Détection d’indel suite à la mutagénèse CRISPR/Cas9 à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution chez le moustique Aedes aegypti

Résumé

Cet article détaille un protocole d’identification rapide des indels induits par CRISPR/Cas9 et la sélection de lignées mutantes chez le moustique Aedes aegypti à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution.

Résumé

L’édition de gènes de moustiques est devenue une routine dans plusieurs laboratoires avec la mise en place de systèmes tels que les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN), les nucléases à doigts de zinc (ZFN) et les endonucléases de homing (HE). Plus récemment, la technologie CRISPR (CRISPR) / protéine 9 associée à CRISPR (CAS9) a offert une alternative plus facile et moins chère pour l’ingénierie du génome de précision. Après l’action de la nucléase, les voies de réparation de l’ADN répareront les extrémités brisées de l’ADN, introduisant souvent des indels. Ces mutations hors cadre sont ensuite utilisées pour comprendre la fonction des gènes dans les organismes cibles. Un inconvénient, cependant, est que les individus mutants ne portent aucun marqueur dominant, ce qui rend l’identification et le suivi des allèles mutants difficiles, en particulier aux échelles nécessaires pour de nombreuses expériences.

L’analyse de fusion à haute résolution (HRMA) est une méthode simple pour identifier les variations dans les séquences d’acides nucléiques et utilise des courbes de fusion PCR pour détecter de telles variations. Cette méthode d’analyse post-PCR utilise des colorants fluorescents à double brin liant l’ADN avec une instrumentation dotée d’une capacité de capture de données de contrôle de la température et facilement mise à l’échelle à des formats de plaques à 96 puits. Décrit ici est un flux de travail simple utilisant HRMA pour la détection rapide des indels induits par CRISPR / Cas9 et l’établissement de lignées mutantes chez le moustique Ae. aegypti. De manière critique, toutes les étapes peuvent être effectuées avec une petite quantité de tissu de jambe et ne nécessitent pas de sacrifier l’organisme, ce qui permet d’effectuer des croisements génétiques ou des tests de phénotypage après le génotypage.

Introduction

En tant que vecteurs d’agents pathogènes tels que les virus de la dengue1, ^zika2 et chikungunya3, ainsi que des parasites du ^paludisme4, les moustiques représentent une menace importante pour la santé publique humaine. Pour toutes ces maladies, l’intervention de transmission est fortement axée sur la lutte contre les moustiques vecteurs. L’étude des gènes importants, par exemple, dans la permissivité des agents pathogènes, la condition physique des moustiques, la survie, la reproduction et la résistance aux insecticides est essentielle pour développer de nouvelles stratégie....

Protocole

1. Recherche de polymorphismes mononucléotidiques (SNP), conception de l’amorce HRMA et validation de l’amorce

1. Identification SNP chez les moustiques de colonie de laboratoire de type sauvage
   1. Sélectionnez l’exon cible pour perturber la traduction appropriée des polypeptides.
      REMARQUE: La cible doit être proche du codon de départ ou parmi les résidus clés nécessaires à la fonction protéique. Plus l’exon est court (par exemple, ≤200 bases), plus il est difficile à cibler et à analyser. Évitez d’éditer près des limites d’un exon, car cela force l’un des amorces HRMA à traverser un intron ou à être dans un intron. Cela n’est pas souhaitable car les tau....

Résultats

Les moustiques contenant des mutations dans les gènes AaeZIP11 (transporteur putatif de ^fer21) et myo-fem (un gène de myosine à biais féminin lié aux muscles volants13) ont été obtenus à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9, génotypés à l’aide de HRMA et vérifiés par séquence (Figure 5). La figure 5A et la figure 5C montrent l’intensité de fluores.......

Discussion

L’analyse de fusion à haute résolution offre une solution simple et rapide pour l’identification des indels générés par la technologie CRISPR/Cas9 chez le moustique vecteur Ae. aegypti. Il offre de la flexibilité, permettant le génotypage des moustiques mutés pour un large éventail de gènes allant du muscle de vol au métabolisme du fer et plus ^encore13,14. HRMA peut être effectué en quelques heures seulement, de la collecte de l’échan.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol			70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates	VWR	82006-636	For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates			House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96	Bio Rad		PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs	VWR	490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit	New England Biolabs	E1050S
Glass Petri Dish	VWR	89001-246	150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates	Bio-rad	HSP9665	For HRMA
Multi-channel pipettor (P10)	Integra Biosciences	4721
Multi-channel pipettor (P300)	Integra Biosciences	4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific	VWR	37000-548	To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape	Bio-rad	2239444	To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools)	Thermo Fisher	F140WH	For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers	Genesee	59-128W
Precision Melt Analysis Software	Bio Rad	1845025	Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro	DNAstar Lasergene software		For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor	Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm	WPI	14098
White foam plugs	VWR	60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee	32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue	Genesee	59-164B