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摘要

细菌糖原结构受提取方法的极大影响，这可能导致分子降解和/或采样偏倚。必须开发方法来最大限度地减少这些问题。在这里，使用大小分布和链长分布作为最小化提取伪影的关键标准，比较了四种提取方法。

摘要

目前存在多种糖原提取方法，它们要么破坏了糖原的空间结构，要么仅部分提取了糖原，导致糖原精细分子结构的表征存在偏差。为了了解糖原结构的动态变化和糖原颗粒在细菌中的多功能功能，必须以最小的降解分离糖原。在本研究中， 通过糖密度 梯度超速离心 （SDGU-CW） 使用冷水 （CW） 沉淀证明了一种温和的糖原分离方法。还采用传统的三氯乙酸 （TCA） 法和氢氧化钾 （KOH） 法进行比较。本研究使用一种常用的实验室菌株大肠 杆菌 BL21 （DE3） 作为模式生物进行演示。使用不同方法提取糖原颗粒后，通过粒径分布的尺寸排阻色谱 （SEC） 和线性链长分布的荧光团辅助毛细管电泳 （FACE） 分析和比较其结构。分析证实 ，通过 SDGU-CW 提取的糖原降解最小。

引言

糖原是一种高度支化的多糖，由葡萄糖基残基和少量但大量的蛋白质组成，其中所有葡萄糖基残基都通过线性链中的 α-1,4-糖苷键和支化点的 α-1,6-糖苷键连接在一起1。糖原颗粒的结构通常分为三个层次结构：1） 短链低聚物，2） 球形β颗粒（直径 ~20 nm），以及 3） 由β颗粒聚集在一起的大玫瑰花结状α颗粒，其直径范围大约可达 300 nm。最近发现糖原α颗粒在真核生物中有两种结构状态，即易碎状态和稳定状态。在这里，脆性是指在 DMSO2 等离液剂存在下，较大的 α 颗粒解离成较小的β颗粒。进一步的分析发现，糖尿病肝脏中的糖原α颗粒始终是脆弱的3，并且脆弱的 α 颗粒的降解速度比稳定的 α 颗粒快得多4。因此，糖原结构脆性可能会加剧糖尿病患者的高血糖状况 2,4，这使得脆弱的 α 颗粒在分子水平上成为糖尿病的潜在病理生物标志物。然而，原核生物中存在糖原α颗粒仅零星报道5，并且没有关于细菌中糖原α颗粒的两种不同结构状态的报道。

为了了解细菌糖原颗粒的生理功能，必须确定糖原分子的精细结构，这需要以最大产量和最小降解率分离糖原1。到目前为止，已经开发了各种糖原提取技术，包括但不限于热水提取、三氯乙酸 （TCA） 提取和热碱性（氢氧化钾，KOH）提取6。此外，还报道了另一种常用于真核糖原分离的方法，即糖密度梯度超速离心 （SDGU） 方法，用于在瘤胃硒单胞菌和产琥珀纤维杆菌中分离细菌糖原 7,8。尽管这些方法的优缺点在真核生物研究中已被广泛讨论 9,10，但从糖原颗粒结构的角度来看，很少有通过不同提取方法在细菌中分离出糖原精细结构的比较研究。

在本研究中，通过使用大 肠杆菌 BL21 （DE3） 作为模式生物解决了这个问题。比较了 TCA 沉淀热水萃取 （TCA-HW）、TCA 沉淀冷水萃取 （TCA-CW）、30% 热 KOH 溶液萃取 （KOH-HW） 和蔗糖密度梯度超速离心冷水萃取 （SDGU-CW） 四种糖原萃取方法。然后 通过 尺寸排阻色谱 （SEC） 测量糖原粒度分布，同时 通过 荧光团辅助碳水化合物电泳 （FACE） 检测链长分布，这两种方法都用于评估提取方法的质量。此外，通过比较常用离液剂二甲基亚砜 （DMSO） 处理前后的粒度分布，比较了各种提取方法之间细菌糖原α颗粒的稳定性和脆性。糖原提取和结构表征的详细程序如下。综上所述，SDGU-CW 方法在糖原结构完整性方面具有最佳的整体效果，因此在未来的相关研究中推荐用于细菌糖原提取。

