Detección indel tras mutagénesis CRISPR/Cas9 mediante análisis de fusión de alta resolución en el mosquito Aedes aegypti

Resumen

Este artículo detalla un protocolo para la identificación rápida de indels inducidos por CRISPR/Cas9 y la selección de líneas mutantes en el mosquito Aedes aegypti utilizando análisis de fusión de alta resolución.

Resumen

La edición de genes de mosquitos se ha convertido en rutina en varios laboratorios con el establecimiento de sistemas como nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN), nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y endonucleasas de homing (HE). Más recientemente, la tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) ha ofrecido una alternativa más fácil y barata para la ingeniería genómica de precisión. Después de la acción de la nucleasa, las vías de reparación del ADN arreglarán los extremos rotos del ADN, a menudo introduciendo indels. Estas mutaciones fuera de marco se utilizan para comprender la función génica en los organismos objetivo. Un inconveniente, sin embargo, es que los individuos mutantes no llevan un marcador dominante, lo que hace que la identificación y el seguimiento de los alelos mutantes sean un desafío, especialmente a escalas necesarias para muchos experimentos.

El análisis de fusión de alta resolución (HRMA) es un método simple para identificar variaciones en las secuencias de ácidos nucleicos y utiliza curvas de fusión por PCR para detectar tales variaciones. Este método de análisis post-PCR utiliza colorantes fluorescentes de doble cadena de unión al ADN con instrumentación que tiene capacidad de captura de datos de control de rampa de temperatura y se escala fácilmente a formatos de placa de 96 pocillos. Aquí se describe un flujo de trabajo simple utilizando HRMA para la detección rápida de indels inducidos por CRISPR / Cas9 y el establecimiento de líneas mutantes en el mosquito Ae. aegypti. Críticamente, todos los pasos se pueden realizar con una pequeña cantidad de tejido de la pierna y no requieren sacrificar el organismo, lo que permite que se realicen cruces genéticos o ensayos de fenotipado después del genotipado.

Introducción

Como vectores de patógenos como los virus del ^dengue1, ^Zika2 y chikungunya3, así como de parásitos de la ^malaria4, los mosquitos representan una amenaza significativa para la salud pública de los seres humanos. Para todas estas enfermedades, hay un enfoque sustancial de la intervención de transmisión en el control de los mosquitos vectores. El estudio de los genes importantes en, por ejemplo, la permisividad a los patógenos, la aptitud de los mosquitos, la supervivencia, la reproducción y la resistencia a los insecticidas es clave para desarrollar nuevas estrategias de control de mosquitos. Para tales fines, la edición del genoma en mosquitos se está convirtiendo en una práctica común, especialmente con el desarrollo de tecnologías como HEs, ZFNs, TALENs y, más recientemente, CRISPR con Cas9. El establecimiento de cepas editadas genéticamente implica el retrocruce de individuos portadores de las mutaciones deseadas durante unas pocas generaciones para minimizar los efectos fuera del objetivo y fundadores (cuello de botella), seguido de cruzar individuos heterocigotos para generar líneas homocigotas o trans-heterocigotas. En ausencia de un marcador dominante, el genotipado molecular es necesario en este proceso porque, en muchos casos, no se pueden detectar rasgos fenotípicos claros para los mutantes heterocigotos.

Aunque la secuenciación es el estándar de oro para la caracterización genotípica, realizar esto en cientos, o posiblemente miles de individuos, plantea costos significativos, mano de obra y tiempo requerido para obtener resultados, lo cual es especialmente crítico para organismos con una vida útil corta, como los mosquitos. Las alternativas más utilizadas son el ensayo de nucleasa ^Surveyor5 (SNA), el ensayo T7E16 y el análisis de fusión de alta resolución (HRMA, revisado ^en7). Tanto SNA como T7E1 usan endonucleasas que cortan solo bases no coincidentes. Cuando se amplifica una región mutada del genoma mutante heterocigoto, los fragmentos de ADN de alelos mutantes y de tipo salvaje se recocen para hacer ADN de doble cadena (dsDNA) no coincidente. SNA detecta la presencia de desajustes a través de la digestión con una endonucleasa específica de desajuste y electroforesis simple en gel de agarosa. Alternativamente, HRMA utiliza las propiedades termodinámicas del dsDNA detectadas por los colorantes fluorescentes de unión al dsDNA, con la temperatura de disociación del colorante variando según la presencia y el tipo de mutación. La HRMA se ha utilizado para la detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)⁸, genotipado mutante de peces ^cebra9, aplicaciones microbiológicas10 e investigación fitogenética11, entre otras.

