Bakteriyel Glikojen Partiküllerinin Moleküler Yapı Karakterizasyonu için Bozunmayan Bir Ekstraksiyon Yöntemi

Özet

Bakteriyel glikojen yapısı, moleküler bozunma ve/veya önyargılı örnekleme ile sonuçlanabilecek ekstraksiyon yöntemlerinden büyük ölçüde etkilenir. Bu sorunları en aza indirecek yöntemler geliştirmek şarttır. Burada, ekstraksiyon artefaktlarını en aza indirmek için temel kriterler olarak boyut dağılımı ve zincir uzunluğu dağılımı kullanılarak dört ekstraksiyon yöntemi karşılaştırılmıştır.

Özet

Şu anda, glikojen mekansal yapısına zarar veren veya glikojeni sadece kısmen ekstrakte eden, glikojen ince moleküler yapısının önyargılı karakterizasyonuna yol açan çeşitli glikojen ekstraksiyon yöntemleri vardır. Bakterilerde glikojen yapılarının dinamik değişikliklerini ve glikojen partiküllerinin çok yönlü işlevlerini anlamak için, glikojeni minimum bozunma ile izole etmek esastır. Bu çalışmada, şeker yoğunluğu gradyan ultra santrifüjleme (SDGU-CW) yoluyla soğuk su (CW) çökeltme kullanılarak hafif bir glikojen izolasyon yöntemi gösterilmiştir. Karşılaştırma için geleneksel trikloroasetik asit (TCA) yöntemi ve potasyum hidroksit (KOH) yöntemi de uygulanmıştır. Yaygın olarak kullanılan bir laboratuvar türü olan Escherichia coli BL21 (DE3), bu çalışmada gösteri amacıyla model organizma olarak kullanılmıştır. Glikojen partikülleri farklı yöntemler kullanılarak ekstrakte edildikten sonra, yapıları analiz edildi ve partikül boyutu dağılımı için boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve doğrusal zincir uzunluğu dağılımları için florofor destekli kapiler elektroforez (FACE) yoluyla karşılaştırıldı. Analiz, SDGU-CW yoluyla ekstrakte edilen glikojenin minimum bozunmaya sahip olduğunu doğruladı.

Giriş

Glikojen, glukozil kalıntılarından ve ayrıca küçük fakat önemli miktarda proteinden oluşan, tüm glukozil kalıntılarının doğrusal zincirlerde α-1,4-glikosidik bağlar ve dallanma noktalarında α-1,6-glikosidik bağlar yoluyla birbirine bağlandığı oldukça dallı bir polisakkarittir¹. Glikojen parçacıklarının yapısı genellikle üç hiyerarşiye ayrılır: 1) kısa zincirli oligomerler, 2) küresel β parçacıkları (~ 20 nm çapında) ve 3) çapı kabaca 300 nm'ye kadar değişen β parçacıkları tarafından bir araya getirilen büyük rozet şeklindeki α parçacıkları. Son zamanlarda, glikojen α parçacıklarının ökaryotlarda kırılgan bir durum ve kararlı bir durum olmak üzere iki yapısal duruma sahip olduğu bulunmuştur. Burada kırılganlık, DMSO² gibi kaotropik bir ajanın varlığında daha büyük α parçacıklarının daha küçük β parçacıklarına ayrışması anlamına gelir. Daha ileri analizler, diyabetik karaciğerdeki glikojen α partiküllerinin sürekli olarak kırılgan^{olduğunu 3} ve kırılgan α partiküllerinin kararlı α partiküllerinden⁴ çok daha hızlı bozunduğunu buldu. Bu nedenle, glikojen yapısal kırılganlığı diyabet ^2,4'te hiperglisemik durumları şiddetlendirebilir, bu da kırılgan α-partikülünü moleküler düzeyde diyabetin potansiyel bir patolojik biyobelirteci haline getirir. Bununla birlikte, prokaryotlarda glikojen α partiküllerinin varlığı sadece sporadik olarak rapor edilmiştir⁵ ve bakterilerdeki glikojen α partiküllerinin iki farklı yapısal durumu hakkında bir rapor yoktur.

