물 ^{유전 연구의 돌연변이} 유전화 등의 검출을 위해 사용되어 왔다.

이 논문은 CRISPR/Cas9 기술로 생성된 돌연변이 모기에 대한 분자 지노티핑의 간단한 방법인 HRMA를 설명합니다. 대체 기술에 대한 HRMA의 장점은 1) 유연성을 포함, 그것은 다양한 유전자에 유용 입증 된 바와 같이, 인델 크기의 넓은 범위뿐만 아니라 다른 인델 크기와 이질, 동형 구스, 및 트랜스 이테로지구스 분화 사이의 구별12,13,14, 2) 비용, 그것은 일반적으로 사용되는 PCR 에 기초하여, 3) 비용, 저장 그것은 단지 몇 시간 만에 수행 할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 작은 신체 부위(leg)를 DNA의 원천으로 사용하여 모기가 genotyping 공정에서 살아남을 수 있게 하여 돌연변이 선의 확립 및 유지를 허용합니다.

프로토콜

1. 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), HRMA 프라이머 설계 및 프라이머 검증을 위한 스캐닝

1. 야생 형 실험실 식민지 모기에서 SNP 식별
   1. 적절한 폴리펩티드 번역을 방해하기 위해 대상 엑온을 선택합니다.
      참고: 대상은 단백질 기능에 필요한 시작 코돈 또는 주요 잔류물 에 가깝습니다. 엑슨이 짧을수록(예: ≤200베이스) 대상이되고 분석하기가 더 어려워진다. 이 인사말 프라이머 중 하나가 인트론을 교차하거나 인트론에있을 강제로, 엑손의 경계에 가까운 편집을 피하십시오. SNP 비율이 해당 지역에서 훨씬 더 큰 경향이 있기 때문에 이것은 바람직하지 않습니다.
   2. 프라이머 디자인
      1. NCBI 블라스트로 이동 - 프라이머 블라스트 웹 사이트¹⁵, 복사 및 페이지 상단의 상자에 붙여 넣기 | PCR 제품 크기를 선택 (그것은 엑슨의 대부분을 포함 확인) | 유기체를 선택합니다.
      2. 고급 매개 변수| 클릭 옵트(PCR 제품 Tm용)를 선택하고 60(최적의 온도 60°C)을 추가| 프라이머를 가져옵니다. 다른 매개 변수를 기본값으로 유지합니다.
   3. 야생형 실험실 식민지로부터 게놈 DNA(gDNA)를 얻습니다. 모기 10마리를 따로 놓고 _CO2로 마취하고, 페트리 접시에 얼음 위에 놓아 비활성 상태를 유지합니다. 조직으로부터 DNA를 방출하기 위해 시약의 0.5 μL을 포함하는 10개의 튜브와 희석 버퍼의 20 μL을 설정 하여, 둘 다 재료표에 제안된 DNA 방출 키트에 제공됩니다.
   4. 집게를 사용하여 단일 모기에서 한 쪽 다리를 제거하고 DNA 방출 시약의 희석 된 용액의 해당 튜브에 배치 (단계 1.1.3에서), 완전히 용액에 다리를 침수. 나머지 모기와 함께이 단계를 반복, 다음 단계로 진행하기 전에 70 %에탄올로 집게를 닦아.
   5. 2-5 분 동안 실온에서 다리 함유 용액을 배양한 다음 98 °C에서 2 분 동안 배양하고 PCR 반응을 설정하는 동안 냉각 할 수 있습니다.
      참고: 방출된 gDNA를 포함하는 플레이트는 -20°C에 저장될 수 있으며, 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있다.
   6. 2x PCR 마스터 믹스10 μL을 포함하는 10개의 튜브, 0.5 μM 최종 농도로 프라이머, 분자 등급 의 물을 20 μL의 최종 부피로 준비하고 희석된 시료의 1 μL을 각 튜브로 이송한다. 이러한 사이클링 매개변수에 이어 PCR을 수행하십시오: 5s용 98°C의 40사이클, 60°C 30초, KB당 72°C 20s; 1 분 동안 72 °C의 최종 연장.
   7. 잔류 PCR 프라이머를 저하시키는 효소로 PCR 제품을 정화하고 과도한 dNTP 또는 모든 컬럼 정리 키트를 탈포합니다. 시료 를 시퀀싱하여 진행합니다.
   8. 이중 피크/모호한 베이스가 존재하기 위해 각 전자페로그램을 분석하고 적절한 퇴행성 기본 코드를 사용하여 각 시퀀스에서 베이스 호출을 수동으로 조정합니다.
