Sivrisinek Aedes aegypti'de Yüksek Çözünürlüklü Eriyik Analizi Kullanarak CRISPR/Cas9 Mutagenesis'i Takip Eden Indel Tespiti

Özet

Bu makalede, CRISPR/Cas9 tarafından indüklenen indellerin hızlı tanımlanması ve sivrisinek Aedes aegypti'deki mutant çizgilerinin yüksek çözünürlüklü eriyik analizi kullanılarak seçilmesi için bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Özet

Transkripsiyon-aktivatör benzeri efektör nükleazları (TALENler), çinko parmak nükleazları (ZFN'ler) ve homing endonucleases (HEs) gibi sistemlerin kurulmasıyla sivrisinek gen düzenlemesi çeşitli laboratuvarlarda rutin hale gelmiştir. Daha yakın zamanda, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) teknolojisi hassas genom mühendisliği için daha kolay ve ucuz bir alternatif sunmuştır. Nükleaz eylemini takiben, DNA onarım yolları kırık DNA uçlarını düzeltecek ve genellikle indelleri tanıtacaktır. Bu çerçeve dışı mutasyonlar daha sonra hedef organizmalardaki gen fonksiyonunu anlamak için kullanılır. Bununla birlikte, bir dezavantajı, mutant bireylerin baskın bir işaret taşıması, mutant alellerinin tanımlanması ve izlenmesini, özellikle birçok deney için gerekli ölçeklerde zor hale getirmeleridir.

Yüksek çözünürlüklü eriyik analizi (HRMA), nükleik asit dizilerindeki varyasyonları tanımlamak için basit bir yöntemdir ve bu varyasyonları tespit etmek için PCR erime eğrilerini kullanır. Bu PCR sonrası analiz yöntemi, sıcaklık rampası kontrol veri yakalama özelliğine sahip ve kolayca 96 kuyu plaka formatlarına ölçeklendirilen enstrümantasyonlu floresan çift iplikli DNA bağlayıcı boyalar kullanır. Burada, CRISPR/ Cas9 kaynaklı indellerin hızlı tespiti ve sivrisinek Ae. aegypti'de mutant hatlarının kurulması için HRMA kullanan basit bir iş akışı açıklanmıştır. Kritik olarak, tüm adımlar az miktarda bacak dokusu ile yapılabilir ve organizmadan ödün vermeyi gerektirmez, genotiplemeden sonra genetik haçların veya fenotipleme testlerinin yapılmasına izin verir.

Giriş

^Dang1, ^Zika2 ve chikungunya3 virüsleri gibi patojenlerin vektörleri ve sıtma ^parazitleri4 olarak, sivrisinekler insanlar için önemli bir halk sağlığı tehdidini temsil eder. Tüm bu hastalıklar için, sivrisinek vektörlerinin kontrolüne önemli bir bulaşma müdahalesi odağı vardır. Örneğin, patojenlere izin verme, sivrisinek zindeliği, hayatta kalma, üreme ve insektisitlere karşı dirençte önemli genlerin incelenmesi, yeni sivrisinek kontrol stratejileri geliştirmek için anahtardır. Bu amaçlar için, sivrisineklerde genom düzenleme, özellikle HE'ler, ZFN'ler, TALEN'ler ve en son CAS9 ile CRISPR gibi teknolojilerin geliştirilmesiyle yaygın bir uygulama haline gelmektedir. Gen düzenlemeli suşların kurulması tipik olarak hedef dışı ve kurucu (darboğaz) etkileri en aza indirmek için birkaç nesil boyunca istenen mutasyonları taşıyan bireylerin geriye doğru geriye doğru dönmesini ve ardından homoziöz veya trans-heterozipöz çizgiler oluşturmak için heterozipöz bireyleri geçmeyi içerir. Baskın bir belirtecin yokluğunda, moleküler genotipleme bu süreçte gereklidir, çünkü çoğu durumda heterozipöz mutantlar için net fenotipik özellikler tespit edilemez.