Este artículo describe HRMA, un método simple de genotipado molecular para mosquitos mutantes generados por la tecnología CRISPR / Cas9. Las ventajas de hrMA sobre las técnicas alternativas incluyen 1) flexibilidad, ya que se ha demostrado que es útil para varios genes, una amplia gama de tamaños indel, así como la distinción entre diferentes tamaños de indel y diferenciación heterocigota, homocigota y trans-heterocigota12,13,14, 2) costo, ya que se basa en reactivos de PCR de uso común, y 3) ahorro de tiempo, ya que se puede realizar en tan solo unas horas. Además, el protocolo utiliza una pequeña parte del cuerpo (una pata) como fuente de ADN, lo que permite que el mosquito sobreviva al proceso de genotipado, lo que permite el establecimiento y mantenimiento de líneas mutantes.

Protocolo

1. Escaneo de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), diseño de imprimación HRMA y validación de imprimación

1. Identificación de SNP en mosquitos colonias de laboratorio de tipo silvestre
   1. Seleccione el exón objetivo para interrumpir la traducción adecuada del polipéptido.
      NOTA: El objetivo debe estar cerca del codón de inicio o entre los residuos clave necesarios para la función de la proteína. Cuanto más corto sea el exón (por ejemplo, ≤200 bases), más difícil será apuntar y analizar. Evite editar cerca de los límites de un exón, ya que esto obliga a uno de los cebadores HRMA a cruzar un intrón o estar en un intrón. Esto es indeseable porque las tasas de SNP tienden a ser mucho mayores en esas regiones.
   2. Diseño de imprimación
      1. Vaya al sitio web de NCBI Blast - Primer ^Blast15, copie y pegue el exón elegido en el cuadro en la parte superior de la página | elija el tamaño del producto de PCR (asegúrese de que abarque la mayor parte del exón) | elegir el organismo.
      2. Haga clic en parámetros avanzados | Opte por (para PCR Product Tm) y agregue 60 (para una temperatura óptima de 60 ° C) | Obtén cartillas. Mantenga los otros parámetros como predeterminados.
   3. Obtener ADN genómico (gDNA) de la colonia de laboratorio de tipo salvaje. Aparta 10 mosquitos, anestesia con _CO2 y colócalos en una placa de Petri sobre hielo para mantenerlos inactivos. Configure 10 tubos que contengan 0,5 μL del reactivo para la liberación de ADN del tejido y 20 μL de tampón de dilución, ambos proporcionados en el kit de liberación de ADN sugerido en la Tabla de Materiales.
   4. Retire una pata de un solo mosquito con fórceps y colóquela en un tubo correspondiente de una solución diluida del reactivo de liberación de ADN (a partir del paso 1.1.3), sumergiendo completamente la pata en la solución. Repita este paso con los mosquitos restantes, limpiando los fórceps con etanol al 70% antes de pasar al siguiente.
   5. Incubar la solución que contiene la pierna a temperatura ambiente durante 2-5 min, luego a 98 °C durante 2 min, y dejar que se enfríe mientras se configura la reacción de PCR.
      NOTA: Las placas que contienen el gDNA liberado se pueden almacenar a -20 °C, y el protocolo se puede pausar en este punto.
   6. Preparar 10 tubos que contengan 10 μL de 2x PCR Master Mix, cebadores a una concentración final de 0,5 μM y agua de grado molecular a un volumen final de 20 μL, y transferir 1 μL de la muestra diluida a cada tubo. Realizar PCR siguiendo estos parámetros de ciclo: 98 °C 5 min, 40 ciclos de 98 °C durante 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s por kb; extensión final de 72 °C durante 1 min.
   7. Purificar los productos de PCR con una enzima para degradar los cebadores de PCR residuales y desfosforilar el exceso de dNTP o cualquier kit de limpieza de columna. Proceda con la secuenciación de las muestras.
   8. Analice cada electroferograma para detectar la presencia de picos dobles / bases ambiguas, y ajuste las llamadas de base manualmente en cada secuencia utilizando el código base degenerado apropiado.