Bakteriyel glikojen partiküllerinin fizyolojik fonksiyonlarını anlamak için, maksimum verim ve minimum bozunma ile glikojen izolasyonu gerektiren glikojen moleküllerinin ince yapısını belirlemek esastır¹. Şimdiye kadar, glikojen ekstraksiyonu için sıcak su ekstraksiyonu, trikloroasetik asit (TCA) ekstraksiyonu ve sıcak alkalin (potasyum hidroksit, KOH) ekstraksiyonu dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli teknikler geliştirilmiştir⁶. Ayrıca, ökaryotik glikojen izolasyonu için yaygın olarak kullanılan bir başka yöntem olan şeker yoğunluğu gradyan ultra santrifüjleme (SDGU) yöntemi de Selenomonas ruminantium ve Fibrobacter succinogenes ^7,8'de bakteriyel glikojen izolasyonu için bildirilmiştir. Bu yöntemlerin artıları ve eksileri ökaryotik çalışmalarda geniş çapta tartışılmış olsa da ^9,10, bakterilerde farklı ekstraksiyon yöntemleriyle izole edilen glikojen ince yapıların glikojen partikül yapıları perspektifinden nadiren karşılaştırmalı çalışmaları vardır.

Bu çalışmada bu konu model organizma olarak Escherichia coli BL21(DE3) kullanılarak ele alınmıştır. TCA ile çökeltilmiş sıcak su ekstraksiyonu (TCA-HW), TCA ile çökeltilmiş soğuk su ekstraksiyonu (TCA-CW), sıcak% 30 KOH çözeltisi ekstraksiyonu (KOH-HW) ve sükroz yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme (SDGU-CW) kullanılarak soğuk su ekstraksiyonu olmak üzere toplam dört glikojen ekstraksiyon yöntemi karşılaştırıldı. Glikojen partikül boyutu dağılımı daha sonra boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile ölçülürken, zincir uzunluğu dağılımı, her ikisi de ekstraksiyon yöntemlerinin kalitesini değerlendirmek için kullanılan florofor destekli karbonhidrat elektroforezi (FACE) yoluyla tespit edildi. Ek olarak, bakteriyel glikojen α partiküllerinin stabilitesi ve kırılganlığı, yaygın olarak kullanılan kaotropik ajan olan dimetil sülfoksit (DMSO) ile muameleden önce ve sonra partikül boyutu dağılımı karşılaştırılarak çeşitli ekstraksiyon yöntemleri arasında da karşılaştırıldı. Glikojen ekstraksiyonu ve yapısal karakterizasyonu için ayrıntılı prosedürler aşağıda sunulmuştur. Özetle, SDGU-CW yöntemi, glikojen yapısal bütünlüğü açısından en iyi genel etkiye sahiptir ve bu nedenle, gelecekteki ilgili çalışmalarda bakteriyel glikojen ekstraksiyonu için önerilmektedir.

Protokol

1. Bakteri kültürü ve toplanması

1. Bakteriyel gliserol stoğundan (-80 °C) steril LB agar plakası (10 g / L tripton, 5 g / L maya özütü, 10 g / L NaCl ve 15 g / L agar) ile resüsitat E. coli BL21 (DE3). Plakayı standart bir kuluçka makinesine koyun ve gece boyunca 37 °C'de yetiştirin.
2. Tek bir koloniyi alın ve 10 mL steril LB sıvı ortama (10 g/L tripton, 5 g/L maya özütü ve 10 g/L NaCl) aşılayın. 220 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de gece boyunca girdap ve kültür yoluyla iyice karıştırın.
   NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm sıvı kültür koşulları 220 rpm çalkalama hızıyla 37 °C idi.
3. Gece boyunca 1 mL E. coli kültürünü 100 mL steril LB sıvı ortama aktarın ve 5 saat boyunca kültürleyin. % 0.8 D- (+) - glikoz içeren 50 mL ila 1 L 1x M9 minimal ortamı (3 g / L KH₂PO₄, 0.5 g / L NaCl, 6.78 g / L Na₂HPO₄ ve 1 g / L NH₄Cl) aktarın. İyice karıştırın ve 20 saat boyunca kültürleyin.
   NOT: 1x M9 minimum ortam ve glikoz ayrı ayrı sterilize edildi ve daha sonra aseptik olarak oda sıcaklığına soğutulduğunda karıştırıldı.
4. 20 saat kültürlendikten sonra, bakteri çözeltisini 6.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücre peletini gece boyunca -80 °C'de saklayın ve ardından peleti dondurarak kurutun.
5. Liyofilize bakteri tozunu kapatın ve daha sonra kullanmak üzere bir buzdolabında (-20 °C) saklayın.