      참고: 기본 호출 소프트웨어가 "true" 기본 호출로 더 눈에 띄는 피크를 선택하는 것이 일반적이기 때문에 이 단계는 여러 시퀀스 정렬 전에 수행해야 하며, 이는 SN의 부재에 대한 잘못된 인상을 줍니다.
   9. 정렬 소프트웨어인 SeqMan Pro를 사용하여 여러 시퀀스 정렬을 수행하며, 재료 표 또는 ClustalW16 또는 T-Coffee17과 같은 기타 오픈 소스 정렬 소프트웨어^{에 나열}됩니다.
      1. 정렬 소프트웨어 | 엽니다. 시퀀스 추가 | 클릭 원하는 시퀀스를 선택하고 | 추가 를 클릭합니다. 모든 시퀀스를 선택하면 완료를 클릭 합니다.
      2. 어셈블을 클릭하여 정렬을 수행합니다. 정렬을 열려면 Contig 1을 클릭하고 정렬을 분석하고 SN을 식별합니다(그림 1).
         참고: 1.1.3-1.1.6 단계의 대안으로, PCR은 대량 샘플에서 얻은 격리된 게놈 DNA로부터 수행될 수 있다(>10개인에게서 파생). 서열 앰플리톤은 전기페로그램에 이중 피크로 나타나는 SNP의 존재를 위해 직접 분석될 수 있지만, 희귀 한 SNP는 검출하기가 더 어려울 것이다.
   10. 설계 3-5 단일 가이드 RNA(sgRNA),위에서 식별된 SNP를 포함하는 영역을 피하여 ¹⁸에 기재된 프로토콜에 따라.
2. HRMA 프라이머 디자인
   1. ^mFold19를 사용하여 PCR 동안 이차 구조물의 가능한 형성을 위해 엑슨 서열을 테스트한다.
      1. UNAFold 웹 서버 | mFold | 클릭 드롭다운 메뉴에서 응용 프로그램 | 클릭 합니다. DNA 접이식 형태.
      2. 상자에 시퀀스 이름을 입력하고 엑슨을 붙여 넣습니다.
      3. 접이식 온도를 60°C로 변경; 이온 조건에서 [Mg⁺⁺]를 1.5 로 변경하고 단위는 mM으로 전환합니다. 접힌 DNA를 클릭합니다.
      4. 구조 1 아래출력에서 PDF를 클릭하여 원형 구조 플롯을 엽니다.
   2. 시공 설계를 위해 초보 블래스트15 - 시공블터¹⁵ 로 이동하십시오.
   3. 페이지 상단의 상자에 1.1 단계(가장 낮은 수의 SMP 또는 SMP가 없는 시퀀스)에서 시퀀싱하여 결정된 선택한 엑슨 시퀀스를 복사하여 붙여넣습니다.
   4. 기호 < > 사용하여 이차 구조의 가능한 형성이 가능한 SNP, 대상 사이트 및 영역을 포함하는 시퀀스를 표시하고 제외합니다.
   5. PCR 제품 크기를 80~150bp 사이로 선택하고 유기체를 선택한다.
      참고: 큰 조각 크기(~300bp)를 성공적으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 더 긴 앰플리콘은 하나 또는 단지 몇 개의 기본 쌍에서 다른 서열 사이 감도 감소시킬 수 있습니다.
   6. 프라이머 받기를 클릭합니다. 테스트할 프라이머 2-3쌍을 선택합니다(이상적으로는 프라이머 사이트는 CRISPR 대상 사이트에서 ≥20-50bp 떨어져 있음).
3. 프라이머 유효성 검사
   1. 단일 개인의 gDNA를 사용하여 그라데이션 PCR을 수행합니다.
      1. 마스터 믹스를 준비하고 별도의 튜브에서 비템플릿 제어(NTC)에 대한 샘플 1개를 제거합니다. 나머지 마스터 믹스에 템플릿을 추가하고 알리따트를 96웰 플레이트에 넣습니다.
      2. 사이클링 매개변수를 따르십시오: 98°C 30s, 10s용 98°C의 34사이클, 55-65°C 30s, 72°C 15s; 10 분 동안 72 °C의 최종 연장.
      3. 매개 변수에 따라 열 용융 프로파일을 생성 : 1 분 동안 95 °C, 1 분 동안 60 °C를 어닐링, 0.2 ° C 단위로 75 °C와 95 °C 사이의 용융 곡선 검출, 각 온도에서 10 s의 홀드 타임을 갖는다.
         참고: 열 용융 프로파일이 하나만 있는 온도만 사용해야 합니다.
4. 12년에 설명된 바와 같이 배아 주사를 가진 돌연변이 선을 생성하기 위하여 진행합니다.