研究方案

1. 细菌培养和采集

  1. 通过接种无菌 LB 琼脂平板（10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L NaCl 和 15 g/L 琼脂），从细菌甘油原液 （-80 °C） 中复苏大肠 杆菌 BL21（DE3）。将板放入标准培养箱中，并在 37 °C 下培养过夜。
  2. 拾取单个菌落并将其接种到 10 mL 无菌 LB 液体培养基（10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物和 10 g/L NaCl）中。 通过 涡旋充分混合，并在 37 °C 下培养过夜，并以 220 rpm 振荡。
    注：除非另有说明，否则所有液体培养条件均为 37 °C，振荡速率为 220 rpm。
  3. 将 1 mL 过夜 大肠杆菌 培养物转移到 100 mL 无菌 LB 液体培养基中并培养 5 小时。将 50 mL 转移至 1 L 含有 0.8% D-（+）-葡萄糖的 1x M9 基础培养基（3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、6.78 g/L Na2HPO4 和 1 g/L NH4Cl）中。充分混合，培养 20 小时。
    注：将 1x M9 基础培养基和葡萄糖分别灭菌，然后在无菌冷却至室温时混合。
  4. 培养 20 小时后，在 4 °C 下以 6,000 x g 离心细菌溶液 15 分钟。 丢弃上清液。将细胞沉淀在 -80 °C 下储存过夜，然后冷冻干燥沉淀。
  5. 将冻干的细菌粉末密封并储存在冰箱 （-20 °C） 中以备后用。

