Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzeanalyse in der Mücke Aedes aegypti

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Indeln, die durch CRISPR/Cas9 induziert werden, und zur Auswahl von Mutantenlinien in der Mücke Aedes aegypti unter Verwendung einer hochauflösenden Schmelzanalyse.

Zusammenfassung

Die Mücken-Gen-Editierung ist in mehreren Labors zur Routine geworden, wobei Systeme wie transkriptionsaktivatorähnliche Effektornukleasen (TALENs), Zinkfingernukleasen (ZFNs) und Homing-Endonukleasen (HEs) etabliert wurden. In jüngster Zeit hat die CRISPR-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / CRISPR-assoziiertes Protein 9 (Cas9) eine einfachere und kostengünstigere Alternative für das Precision Genome Engineering angeboten. Nach der Nuklease-Aktion fixieren DNA-Reparaturwege die gebrochenen DNA-Enden und führen oft Indel ein. Diese Out-of-Frame-Mutationen werden dann verwendet, um die Genfunktion in den Zielorganismen zu verstehen. Ein Nachteil ist jedoch, dass mutierte Individuen keinen dominanten Marker tragen, was die Identifizierung und Verfolgung von mutierten Allelen schwierig macht, insbesondere in Skalen, die für viele Experimente benötigt werden.

Die hochauflösende Schmelzeanalyse (HRMA) ist eine einfache Methode zur Identifizierung von Variationen in Nukleinsäuresequenzen und verwendet PCR-Schmelzkurven, um solche Variationen nachzuweisen. Diese Post-PCR-Analysemethode verwendet fluoreszierende doppelsträngige DNA-bindende Farbstoffe mit Instrumenten, die über eine Datenerfassungsfunktion zur Temperaturrampenregelung verfügen und leicht auf 96-Well-Plattenformate skaliert werden können. Beschrieben wird hier ein einfacher Workflow mit HRMA zum schnellen Nachweis von CRISPR/Cas9-induzierten Indeln und der Etablierung von Mutantenlinien in der Mücke Ae. aegypti. Entscheidend ist, dass alle Schritte mit einer kleinen Menge Anleggewebe durchgeführt werden können und keine Opferung des Organismus erfordern, so dass genetische Kreuzungen oder Phänotypisierungsassays nach der Genotypisierung durchgeführt werden können.

Einleitung

Als Vektoren von Krankheitserregern wie ^Dengue1-, ^Zika2- und Chikungunya3-Viren sowie Malariaparasiten4 stellen Moskitos eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit des Menschen dar. Bei all diesen Erkrankungen liegt ein wesentlicher Schwerpunkt der Übertragungsintervention auf der Bekämpfung von Mückenvektoren. Die Untersuchung der Gene, die beispielsweise für die Permissivität gegenüber Krankheitserregern, die Fitness von Mücken, das Überleben, die Fortpflanzung und die Resistenz gegen Insektizide wichtig sind, ist der Schlüssel zur Entwicklung neuartiger Str....

Protokoll

1. Scannen auf Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), HRMA-Primer-Design und Primer-Validierung

1. SNP-Identifizierung bei Wildtyp-Laborkolonienmücken
   1. Wählen Sie das Ziel-Exon aus, um die korrekte Polypeptid-Translation zu stören.
      ANMERKUNG: Das Ziel sollte in der Nähe des Startcodons oder unter den für die Proteinfunktion erforderlichen Schlüsselrückständen liegen. Je kürzer das Exon (z. B. ≤200 Basen), desto schwieriger ist es, es zu zielen und zu analysieren. Vermeiden Sie es, in der Nähe der Grenzen eines Exons zu editieren, da dies einen der HRMA-Primer zwingt, entweder ein Intron zu überqueren oder sich in einem Intron zu befinden. Dies ist uner....

Ergebnisse

Moskitos, die Mutationen in den Genen AaeZIP11 (mutmaßlicher ^{Eisentransporter21}) und Myo-fem (ein weiblich voreingenommenes Myosin-Gen im Zusammenhang mit Flugmuskeln13) enthalten, wurden mit der CRISPR/Cas9-Technologie gewonnen, mit HRMA genotypisiert und sequenzverifiziert (Abbildung 5). Abbildung 5A und Abbildung 5C zeigen die normalisierte Fluoreszenzintensität .......

Diskussion

Die hochauflösende Schmelzeanalyse bietet eine einfache und schnelle Lösung für die Identifizierung von Indeln, die durch die CRISPR/Cas9-Technologie in der Vektormücke Ae. aegypti erzeugt werden. Es bietet Flexibilität und ermöglicht die Genotypisierung von Mücken, die für eine Vielzahl von Genen mutiert sind, vom Flugmuskel bis zum Eisenstoffwechsel und ^mehr13,14. HRMA kann in nur wenigen Stunden von der Probenentnahme bis zur endgültigen Anal.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol			70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates	VWR	82006-636	For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates			House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96	Bio Rad		PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs	VWR	490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit	New England Biolabs	E1050S
Glass Petri Dish	VWR	89001-246	150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates	Bio-rad	HSP9665	For HRMA
Multi-channel pipettor (P10)	Integra Biosciences	4721
Multi-channel pipettor (P300)	Integra Biosciences	4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific	VWR	37000-548	To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape	Bio-rad	2239444	To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools)	Thermo Fisher	F140WH	For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers	Genesee	59-128W
Precision Melt Analysis Software	Bio Rad	1845025	Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro	DNAstar Lasergene software		For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor	Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm	WPI	14098
White foam plugs	VWR	60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee	32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue	Genesee	59-164B