      NOTA: Este paso debe realizarse antes de la alineación de secuencia múltiple, ya que es común que el software de llamada base seleccione el pico más prominente como la llamada base "verdadera", dando la falsa impresión de una ausencia de SNP.
   9. Realice una alineación de secuencia múltiple utilizando el software de alineación, SeqMan Pro, que aparece en la Tabla de materiales u otro software de alineación de código abierto, como ClustalW16 o T-Coffee17.
      1. Abra el software de alineación | haga clic en Agregar secuencias | seleccione las secuencias deseadas y haga clic en Agregar | una vez elegidas todas las secuencias, haga clic en Listo.
      2. Haga clic en Ensamblar para realizar la alineación. Para abrir la alineación, haga clic en Contig 1 y analice la alineación e identifique los SNP (Figura 1).
         NOTA: Como alternativa a los pasos 1.1.3-1.1.6, la PCR se puede realizar a partir de ADN genómico aislado obtenido de muestras a granel (derivadas de >10 individuos). Los amplicones secuenciados se pueden analizar directamente para detectar la presencia de SNP que aparecen como picos dobles en el electroferograma, aunque los SNP raros serán más difíciles de detectar.
   10. Diseñar 3-5 RNAs de guía única (sgRNAs), evitando regiones que contengan cualquier SNP identificado anteriormente, siguiendo el protocolo descrito ^en18.
2. Diseño de imprimación HRMA
   1. Pruebe la secuencia de exones para la posible formación de estructuras secundarias durante la PCR utilizando ^mFold19.
      1. Vaya al servidor web unafold | haga clic en mFold | en el menú desplegable, haga clic en Aplicaciones | Forma de plegamiento del ADN.
      2. Introduzca el nombre de la secuencia en el cuadro y pegue el exón.
      3. Cambiar la temperatura de plegado a 60 °C; en las condiciones iónicas, cambie [Mg⁺⁺] a 1.5 y en Unidades cambie a mM; haga clic en Doblar ADN.
      4. En Salida, debajo de la Estructura 1, haga clic en pdf para abrir las Gráficas de Estructura Circular.
   2. Vaya a NCBI Blast - Primer ^{Blast15 para el} diseño de imprimación.
   3. Copie y pegue la secuencia de exones seleccionada determinada por secuenciación en el paso 1.1 (la secuencia que contiene el número más bajo de SNP o ningún SNP) en el cuadro de la parte superior de la página.
   4. Utilice el símbolo < > para marcar y excluir secuencias que contengan SNP, el sitio de destino y regiones con posible formación de estructura secundaria.
   5. Seleccione el tamaño del producto de PCR para que esté entre 80 y 150 pb y elija el organismo.
      NOTA: Los tamaños de fragmento más grandes se pueden usar con éxito (~ 300 bp). Sin embargo, los amplicones más largos pueden disminuir la sensibilidad entre secuencias que difieren en uno o solo unos pocos pares de bases.
   6. Haga clic en Obtener cartillas. Seleccione 2-3 pares de cebadores para ser probados (idealmente, los sitios de imprimación están a ≥20-50 pb de distancia de cualquier sitio objetivo CRISPR).
3. Validación de imprimación
   1. Realizar una PCR de gradiente utilizando gDNA de un solo individuo.
      1. Prepare una mezcla maestra y retire una muestra para el control sin plantilla (NTC) en un tubo separado. Agregue la plantilla a la mezcla maestra restante y alícuota en una placa de 96 pocillos.
      2. Siga los parámetros de ciclo: 98 °C 30 s, 34 ciclos de 98 °C durante 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; extensión final de 72 °C durante 10 min.
      3. Genere perfiles de fusión térmica siguiendo los parámetros: paso de desnaturalización 95 °C durante 1 min, recocido 60 °C durante 1 min, detección de curva de fusión entre 75 °C y 95 °C en incrementos de 0,2 °C, con un tiempo de retención de 10 s a cada temperatura.
         NOTA: Solo se deben utilizar temperaturas de recocido con un solo perfil de fusión térmica.
4. Proceder a generar las líneas mutantes con inyecciones embrionarias como se describe ^en12.