2. 糖原提取

  1. 三氯乙酸沉淀热水萃取 （TCA-HW）
    1. 精密称取 500 mg 冻干大 肠杆菌 BL21 （DE3） 粉末，并将其重悬于 20 mL 冰冷的 0.05 M 三乙醇胺 （TEA） 缓冲液中。使用超声波细胞破碎机（25% 能量，4 °C）破坏细菌细胞 3 分钟（30 秒工作周期和 2 秒间隔）。确保溶液中没有明显的颗粒。
      注意：细胞破碎是在冰上进行的。通过添加 HCl 将 TEA 缓冲液的 pH 值调节至 pH 7，并在室温下储存。
    2. 将所有细菌匀浆转移到两个 10.4 mL 超速离心管（10 mL/管）中。用去离子水填充管至顶部，并在 4 °C 的超速离心机中以 104,000 x g 离心 90 分钟。丢弃上清液。
    3. 加入 2 mL 去离子水，使沉淀重悬于每根试管中。将悬浮液转移至 50 mL 离心管中，加入去离子水至最终体积为 20 mL。加热并煮沸 5 分钟，使所有蛋白质变性。
    4. 将悬浮液以 18,000 x g 离心 10 分钟并保留上清液 （S1）。以与步骤 2.1.3 相同的方式处理沉淀物。将新的上清液 （S2） 与 S1 合并。
    5. 向上清液 （S1+S2） 中加入 50% TCA（0.1 体积），并将混合物置于冰上 10 分钟以沉淀 DNA、RNA、蛋白质等大分子。将混合物以 18,000 x g 离心 10 分钟，并将上清液与 1.5 体积的无水乙醇混合。
      注：TCA 的浓度为 50% v/v。存放时，请避光保存。
    6. 在冰上沉淀糖原 20 分钟，然后以 18,000 x g 离心 10 分钟。倒出上清液。
    7. 将沉淀溶解在 5 mL ddH2O 中，然后加入 5 mL 冰冷的无水乙醇。将溶液在 4 °C 下孵育过夜，并以 18,000 x g 离心 10 分钟。弃去上清液，保留沉淀。
    8. 按照步骤 2.1.7 中的步骤再重复两次 “wash and precipitation” 步骤。
    9. 最后，将沉淀的糖原溶解在 2 mL 试管中的 400 μL ddH2O 中，在 -80 °C 下预冻，并冷冻干燥以获得干燥的糖原粉末。
  2. 三氯乙酸沉淀冷水萃取 （TCA-CW）
    注意：TCA-CW 方法与 TCA-HW 方法相同，不同之处在于，弃去上清液后，处理沉淀而不煮沸（参见步骤 2.1.3）并将其重悬于 20 mL 含有 1 mg/mL 蛋白酶抑制剂混合物的 ddH2O 中。
    1. 要制备 1 mg/mL 蛋白酶抑制剂混合物溶液，将 50 mg 蛋白酶抑制剂混合物溶解在 1 mL 去离子水中，并以 50：1 的比例稀释（去离子水：蛋白酶抑制剂混合物溶液）。
  3. 使用蔗糖密度梯度超速离心 （SDGU-CW） 进行冷水萃取
    1. 将 1 g 冻干大 肠 杆菌粉末溶于 4 mL 糖原提取缓冲液 （GEB） 中，并加入 1 mg/mL 蛋白酶抑制剂混合物并匀浆。
      注：GEB 由 50 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM NaF 和 5 mM 焦磷酸钠组成。需要用 HCl 将 GEB 的 pH 值调节至 8。
    2. 使用超声波细胞破碎机（25% 能量，4 °C）破坏细菌细胞 3 分钟（8 秒工作周期和 9 秒间隔）。确保整个过程在冰上进行。超声化后，将细菌匀浆转移到离心管中，用 GEB 填充至最终体积为 10 mL，然后涡旋管混合。
      注意：请勿匀浆时间过长，因为产生的热量可能会降解糖原。
    3. 在 4 °C 下以 6,000 x g 离心 10 分钟。 将上清液转移到 10.4 mL 超速离心管中，用 GEB 填充管至顶部，然后在 4 °C 下以 360,000 x g 离心 2 小时。
      注意： 确保管子已装满并且不存在气泡。
    4. 离心后弃去上清液，用 2 mL 去离子水重悬沉淀物。
    5. 在新的超速离心管中，将 4 mL 75% 蔗糖溶液与 4 mL 37.5% 蔗糖溶液缓慢分层。然后，将步骤 2.3.4 中获得的悬浮液铺在蔗糖溶液上，并加满去离子水（参见 图 1）。
      注：蔗糖浓度为 75% [v/v] 和 37.5% [v/v]。进行蔗糖密度梯度时要小心，并确保两种蔗糖溶液之间存在可观察到的分层。此外，请确保超速离心管中没有气泡。
    6. 在 4 °C 下以 360,000 x g 离心 2.5 小时，弃去上清液。将沉淀溶解在 200 μL 去离子水中。加入 800 μL 无水乙醇用于糖原沉淀。
    7. 在 -20 °C 下沉淀糖原过夜。在 4 °C 下以 4,000 x g 离心 10 分钟，然后弃去上清液。
    8. 将所得沉淀溶解在 2 mL 试管中的 400 μL ddH2O 中，在 -80 °C 下预冻，然后冷冻干燥以获得干燥的糖原粉末。将干燥的糖原粉末保存在 4 °C 用于结构分析。
      注意：详细过程如图 1 所示。
  4. 热 30% 氢氧化钾溶液萃取 （KOH-HW）
    1. 将冻干的大 肠杆菌 粉末 （50 mg） 在 1 mL 30% [w/v] KOH 中煮沸 1 小时。
    2. 加入含有 15 mM LiCl 的 67% [v/v] 乙醇，在 -20 °C 下沉淀至少 1 小时。将样品在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 20 分钟。
      注：含 15 mM LiCl 的 67% [v/v] 乙醇含有 0.6358 g LiCl、67 mL 无水乙醇和 33 mL 去离子水。
    3. 将沉淀重新溶解在 1 mL ddH2O 中，并在 95 °C 下加热 10 分钟，间歇搅拌。
    4. 如步骤 2.4.2 中所述，再重复乙醇沉淀步骤三次。将最终沉淀重新溶解在 2 mL 管中的 400 μL ddH2O 中，在 -80 °C 下预冻，然后冷冻干燥以获得干燥的糖原粉末。