2. Glikojen ekstraksiyonu

1. Trikloroasetik asit çökeltilmiş sıcak su ekstraksiyonu (TCA-HW)
   1. 500 mg dondurularak kurutulmuş E. coli BL21 (DE3) tozunu hassas bir şekilde tartın ve 20 mL buz gibi soğuk 0.05 M trietanolamin (TEA) tamponunda yeniden süspanse edin. Bakteri hücrelerini 3 dakika (30 sn çalışma döngüsü ve 2 sn aralıklarla) bozmak için ultrasonik hücreli kırıcı (%25 enerji, 4 °C) kullanın. Solüsyonda belirgin topaklar olmadığından emin olun.
      NOT: Hücre bozulması buz üzerinde gerçekleştirilmiştir. TEA tamponunun pH'ını HCl ilavesiyle pH 7'ye ayarlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
   2. Tüm bakteriyel homojenatı iki adet 10.4 mL ultrasantrifüj tüpüne (10 mL / tüp) aktarın. Tüpleri üstüne kadar deiyonize su ile doldurun ve 90 dakika boyunca 4 ° C'de bir ultrasantrifüjde 104.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
   3. Her tüpteki peleti yeniden süspanse etmek için 2 mL deiyonize su ekleyin. Süspansiyonu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 20 mL'lik nihai hacme deiyonize su ekleyin. Tüm proteinleri denatüre etmek için ısıtın ve 5 dakika kaynatın.
   4. Süspansiyonu 18.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı (S1) koruyun. Çökeltiyi adım 2.1.3'teki gibi işlemden geçirin. Yeni süpernatanı (S2) S1 ile birleştirin.
   5. Süpernatanıma (S1+S2) %50 TCA (0.1 hacim) ekleyin ve DNA, RNA, proteinler vb. makromolekülleri çökeltmek için karışımı 10 dakika buzun üzerine koyun. Karışımı 18.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı 1.5 hacim mutlak etanol ile karıştırın.
      NOT: TCA konsantrasyonu %50 v/v'dir. Depolama için ışıktan uzak tutun.
   6. Glikojeni buz üzerinde 20 dakika çökeltin ve 18.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dökün.
   7. Peleti 5 mL ddH₂O içinde çözün ve ardından 5 mL buz gibi soğuk mutlak etanol ekleyin. Çözeltiyi gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin ve 18.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti saklayın.
   8. Adım 2.1.7'deki gibi "yıkama ve çökeltme" adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
   9. Son olarak, çökeltilmiş glikojeni 2 mL'lik bir tüpte 400 μL ddH_2O'daçözün, -80 °C'de ön dondurun ve kuru glikojen tozu elde etmek için dondurarak kurutun.
2. Trikloroasetik asit çökeltilmiş soğuk su ekstraksiyonu (TCA-CW)
   NOT: TCA-CW yöntemi, süpernatanı attıktan sonra, peleti kaynatmadan işleme tabi tutmanız (bkz. adım 2.1.3) ve 1 mg / mL proteaz inhibitörü kokteyli içeren 20 mL ddH₂O içinde yeniden süspanse etmesi dışında, TCA-HW yöntemi ile aynıdır.
   1. 1 mg/mL'lik bir proteaz inhibitörü kokteyl çözeltisi hazırlamak için, 50 mg proteaz inhibitörü kokteylini 1 mL deiyonize suda çözün ve 50:1 oranında seyreltin (deiyonize su: proteaz inhibitörü kokteyl çözeltisi).
3. Sükroz yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme (SDGU-CW) kullanılarak soğuk su ekstraksiyonu