2. Preparación de ADN genómico de patas de mosquito

1. Separe los mosquitos _G1 por sexo en la etapa de pupa para que no se apareen antes del genotipado, y asegúrese de que los mosquitos de control de tipo silvestre de la misma edad estén disponibles para ser utilizados como referencias y retrocruces. Separarlos por sexo de la misma manera.
2. Reúna los materiales necesarios (Figura 2A) y prepare una placa de PCR de 96 pocillos con 0,5 μL del reactivo de liberación de ADN y 20 μL de tampón de dilución (del kit de liberación de gDNA) por individuo a genotipar (Figura 2B) y déjelo en hielo. Reserve dos reacciones para NTC.
3. Etiquete una bandeja para viales de mosquitos (viales de Drosophila ) para que cada pocillo en la placa 96 corresponda al vial de mosquito respectivo en la bandeja.
4. Anestesiar los mosquitos _G1 con _CO2 y colocarlos en una placa de Petri de vidrio para mantenerlos sedados (Figura 2C, D). Anestesia y coloca 8 mosquitos de tipo salvaje en una segunda placa de Petri.
5. Limpie un par de pinzas con etanol al 70% y retire una de las patas traseras del mosquito (Figura 2E, F).
6. Sumerja la pierna en la solución de reactivo de liberación de ADN, coloque el mosquito en el vial correspondiente y ciérrelo con una esponja (Figura 2G,H).
7. Limpie las pinzas nuevamente con etanol al 70% y proceda a quitar la pata del siguiente mosquito. Repita los pasos 2.5-2.7 hasta que se complete la placa de 96 pocillos.
   NOTA: Es importante limpiar las pinzas con etanol al 70%. Esto minimiza la contaminación cruzada de ADN.
8. Selle la placa con un sello de placa de PCR óptica (Figura 2I) e incube la placa de 96 pocillos que contiene las patas a temperatura ambiente (RT) durante 2-5 min y luego a 98 °C durante 2 min. Deje que la placa se enfríe a RT mientras prepara la mezcla de PCR.
   NOTA: Todo el proceso suele durar de 3 a 4 h. Si los mosquitos deben mantenerse en los viales durante más tiempo del esperado (especialmente ≥1 día), coloque un pequeño trozo de pasa (o fuente de azúcar y agua) con cada mosquito para garantizar la supervivencia de los mosquitos durante las incubaciones prolongadas.