3. 糖原结构测定

  1. 透射电子显微镜 （TEM）
    1. 将糖原粉末重悬于终浓度为 1 mg/mL 的 50 mM Tris 缓冲盐水 （pH 7） 中。
    2. 将悬浮液稀释 10 倍，然后将稀释的悬浮液涂抹在辉光放电 400 目铜网格上。
    3. 2 分钟后，使用滤纸从网格上吸出多余的样品，并用 2-3 滴 1% 乙酸铀酰染色网格。
    4. 使用在 75 kV 下运行的透射电子显微镜检查制剂。
  2. 体积排阻色谱 （SEC）
    1. 流动相的制备：在去离子水中制备 0.02% （w/w） 叠氮化钠和 50 mM 硝酸钠溶液，并通过 0.45 μm 滤膜过滤。使用超声波振荡水浴对溶液进行超声处理 15 分钟以上，以去除气泡。
    2. 样品制备：使用流动相溶解糖原粉末，使最终浓度为 1 mg/mL。将溶液在 80 °C 下在热混合器中孵育过夜。在室温下以 6,000 x g 的速度离心溶解的样品 10 分钟，然后将上清液转移至标准 SEC 样品瓶中。
    3. DMSO 处理的糖原样品的制备
      1. 将 1 mg 糖原粉末溶解在 300 μL DMSO 中，并在 80 °C 下在热混合器中孵育过夜。加入 4 倍体积的乙醇以沉淀糖原，并以 6,000 x g 离心溶液。
      2. 用乙醇洗涤沉淀两次，将沉淀溶解在 ddH2O 中并冻干。
      3. 如上所述制备样品 ，通过 SEC 分析冻干糖原粉末。
    4. 使用带有预柱以及 1000 和 10000 柱的 SEC 系统来分析糖原粒度分布。将色谱柱保持在 80 °C，流速为 0.3 mL/min。
  3. 荧光团辅助碳水化合物电泳 （FACE）
    1. 糖原去支化
      注：当使用 FACE 检测链长分布 （CLD） 时，所有待测样品都需要进行去支化预处理。
      1. 向试管中加入 0.5 mg 糖原粉末、90 μL 热水 （90 °C）、1.5 μL NaN3 溶液、3.5 μL 异淀粉酶 （200 U/mL） 和 8 μL 乙酸-乙酸钠缓冲液 （pH 3.5）。
        注：添加异淀粉酶以特异性切割待测样品的支链。异淀粉酶是一种去支酶，可以特异性地破坏 α-（1-6） 键而不破坏 α-（1-4） 键，因此它可以特异性地裂解糖原侧链，而不会破坏主链的结构。
      2. 将混合物在 37 °C 下在热混合器中孵育 3 小时。用 8 μL 0.1 M NaOH 溶液使 pH 中性后，将混合物在 80 °C 下在热混合器中孵育 1 小时。
      3. 向混合物中加入 4 倍体积的无水乙醇以沉淀糖原。然后，在室温下以 6,000 x g 离心 10 分钟。用乙醇洗涤沉淀两次，将沉淀溶解在 ddH2O 中并冻干。
    2. 荧光溶液的制备
      1. 将 APTS（8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐）试剂瓶（每瓶含有 5 mg APTS）以 4,000 x g 离心 2 分钟。加入 50 μL 15% 乙酸溶液溶解粉末，充分混合，并在室温下以 4,000 x g 离心 2 分钟，得到 0.2 M APTS 乙酸溶液。
        注意：将 APTS 溶液保存在 -20°C.It 的冰箱中，一旦打开，必须在两周内完全使用。否则，它将处于停用状态。APTS 是一种常用的带负电荷的染料，可与糖原链的还原端结合。由于具有不同聚合度 （DP） 的链都只带有一个负电荷，因此 FACE 可以根据它们不同的质荷比将它们分开。通过这种方式，荧光检测器可以检测到不同 DP 值的信号。
    3. 将去支链的糖原转移到试管中，加入 1.5 μL APTS 溶液和 1.5 μL 氰基氢化钠溶液。在 60 °C 下避光孵育 1.5 小时。加入 80 μL 去离子水，在室温下以 4,000 x g 离心 10 分钟，并保留上清液。
    4. 通过在 0.5 psi（高于大气压 3.4 kPa）下进样 3 秒，将样品引入毛细管电泳系统。
      注：在 25 °C 下，通过 30 kV 的外加电压和大约 14 mA 的电流分离荧光标记的线性葡聚糖。 峰面积给出了不同质量数的葡聚糖的相对量（相邻峰中葡聚糖的聚合度 （DP） 相差 1 DP）。样品温度保持在 18 °C。