2. 모기 다리에서 게놈 DNA의 준비

1. G1 모기를 pupal 단계에서 섹스로 분리하여 유전자 를 배우기 전에 짝짓지 않도록하고 연령일치의 야생 식 제어 모기가 참조 및 백크로스에 사용할 수 있는지 확인하십시오. 섹스도 마찬가지입니다.
2. 필요한 물질(도 2A)을 수집하고 DNA 방출 시약의 0.5 μL및 20 μL의 희석 버퍼(gDNA 방출 키트로부터)를 가진 96개의 잘 PCR 플레이트를 준비하여 유전자형(도 2B)을 유전자형(도 2B)으로 하여 얼음에 둡니다. NTC에 대한 두 가지 반응을 예약합니다.
3. 96 플레이트의 각 우물이 트레이에 있는 각 모기 유리병에 대응되도록 모기 병(Drosophila 바이알)에 대한 트레이에 라벨을 붙입니다.
4. G1 모기를 _CO2로 마취하고 유리 페트리 접시에 넣고 진정시유지합니다(그림 2C, D). 마취하고 두 번째 페트리 접시에 8 야생 형 모기를 배치합니다.
5. 70% 에탄올로 핀셋 을 닦고 모기 뒷다리 중 하나를 제거합니다(그림 2E, F).
6. DNA 방출 시약 용액에 다리를 잠그고, 해당 유리병에 모기를 배치하고, 스폰지로 닫습니다(도 2G, H).
7. 70%의 에탄올로 핀셋을 다시 닦고 다음 모기에서 다리를 제거합니다. 96웰 플레이트가 완성될 때까지 2.5-2.7 단계를 반복합니다.
   참고: 70%의 에탄올로 핀셋을 닦는 것이 중요합니다. 이것은 DNA 교차 오염을 최소화합니다.
8. 광학 PCR 플레이트 씰(도 2I)으로 플레이트를 밀봉하고 실온(RT)에서 다리를 함유한 96웰 플레이트를 2-5분 동안 배양한 다음 98°C에서 2분 동안 배양한다. PCR 믹스를 준비하는 동안 접시를 RT로 식힙니다.
   참고: 전체 프로세스는 일반적으로 3-4h가 소요됩니다. 모기가 예상 기간(특히 ≥1일)보다 더 많은 시간 동안 바이알에 보관되어야 하는 경우, 확장된 잠복기 동안 모기의 생존을 보장하기 위해 각 모기에 작은 건포도(또는 설탕과 물의 공급원)를 배치합니다.