Sıralama genotipik karakterizasyon için altın standart olmasına rağmen, bunu yüzlerce veya muhtemelen binlerce bireyde gerçekleştirmek, özellikle sivrisinekler gibi kısa ömürlü organizmalar için kritik olan sonuç elde etmek için gereken önemli maliyetler, emek ve zaman oluşturur. Surveyor nükleaz tahlil5 (SNA), T7E1 tahlil6 ve yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA, ⁱⁿ⁷) yaygın olarak kullanılan alternatiflerdir. Hem SNA hem de T7E1, yalnızca eşleşmeyen tabanları ayıran endonucleases kullanır. Heterozygous mutant genomunun mutasyona uğramış bir bölgesi yükseltildiğinde, mutant ve vahşi tip alellerden dna parçaları, eşleşmeyen çift iplikli DNA (dsDNA) yapmak için tavlanır. SNA, uyumsuzlığa özgü bir endonokleaz ve basit agarose jel elektroforezi ile sindirim yoluyla uyuşmazlıkların varlığını tespit eder. Alternatif olarak, HRMA, dsDNA bağlayıcı floresan boyalar tarafından tespit edilen dsDNA'nın termodinamik özelliklerini kullanır ve boyanın ilişkiden çıkarma sıcaklığı mutasyonun varlığına ve türüne bağlı olarak değişir. HRMA, tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP'ler)⁸, zebra balıklarının mutant genotiplemesinin^, mikrobiyolojik ^{uygulamaların10} ve bitki genetik araştırmalarının tespiti için ^{kullanılmıştır11}.

Bu makalede, CRISPR/Cas9 teknolojisi tarafından üretilen mutant sivrisinekler için basit bir moleküler genotipleme yöntemi olan HRMA açıklanmaktadır. HRMA'nın alternatif tekniklere göre avantajları arasında 1) esneklik, çeşitli genler, çok çeşitli indel boyutlarının yanı sıra farklı indel boyutları ile heterozipöz, homozigot ve trans-heterozygöz farklılaşma arasındaki ayrım için yararlı olduğu kanıtlanmıştır12,13,14, 2) maliyet, yaygın olarak kullanılan PCR reaktiflerine dayandığı için ve 3) zaman kazandıran, sadece birkaç saat içinde gerçekleştirilebileceği için. Ek olarak, protokol DNA kaynağı olarak küçük bir vücut parçası (bacak) kullanır, sivrisineklerin genotipleme işleminden kurtulmasını sağlar, mutant hatlarının kurulmasına ve bakımına izin verir.

Protokol

1. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), HRMA astar tasarımı ve astar doğrulaması için tarama