结果

糖原颗粒的粒度分布
一系列研究表明，糖尿病肝脏中的糖原α颗粒很脆弱，很容易在氢键干扰物 DMSO11、12、13、14 中分解。本研究测试了通过四种不同方法提取的细菌糖原的粒度和结构稳定性如何变化。四种方法的所有糖原样品分别用水 （蓝色曲线） 和 DMSO （...

讨论

糖原是一种重要的能量储备，已在许多细菌中被发现16。为了剖析糖原颗粒的生理功能，必须更好地了解糖原分子的精细结构。到目前为止，已经开发了多种从细菌培养物中提取糖原的方法。然而，从不同的提取方法观察到糖原颗粒的不同尺寸分布，这表明糖原结构受损。因此，有必要比较和标准化提取程序，以确保来自不同研究的糖原结构具有可比性?...

披露声明

作者没有利益冲突。

致谢

我们非常感谢昆士兰大学和扬州大学的 Robert G. Gilbert 教授，他们提供的见解和专业知识极大地帮助了这项研究的完成。我们感谢国家自然科学基金（第 31900022 号、第 32171281 号）、江苏省自然科学基金（第BK20180997）、徐州医科大学青年科技创新团队（No.TD202001） 和江苏青兰项目 （2020）。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC systemAgilent1260 infinity IIParticle size distribution
Analytical columnPSS10-1000-
CentrifugeEppendorf5420-
Filter membraneCambioKm-0220-
Fluorescence-assisted capillary electrophoresis systemBeckman Coulter-Chain length distribution
Freeze dryerXinzhiSCIENTZ-10NLyophilization of bacteria and glycogen
FreezerThermo FisherForma 900Sample storage
Guard columnPSSSUPPERMA-
IncubatorThermo FisherPR505750R-CN-
Low-speed large-capacity centrifugeHexiHR/T20MMSample centrifugation
Multiskan FC microplate readerThermo Fisher1410101-
Optima XPN ultracentrifugeBeckmanXPN-100/90/80For glycogen
OscillatorXinbaoSHZ-82-
PA-800 Plus SystemBeckman CoulterA66528-
pH meterMettler ToledoFE28 -TRIS-
Refractive index detectorWyattOptilab T-rEX-
RefrigeratorHaierBCD-406WDPD-
ThermomixerShanghai JingxinJXH-100Sample incubation
Transmission electron microscopeHitachi CorporationH-7000Glycogen particle morphology
Ultracentrifuge tubeBeckman355651-
Ultrasonic cell crusherNingbo XinzhiScientz-IID Bacteria disruptor
Ultrasonic oscillating water bathJietuoJT-1027HTD-
Vortex mixerTiangenOSE-VX-01-
Water systemMerck MilliporeH2O-MM-UV-TDeionized water
Material
8-Aminopyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid Trisodium SaltSigma-Aldrich196504-57-1-
Absolute ethanolGuoyao10009228-
Agar powderSolarbioA1890-
Alpha-amylaseMegazymeE-BLAAM-40ML-
AmyloglucosidaseMegazymeE-AMGDF-40ML-
cOmplete MiniRoche4693159001-
D-(+)GlucoseSigma-AldrichG8270-1kg-
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)MegazymeK-GLUCGlycogen quantification
Dimethyl sulfoxideVicmedVic147Chaotropic agent
E. coli BL21(DE3)TiangenCB105-02-
Ethylene diamine tetra-acetic acidVicmedVic1488-
Glacial acetic acidGuoyao10000218-
GlycerolGuoyao10010618Bacterial storage
Hydrochloric acidGuoyao10011008-
Hydroxymethyl aminomethaneSigma-AldrichV900483-500g-
IsoamylaseMegaZyme9067-73-6Glycogen debranch
Lithium chlorideSigma-Aldrich62476-100g-
M9, Minimal Salts, 5×Sigma-AldrichM6030-1kgBacterial culture
Potassium hydroxideGuoyao10017008-
Pullulan standardPSS--
Sodium acetate trihydrateGuoyao10018718-
Sodium azideSigma-Aldrich26628-22-8-
Sodium chlorideGuoyao10019318Bacterial culture
Sodium cyanoborohydrideHuaweiruikehws001297-
Sodium diphosphateSigma-Aldrich71515-250g-
Sodium FluorideMacklinS817988-250g-
Sodium hydroxideGuoyao10019762-
Sodium nitrateGuoyao10019928-
Sodium pyrophosphateSigma-AldrichV900195-500g-
SucroseGuoyao10021463-
Trichloroacetic acidGuoyao40091961-
TryptoneOxoidLP0042Bacterial culture
Yeast ExtractOxoidLP0021Bacterial culture