3. HRMA

1. PCR을 수행합니다.
   1. 각 반응당 다음 성분을 포함하는 마스터 믹스를 준비: 2x 버퍼의 10 μL (gDNA 방출 키트에서), 각 프라이머의 0.5 μM, EvaGreen 염료의 1 μL, 폴리머 라제의 0.4 μL (gDNA 방출 키트에서), 분자 등급물로 19 μL로 완료.
   2. 멀티채널 파이펫을 사용하여 마스터 믹스의 19 μL을 각 우물로 옮킨다. 섹션 2에서 제조된 모기 DNA를 포함하는 DNA 방출 용액의 1 μL을 플레이트로 전송한다(도 3A). 광학 PCR 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉합니다.
   3. 사이클링 파라미터 다음PCR을 수행: 5분 동안 98°C, 10초 동안 98°C의 39사이클, 선택된 어닐링 온도(72°C)를 30초; 최종 연장 72 °C 2 분.
2. 매개 변수에 따라 열 용융 프로파일을 생성 : 1 분 동안 95 °C, 1 분 동안 60 °C를 어닐링, 0.2 ° C 단위로 75 °C와 95 °C 사이의 용융 곡선 검출, 각 온도에서 10 s의 홀드 타임을 갖는다. CFX96 실시간 시스템을 사용하여 HRMA 실행에 대한 소프트웨어 설정에 대한 자세한 설명은 보충 자료 및 보충 도S1-S5 를 참조하십시오.
3. 용융 프로파일을 검사합니다(그림 3B). 참조 클러스터에 야생 식 컨트롤을 할당합니다.
   참고: 소프트웨어( 재료 표 참조)는 자동으로 데이터를 정규화하고 다른 용융 곡선에 대한 색상으로 클러스터를 지정합니다.
4. 96웰 템플릿에 해당 색상으로 다른 클러스터를 표시합니다(그림 3C).
5. 관심 있는 곡선이 있는 개인을 선택하고 튜브에서 제거하고 백크로스(그림 3D)를 선택합니다. 짝짓기 암컷에게 혈액을 공급하고 _G2 알을 수집합니다.

4. Sanger 시퀀싱에 의한 서열 검증

1. 선택된 모기(섹션 3.1에 제조된 플레이트에서)로 우물에서 PCR 제품을 정화하고, 효소를 사용하여 잔류 PCR 프라이머를 저하시키고, 과도한 dNTP를 탈포합니다. 또는 컬럼 정리 키트를 사용하고 시료 시퀀싱을 진행합니다.
   참고: PCR 제품 크기가 작을 때 직접 시퀀싱이 더 어려울 수 있습니다(≤200 bp). 이러한 경우, 설계 프라이머는 표적 부위(≥250bp)를 포함하는 더 큰 단편을 증폭시키고 96웰 플레이트(2.2단계)에서 DNA를 이용하여 PCR에 의해 증폭된다.
2. 추적 뷰어 소프트웨어를 사용하여 인델을 분석하고 식별합니다(그림 4). 대안적으로, 폴리 피크 파저 소프트웨어²⁰ 은 이종화구균 개인에서 돌연변이를 검출하는 데 도움이 될 수 있다.
   1. 폴리 피크 파저 웹 사이트로 이동 하여 찾아보기 메뉴의 돌연변이 개인에서 시퀀스를 선택하고 상자에 참조 시퀀스를 복사하여 붙여 넣습니다.
      참고: 대체 본선과 참조 사이의 정렬이 화면 오른쪽에 자동으로 나타납니다.

결과

유전자 AaeZIP11 (putative iron ^{transporter21})와 myo-fem (비행 근육¹³과 관련된 여성 편향된 묘신 유전자)에 돌연변이를 함유한 모기는 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 수득하였고, HRMA를 이용한 유전자형, 서열 검증(도 5)을 얻었다. 도 5A 및 도 5C 는 야생식 컨트롤과 함께 각각 AaeZIP11 및 my...

토론

고해상도 용융 해석은 벡터 모기 Ae. aegypti에서 CRISPR/Cas9 기술로 생성된 인델을 식별할 수 있는 간단하고 빠른 솔루션을 제공합니다. 그것은 유연성을 제공, 철 물질 대사에 비행 근육에서 유전자의 넓은 범위에 대 한 돌연변이 모기의 유전자를 사용 하 여 ^13,14. HRMA는 샘플 수집에서 최종 분석에 이르기까지 단 몇 시간 만에 수행할 수 있습니다. 프?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol			70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates	VWR	82006-636	For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates			House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96	Bio Rad		PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs	VWR	490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit	New England Biolabs	E1050S
Glass Petri Dish	VWR	89001-246	150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates	Bio-rad	HSP9665	For HRMA
Multi-channel pipettor (P10)	Integra Biosciences	4721
Multi-channel pipettor (P300)	Integra Biosciences	4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific	VWR	37000-548	To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape	Bio-rad	2239444	To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools)	Thermo Fisher	F140WH	For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers	Genesee	59-128W
Precision Melt Analysis Software	Bio Rad	1845025	Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro	DNAstar Lasergene software		For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor	Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm	WPI	14098
White foam plugs	VWR	60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee	32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue	Genesee	59-164B