   1. 1 g dondurularak kurutulmuş E. coli tozunu 4 mL glikojen ekstraksiyon tamponunda (GEB) 1 mg / mL proteaz inhibitör kokteyli ile çözün ve homojenize edin.
      NOT: GEB, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF ve 5 mM sodyum pirofosfattan oluşur. GEB'nin HCl ile pH 8'e ayarlanması gerekir.
   2. Bakteri hücrelerini 3 dakika (8 sn çalışma döngüsü ve 9 sn aralıklarla) bozmak için ultrasonik hücreli kırıcı (%25 enerji, 4 °C) kullanın. Tüm işlemin buz üzerinde gerçekleştirildiğinden emin olun. Sonifikasyondan sonra, bakteriyel homojenatı bir santrifüj tüpüne aktarın, GEB ile 10 mL'lik bir son hacme kadar doldurun ve karıştırmak için tüpü girdaplayın.
      NOT: Üretilen ısı glikojeni bozabileceğinden çok uzun süre homojenize etmeyin.
   3. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı 10.4 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın, tüpü GEB ile doldurun ve ardından 4 ° C'de 2 saat boyunca 360.000 x g'da santrifüjleyin.
      NOT: Tüpün dolu olduğundan ve hava kabarcığı olmadığından emin olun.
   4. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın ve çökeltiyi 2 mL deiyonize su ile yeniden süspanse edin.
   5. Yeni bir ultrasantrifüj tüpünde, 4 mL %75 sükroz çözeltisini 4 mL %37.5 sükroz çözeltisi ile yavaşça katmanlayın. Ardından, adım 2.3.4'te elde edilen süspansiyonu sakaroz çözeltisinin üzerine koyun ve deiyonize su ile doldurun (bkz. Şekil 1).
      NOT: Sükroz konsantrasyonu %75 [h/v] ve %37,5'tir [h/h]. Sükroz yoğunluk gradyanını yaparken dikkatli olun ve iki sükroz çözeltisi arasında gözlemlenebilir bir tabaka olduğundan emin olun. Ayrıca, ultrasantrifüj tüpünde hava kabarcığı olmadığından emin olun.
   6. 4 ° C'de 2,5 saat boyunca 360.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peleti 200 μL deiyonize suda çözün. Glikojen çökeltmesi için 800 μL mutlak etanol ekleyin.
   7. Glikojeni gece boyunca -20 °C'de çökeltin. 4,000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
   8. Elde edilen peleti 2 mL'lik bir tüpte 400 μL ddH_2O'daçözün, -80 °C'de ön dondurun ve kuru glikojen tozu elde etmek için dondurarak kurutun. Yapısal analiz için kuru glikojen tozunu 4 °C'de muhafaza edin.
      NOT: Ayrıntılı prosedür Şekil 1'de gösterilmiştir.
4. Sıcak% 30 potasyum hidroksit çözeltisi ekstraksiyonu (KOH-HW)
   1. Dondurularak kurutulmuş E. coli tozunu (50 mg) 1 mL% 30 [a / h] KOH içinde 1 saat kaynatın.
   2. En az 1 saat boyunca -20 ° C'de çökeltme için 15 mM LiCl içeren% 67 [h / h] etanol ekleyin. Numuneleri 16.000 x g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
      NOT: 15 mM LiCl ile %67 [h/h] etanol, 0.6358 g LiCl, 67 mL mutlak etanol ve 33 mL deiyonize su içerir.
   3. Peletleri 1 mL ddH₂O'da yeniden çözün ve aralıklı çalkalama ile 95 ° C'de 10 dakika ısıtın.
   4. Etanol çökeltme adımını adım 2.4.2'de açıklandığı gibi üç kez daha tekrarlayın. Son peleti 2 mL'lik bir tüpte 400 μLddH 2O'da yeniden çözün, -80 °C'de ön dondurun ve kuru glikojen tozu elde etmek için dondurarak kurutun.