参考文献

  1. Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
  2. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  3. Hu, Z., et al. Diurnal changes of glycogen molecular structure in healthy and diabetic mice. Carbohydrate Polymers. 185, 145-152 (2018).
  4. Nawaz, A., Zhang, P., Li, E., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. The importance of glycogen molecular structure for blood glucose control. iScience. 24 (1), 101953 (2021).
  5. Rashid, A. M., et al. Assembly of α-glucan by GlgE and GlgB in mycobacteria and streptomycetes. Biochemistry. 55 (23), 3270-3284 (2016).
  6. Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14 (2020).
  7. Kamio, Y., Terawaki, Y., Nakajima, T., Matsuda, K. Structure of glycogen produced by Selenomonas ruminantium. Agricultural and Biological Chemistry. 45 (1), 209-216 (1981).
  8. Gong, J., Forsberg, C. W. Separation of outer and cytoplasmic membranes of Fibrobacter succinogenes and membrane and glycogen granule locations of glycanases and cellobiase. Journal of Bacteriology. 175 (21), 6810-6821 (1993).
  9. Mojibi, N. Comparison of methods to assay liver glycogen fractions: the effects of starvation. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (3), (2017).
  10. Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. The Journal of Biological Chemistry. 239, 4021-4026 (1964).
  11. Tan, X., et al. Proteomic investigation of the binding agent between liver glycogen beta particles. ACS Omega. 3 (4), 3640-3645 (2018).
  12. Hu, Z., et al. Diurnal changes of glycogen molecular structure in healthy and diabetic mice. Carbohydrate Polymers. 185, 145-152 (2018).
  13. Sullivan, M. A., Harcourt, B. E., Xu, P., Forbes, J. M., Gilbert, R. G. Impairment of liver glycogen storage in the db/db animal model of type 2 diabetes: a potential target for future therapeutics. Current Drug Targets. 16 (10), 1088-1093 (2015).
  14. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  15. Sullivan, M. A., et al. Molecular structural differences between type-2-diabetic and healthy glycogen. Biomacromolecules. 12 (6), 1983-1986 (2011).
  16. Wang, L., et al. Systematic analysis of metabolic pathway distributions of bacterial energy reserves. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (8), 2489-2496 (2019).

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