1. Vahşi tip laboratuvar koloni sivrisineklerinde SNP tanımlaması
   1. Uygun polipeptid çevirisini bozmak için hedef eksonunu seçin.
      NOT: Hedef başlangıç kodonuna yakın veya protein fonksiyonu için gerekli anahtar kalıntılar arasında olmalıdır. Ekson ne kadar kısa olursa (örneğin, ≤200 baz), hedeflemek ve analiz etmek o kadar zordur. Bir eksonun sınırlarına yakın düzenleme yapmaktan kaçının, çünkü bu, HRMA astarlarından birini bir intron'dan geçmeye veya bir intronda olmaya zorlar. Bu istenmeyen bir durumdur, çünkü SNP oranları bu bölgelerde çok daha büyük olma eğilimindedir.
   2. Astar tasarımı
      1. NCBI Blast - Primer Blast web sitesine ^gidin15, seçilen ekson kopyalayıp sayfanın üst kısmındaki kutuya yapıştırın | PCR ürün boyutunu seçin (dış denetimin çoğunu kapsadığından emin olun) | organizmayı seçin.
      2. Gelişmiş parametreler | tıklayın Tercih edin (PCR Ürün Tm için) ve 60 ekleyin (60 °C optimum sıcaklık için) | Primers'ı getir. Diğer parametreleri varsayılan olarak saklayın.
   3. Vahşi tip laboratuvar kolonisinden genomik DNA (gDNA) elde edin. 10 sivrisinek ayır, _CO2 ile uyuşturun ve hareketsiz tutmak için buz üzerinde bir Petri kabına yerleştirin. Dokudan DNA salınımı için reaktifin 0,5 μL'si ve 20 μL seyreltme tamponu içeren 10 tüp kurun, her ikisi de Malzeme Tablosunda önerilen DNA serbest bırakma kitinde sağlanmıştır.
   4. Forseps kullanarak tek bir sivrisinekten bir bacağı çıkarın ve DNA salınımlı reaktifin seyreltilmiş bir çözeltisinin ilgili tüpüne yerleştirin (adım 1.1.3'ten itibaren), bacağı çözeltiye tamamen batırın. Bu adımı kalan sivrisineklerle tekrarlayın, bir sonrakine geçmeden öncepsleri% 70 etanol ile silin.
   5. Bacak içeren çözeltiyi oda sıcaklığında 2-5 dakika, daha sonra 98 °C'de 2 dakika kuluçkaya bırakın ve PCR reaksiyonlarını ayarlarken soğumasını bekleyin.
      NOT: Serbest bırakılan gDNA'yı içeren plakalar -20 °C'de saklanabilir ve protokol bu noktada duraklatılabilir.
   6. 10 μL 2x PCR Master Mix içeren 10 tüp, 0,5 μM son konsantrasyona astarlar ve 20 μL'lik son hacme moleküler dereceli su hazırlayın ve seyreltilmiş numunenin 1 μL'sini her tüpe aktarın. Bu döngü parametrelerini izleyerek PCR gerçekleştirin: 98 °C 5 dk, 5 s için 98 °C 40 döngü, 60 °C 30 s, kb başına 72 °C 20 s; 1 dakika boyunca 72 °C'nin son uzantısı.
   7. Artık PCR astarlarını bozmak ve fazla dNTP'leri veya herhangi bir kolon temizleme kitini defosforilasyona düşürmek için PCR ürünlerini bir enzimle arındırın. Örnekleri sıralamaya devam edin.
   8. Çift tepe/belirsiz bazların varlığı için her elektroferogramı analiz edin ve uygun dejenere baz kodunu kullanarak her sırada temel çağrıları manuel olarak ayarlayın.
      NOT: Bu adım, temel çağıran yazılımın SNP'lerin yokluğunun yanlış izlenimini veren "gerçek" temel çağrı olarak daha belirgin tepeyi seçmesi yaygın olduğundan, birden çok sıra hizalamadan önce gerçekleştirilmelidir.
   9. Malzeme Tablosunda listelenen SeqMan Pro hizalama yazılımını veya ClustalW16 veya T-Coffee17 gibi diğer açık kaynaklı hizalama yazılımlarını kullanarak birden çok sıra hizalama gerçekleştirin.
      1. Hizalama yazılımı | Sıra Ekle | tıklayın istediğiniz sıraları seçin ve Ekle'ye tıklayın| tüm diziler seçildikten sonra Bitti'ye tıklayın.
      2. Hizalamayı gerçekleştirmek için Birleştir'i tıklatın. Hizalamayı açmak için Contig 1'e tıklayın ve hizalamayı analiz edin ve SNP'leri tanımlayın (Şekil 1).
         NOT: 1.1.3-1.1.6 adımlarına alternatif olarak, PCR toplu örneklerden elde edilen izole genomik DNA'dan yapılabilir (>10 kişiden türetilir). Sıralı ampliconlar doğrudan elektroferogramda çift tepe noktası olarak görünen SNP'lerin varlığı için analiz edilebilir, ancak nadir SNP'lerin tespit edilmesi daha zor olacaktır.
   10. Yukarıda tanımlanan herhangi bir SNP içeren bölgeleri, ^18'de açıklanan protokolü izleyerek önleyen 3-5 tek kılavuz RNA'sı (sgRNA) tasarlayın.
2. HRMA astar tasarımı
   1. ^mFold19 kullanarak PCR sırasında ikincil yapıların olası oluşumu için ekson sırasını test edin.
      1. UNAFold Web Sunucusu | gitme mFold | tıklayın açılır menüsünde Uygulamalar | DNA Katlama Formu.
      2. Sıra adını kutuya girin ve dış işlemi yapıştırın.
      3. Katlama sıcaklığını 60 °C'ye değiştirin; Ionic koşullarında[ Mg⁺⁺] öğesini 1,5 olarak değiştirin ve Birimler mM'ye geçin; Fold DNA'ya tıklayın.
      4. Çıktı'da, Yapı 1'in altında, Dairesel Yapı Çizimlerini açmak için pdf'ye tıklayın.
   2. Astar tasarımı için NCBI Blast - Primer ^Blast15'e gidin.
   3. Sayfanın üst kısmındaki kutuya, 1.1 adımında (en düşük sayıda SNP içeren veya SNP içermeyen sıra) sıralanarak belirlenen seçili ekson sırasını kopyalayıp yapıştırın.
   4. SNP'leri, hedef siteyi ve olası ikincil yapı oluşumuna sahip bölgeleri içeren dizileri işaretlemek ve dışlamak için sembol < > kullanın.
   5. PCR ürün boyutunu 80 ila 150 bp arasında olacak şekilde seçin ve organizmayı seçin.
      NOT: Daha büyük parça boyutları başarıyla kullanılabilir (~300 bp). Ancak, daha uzun ampliconlar bir veya sadece birkaç baz çiftte farklı diziler arasındaki duyarlılığı azaltabilir.
   6. Primer Al'a tıklayın. Test edilecek 2-3 astar çifti seçin (ideal olarak, astar siteleri ≥20-50 bp uzaklıktadır.
3. Astar doğrulaması
   1. Tek bir kişiden gDNA kullanarak degrade PCR gerçekleştirin.
      1. Ana karışım hazırlayın ve şablon olmayan denetim (NTC) için ayrı bir tüpte bir örneği çıkarın. Şablonu kalan ana karışıma ekleyin ve 96 kuyulu bir tabağa aliquot ekleyin.
      2. Bisiklet parametrelerini izleyin: 98 °C 30 s, 10 s için 98 °C 34 döngü, 55-65 °C 30 s, 72 °C 15 s; 10 dakika boyunca 72 °C'lik son uzatma.
      3. Parametreleri izleyerek termal eriyik profilleri oluşturun: 1 dakika boyunca denatürasyon adımı 95 °C, 1 dakika boyunca 60 °C tavlama, 0,2 °C artışlarla 75 °C ile 95 °C arasında erime eğrisi algılama, her sıcaklıkta 10 s tutma süresi.
         NOT: Sadece tek bir termal eriyik profiline sahip tavlama sıcaklıkları kullanılmalıdır.
4. ^12'de açıklandığı gibi embriyo enjeksiyonları ile mutant çizgilerini üretmeye devam edin.