3. HRMA

1. Realizar PCR.
   1. Prepare una mezcla maestra que contenga los siguientes componentes por cada reacción: 10 μL de tampón 2x (del kit de liberación de gDNA), 0.5 μM de cada imprimación, 1 μL de colorante EvaGreen, 0.4 μL de polimerasa (del kit de liberación de gDNA) y completa hasta 19 μL con agua de grado molecular.
   2. Usando una pipeta multicanal, transfiera 19 μL de la mezcla maestra a cada pozo. Transfiera 1 μL de la solución de liberación de ADN que contiene ADN de mosquito preparado en la sección 2 a la placa (Figura 3A). Selle la placa con un sello óptico de placa de PCR.
   3. Realizar la PCR siguiendo los parámetros de ciclo: 98 °C durante 5 min, 39 ciclos de 98 °C durante 10 s, la temperatura de recocido elegida (72 °C) durante 30 s; extensión final 72 °C durante 2 min.
2. Genere perfiles de fusión térmica siguiendo los parámetros: paso de desnaturalización 95 °C durante 1 min, recocido 60 °C durante 1 min, detección de curva de fusión entre 75 °C y 95 °C en incrementos de 0,2 °C, con un tiempo de retención de 10 s a cada temperatura. Consulte el Material suplementario y la Figura suplementaria S1-S5 para obtener una descripción detallada de la configuración del software para la ejecución de HRMA utilizando el sistema en tiempo real CFX96.
3. Examinar los perfiles de fusión (Figura 3B). Asigne un control de tipo comodín al clúster de referencia.
   NOTA: El software (consulte la Tabla de materiales) normaliza automáticamente los datos y designa grupos con colores para diferentes curvas de fusión.
4. Marque los diferentes clústeres con los colores correspondientes en la plantilla de 96 pocillos (Figura 3C).
5. Seleccione los individuos con curvas de interés, retírelos de los tubos y retrocruce (Figura 3D). Alimente con sangre a las hembras apareadas y recolecte huevos _G2 .

4. Verificación de secuencia por secuenciación de Sanger

1. Purificar el producto de PCR de los pocillos con mosquitos seleccionados (de la placa preparada en la sección 3.1), utilizando una enzima para degradar los cebadores de PCR residuales, y desfosforilar el exceso de dNTP. Alternativamente, use cualquier kit de limpieza de columnas y proceda a secuenciar las muestras.
   NOTA: La secuenciación directa puede ser más difícil cuando el tamaño del producto de PCR es pequeño (≤200 pb). En tales casos, diseñe cebadores para amplificar fragmentos más grandes que abarquen el sitio objetivo (≥250 pb) y amplificar mediante PCR utilizando el ADN en la placa de 96 pocillos (paso 2.2).
2. Analice e identifique los indels utilizando el software de visor de seguimiento (Figura 4). Alternativamente, el software Poly Peak ^Parser20 puede ayudar a detectar la mutación en individuos heterocigotos.
   1. Vaya al sitio web de Poly Peak Parser, seleccione la secuencia de los individuos mutantes en el menú Examinar y copie y pegue la secuencia de referencia en el cuadro.
      NOTA: La alineación entre el alelo alternativo y la referencia aparecerá automáticamente en el lado derecho de la pantalla.

Resultados

Los mosquitos que contenían mutaciones en los genes AaeZIP11 (supuesto transportador de ^hierro21) y myo-fem (un gen de miosina con sesgo femenino relacionado con los músculos de ^vuelo13) se obtuvieron utilizando la tecnología CRISPR/Cas9, genotipados con HRMA y verificados por secuencia (Figura 5). La Figura 5A y la Figura 5C muestran la intensidad de fluorescencia...

Discusión

El análisis de fusión de alta resolución ofrece una solución simple y rápida para la identificación de indels generados por la tecnología CRISPR/Cas9 en el mosquito vector Ae. aegypti. Proporciona flexibilidad, permitiendo el genotipado de mosquitos mutados para una amplia gama de genes, desde el músculo de vuelo hasta el metabolismo del hierro y ^más13,14. La HRMA se puede realizar en solo unas pocas horas desde la recolección de la muestra has...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol			70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates	VWR	82006-636	For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates			House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96	Bio Rad		PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs	VWR	490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit	New England Biolabs	E1050S
Glass Petri Dish	VWR	89001-246	150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates	Bio-rad	HSP9665	For HRMA
Multi-channel pipettor (P10)	Integra Biosciences	4721
Multi-channel pipettor (P300)	Integra Biosciences	4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific	VWR	37000-548	To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape	Bio-rad	2239444	To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools)	Thermo Fisher	F140WH	For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers	Genesee	59-128W
Precision Melt Analysis Software	Bio Rad	1845025	Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro	DNAstar Lasergene software		For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor	Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm	WPI	14098
White foam plugs	VWR	60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee	32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue	Genesee	59-164B