2. Sivrisinek bacaklarından genomik DNA hazırlanması

1. _G1 sivrisineklerini pupal aşamasında cinsiyete göre ayırın, böylece genotiplemeden önce çiftleşmezler ve yaşla eşleşen, vahşi tip kontrol sivrisineklerinin referanslar ve geri dönüşler için kullanılacağından emin olun. Aynı şekilde seks ayır.
2. Gerekli malzemeleri toplayın (Şekil 2A) ve genotipli olmak için kişi başına 0,5 μL DNA salınım reaktifi ve 20 μL seyreltme tamponu (gDNA serbest bırakma kitinden) ile 96 kuyu PCR plakası hazırlayın ve buz üzerinde bırakın. NTC için iki reaksiyon ayır.
3. Sivrisinek şişeleri (Drosophila şişeleri) için bir tepsi etiketleyin, böylece 96 plakadaki her kuyu tepsideki ilgili sivrisinek şişesine karşılık gelir.
4. _G1 sivrisineklerini _CO2 ile uyuşturun ve yatıştırıcı tutmak için cam bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 2C, D). Anestezi edin ve 8 yabani tip sivrisinekleri ikinci bir Petri kabına yerleştirin.
5. Bir çift cımbızı% 70 etanol ile silin ve sivrisinek arka ayaklarından birini çıkarın (Şekil 2E, F).
6. Bacağı DNA salınımlı reaktif çözeltisine batırın, sivrisinekleri ilgili şişeye yerleştirin ve bir süngerle kapatın (Şekil 2G, H).
7. Cımbızı tekrar% 70 etanol ile silin ve bacağı bir sonraki sivrisinekten çıkarmaya devam edin. 96 kuyu plakası tamamlanana kadar 2,5-2,7 arası adımları yineleyin.
   NOT: Cımbızı% 70 etanol ile silmek önemlidir. Bu, DNA çapraz kontaminasyonlarını en aza indirir.
8. Plakayı optik pcr plaka contası (Şekil 2I) ile kapatın ve bacakları oda sıcaklığında (RT) içeren 96 kuyu plakasını 2-5 dakika ve ardından 98 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın. PCR karışımını hazırlarken plakanın RT'ye soğumasını bekleyin.
   NOT: Tüm işlem genellikle 3-4 saat sürer. Sivrisineklerin beklenen süreden (özellikle ≥1 gün) daha fazla süre şişelerde tutulması gerekiyorsa, uzun kuluçkalar sırasında sivrisineklerin hayatta kalmasını sağlamak için her sivrisinekle küçük bir parça kuru üzüm (veya şeker ve su kaynağı) yerleştirin.

3. HRMA

1. PCR gerçekleştirin.
   1. Her reaksiyon başına aşağıdaki bileşenleri içeren bir ana karışım hazırlayın: 10 μL 2x tampon (gDNA serbest bırakma kitinden), her astarın 0,5 μM'si, EvaGreen boyasının 1 μL'si, 0,4 μL polimeraz (gDNA serbest bırakma kitinden) ve moleküler dereceli su ile 19 μL'ye kadar tamamlayın.
   2. Çok kanallı bir pipet kullanarak, ana karışımın 19 μL'lik kısmını her kuyuya aktarın. Bölüm 2'de hazırlanan sivrisinek DNA'sını içeren DNA salınım çözeltisinin 1 μL'lik kısmını plakaya aktarın (Şekil 3A). Plakayı optik PCR plaka contası ile kapatın.
   3. PCR'yi bisiklet parametrelerini izleyerek gerçekleştirin: 5 dakika için 98 °C, 10 s için 98 °C'nin 39 döngüsü, 30 s için seçilen tavlama sıcaklığı (72 °C); 2 dakika boyunca son uzatma 72 °C.
2. Parametreleri izleyerek termal eriyik profilleri oluşturun: 1 dakika boyunca denatürasyon adımı 95 °C, 1 dakika boyunca 60 °C tavlama, 0,2 °C artışlarla 75 °C ile 95 °C arasında erime eğrisi algılama, her sıcaklıkta 10 s tutma süresi. CFX96 Gerçek Zamanlı Sistemi kullanılarak yürütülen HRMA için yazılım kurulumunun ayrıntılı açıklaması için Ek Malzeme ve Ek Şekil S1-S5'e bakın.
3. Eriyik profillerini inceleyin (Şekil 3B). Başvuru kümesine vahşi tür denetimi atayın.
   NOT: Yazılım ( bkz. Malzeme Tablosu) verileri otomatik olarak normalleştirir ve farklı erime eğrileri için renklerle kümeler belirler.
4. Farklı kümeleri 96 kuyulu şablonda karşılık gelen renklerle işaretleyin (Şekil 3C).
5. İlgi kıvrımları olan bireyleri seçin, tüplerden çıkarın ve geriye dönün (Şekil 3D). Çiftmiş dişileri kanla besleyin ve _G2 yumurtalarını toplayın.

4. Sanger dizileme ile sıra doğrulaması

1. PCR ürününü, artık PCR astarlarını bozmak için bir enzim kullanarak ve fazla dNTP'leri defosforilasyon yaparak seçilen sivrisineklerle (bölüm 3.1'de hazırlanan plakadan) kuyulardan arındırın. Alternatif olarak, herhangi bir sütun temizleme kiti kullanın ve örnekleri sıralamaya devam edin.
   NOT: PCR ürün boyutu küçük olduğunda (≤200 bp) doğrudan sıralama daha zor olabilir. Bu gibi durumlarda, hedef bölgeyi (≥250 bp) kapsayan daha büyük parçaları yükseltmek ve 96 kuyu plakasındaki DNA'yı kullanarak PCR ile yükseltmek için astarlar tasarlayın (adım 2.2).
2. İzleme görüntüleyici yazılımını kullanarak indelleri analiz edin ve tanımlayın (Şekil 4). Alternatif olarak, Poly Peak Parser ^software20 heterozygöz bireylerdeki mutasyonu tespit etmenize yardımcı olabilir.
   1. Poly Peak Parser web sitesine gidin, Gözat menüsündeki mutant bireylerden sırayı seçin ve referans sırasını kopyalayıp kutuya yapıştırın.
      NOT: Alternatif alel ve referans arasındaki hizalama otomatik olarak ekranın sağ tarafında görünecektir.

Sonuçlar

AaeZIP11 (putatif demir ^{taşıyıcı21}) ve miyo-fem (uçuş kaslarıyla ilgili kadın taraflı bir miyosin ^geni13) genlerinde mutasyon içeren sivrisinekler CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak, HRMA kullanılarak genotiplenmiş ve sırayla doğrulanmış olarak elde edilmiştir (Şekil 5). Şekil 5A ve Şekil 5C, sırasıyla AaeZIP11 ve myo-fem mut...

Tartışmalar

Yüksek çözünürlüklü eriyik analizi, CRISPR/Cas9 teknolojisi tarafından üretilen indellerin vektör sivrisinek Ae. aegypti'de tanımlanması için basit ve hızlı bir çözüm sunar. Uçuş kasından demir metabolizmasına ve daha fazla ^13,14'e kadar çok çeşitli genler için mutasyona uğramış sivrisineklerin genotiplemesini sağlayan esneklik sağlar. HRMA, numune toplamadan son analizlere kadar sadece birkaç saat içinde gerçekleştiril...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol			70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates	VWR	82006-636	For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates			House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96	Bio Rad		PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs	VWR	490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit	New England Biolabs	E1050S
Glass Petri Dish	VWR	89001-246	150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates	Bio-rad	HSP9665	For HRMA
Multi-channel pipettor (P10)	Integra Biosciences	4721
Multi-channel pipettor (P300)	Integra Biosciences	4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific	VWR	37000-548	To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape	Bio-rad	2239444	To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools)	Thermo Fisher	F140WH	For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers	Genesee	59-128W
Precision Melt Analysis Software	Bio Rad	1845025	Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro	DNAstar Lasergene software		For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor	Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm	WPI	14098
White foam plugs	VWR	60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee	32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue	Genesee	59-164B