3. Glikojen yapı tayini

1. Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM)
   1. Glikojen tozunu 50 mM Tris tamponlu salin (pH 7) içinde 1 mg / mL nihai konsantrasyon ile yeniden süspanse edin.
   2. Süspansiyonu 10 kat seyreltin ve seyreltilmiş süspansiyonu kızdırma deşarjlı 400 gözenekli bakır ızgaraya uygulayın.
   3. 2 dakika sonra, fazla numuneyi bir filtre kağıdı kullanarak ızgaradan çekin ve ızgarayı 2-3 damla %1 uranil asetat ile boyayın.
   4. Preparatları incelemek için 75 kV'da çalışan bir transmisyon elektron mikroskobu kullanın.
2. Boyut Dışlama Kromatografisi (SEC)
   1. Mobil fazın hazırlanması: deiyonize suda %0,02 (a/a) sodyum azid ve 50 mM sodyum nitrat çözeltileri hazırlayın ve 0,45 μm'lik bir filtre membranından süzün. Hava kabarcıklarını gidermek için çözeltiyi 15 dakikadan fazla sonikasyon yapmak için ultrasonik salınımlı su banyosunu kullanın.
   2. Numune hazırlama: Nihai konsantrasyon 1 mg/mL olacak şekilde glikojen tozunu çözmek için mobil fazı kullanın. Çözeltiyi gece boyunca 80 °C'de bir termomikserde inkübe edin. Çözünmüş numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı standart bir SEC şişesine aktarın.
   3. DMSO ile muamele edilmiş glikojen örneklerinin hazırlanması
      1. 1 mg glikojen tozunu 300 μL DMSO'da çözün ve bir termomikserde gece boyunca 80 °C'de inkübe edin. Glikojeni çökeltmek için 4x hacimde etanol ekleyin ve çözeltiyi 6.000 x g'da santrifüjleyin.
      2. Peleti iki kez etanol ile yıkayın, peleti ddH₂O'da çözün ve liyofilize edin.
      3. Dondurularak kurutulmuş glikojen tozunu, yukarıda açıklandığı gibi numuneler hazırlayarak SEC aracılığıyla analiz edin.
   4. Glikojen partikül boyutu dağılımının analizi için ön kolonlu SEC sistemini ve 1000 ve 10000 kolonlu SEC sistemini kullanın. Kolonları 80 °C'de ve akış hızını 0,3 mL/dk'da tutun.
3. Florofor Destekli Karbonhidrat Elektroforezi (FACE)
   1. Glikojen dallanma
      NOT: Zincir uzunluğu dağılımını (CLD) tespit etmek için FACE kullanılırken, test edilecek tüm numunelerin dallanma giderme ön işleminden geçmesi gerekir.
      1. 0.5 mg glikojen tozu, 90 μL sıcak su (90 °C), 1.5 μL_NaN3 çözeltisi, 3.5 μL izoamilaz (200 U/mL) ve 8 μL asetik asit-sodyum asetat tamponu (pH 3.5) bir test tüpüne.
         NOT: Test edilecek numunenin dallı zincirini özel olarak kesmek için izoamilaz eklenir. İzoamilaz, α-(1-4) bağını yok etmeden α-(1-6) bağını spesifik olarak yok edebilen bir dallanma giderici enzimdir, bu nedenle ana zincirin yapısını bozmadan glikojen yan zincirini spesifik olarak parçalayabilir.
      2. Karışımı 37 °C'de bir termomikserde 3 saat inkübe edin. PH'ı 8 μL 0.1 M NaOH çözeltisi ile nötr hale getirdikten sonra, karışımı bir termomikserde 1 saat boyunca 80 °C'de inkübe edin.
      3. Glikojeni çökeltmek için karışıma 4x hacimde mutlak etanol ekleyin. Ardından, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleyin. Peleti iki kez etanol ile yıkayın, peleti ddH₂O'ya çözün ve liyofilize edin.
   2. Floresan çözeltisinin hazırlanması
      1. APTS (8-Aminopiren-1,3,6-trisülfonik asit trisodyum tuzu) reaktif şişesini (her şişe 5 mg APTS içerir) 4.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Tozu çözmek için 50 μL %15 asetik asit çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve 0.2 M APTS asetik asit çözeltisi elde etmek için oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyin.
         NOT: APTS solüsyonunu buzdolabında -20 ° C'de saklayın C.It açıldıktan sonra iki hafta içinde tamamen kullanılmalıdır. Aksi takdirde, devre dışı bırakılacaktır. APTS, glikojen zincirinin indirgeyici ucuna bağlanan, yaygın olarak kullanılan negatif yüklü bir boyadır. Farklı polimerizasyon derecelerine (DP) sahip zincirlerin tümü yalnızca bir negatif yük taşıdığından, FACE bunları farklı kütle-yük oranlarına göre ayırabilir. Bu şekilde, farklı DP değerlerine sahip sinyaller floresan dedektörü tarafından algılanır.
   3. Dalları ayrılmış glikojeni bir test tüpüne aktarın ve 1.5 μL APTS çözeltisi ve 1.5 μL sodyum siyanoborohidrit çözeltisi ekleyin. Karanlıkta 1,5 saat boyunca 60 ° C'de inkübe edin. 80 μL deiyonize su ekleyin, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı koruyun.
   4. Numuneyi, 3 psi'de (atmosferik basıncın 0.5 kPa üzerinde) 3.4 saniye boyunca enjekte ederek kılcal elektroforez sistemine sokun.
      NOT: Floresan etiketli lineer glukanlar, 30 kV'luk uygulanan voltaj ve 25 °C'de yaklaşık 14 mA'lık bir akımla ayrıldı. Tepe alanları, farklı kütlelere sahip nispi miktarlarda glukan verdi (bitişik zirvelerdeki glukanların polimerizasyon derecesi (DP) 1 DP ile farklılık gösterdi). Numune sıcaklığı 18 °C'de tutuldu.

Sonuçlar

Glikojen partiküllerinin boyut dağılımı
Bir dizi çalışma, diyabetik karaciğerdeki glikojen α partiküllerinin kırılgan olduğunu ve hidrojen bağı bozucu DMSO 11,12,13,14'te kolayca parçalandığını göstermiştir. Bu çalışma, dört farklı yöntemle ekstrakte edilen bakteriyel glikojen için partikül boyutunun ve yapısa...

Tartışmalar

Glikojen, birçok bakteride tanımlanmış olan önemli bir enerji rezervidir¹⁶. Glikojen parçacıklarının fizyolojik işlevlerini incelemek için, glikojen moleküllerinin ince yapısını daha iyi anlamak önemlidir. Şimdiye kadar, bakteri kültüründen glikojeni çıkarmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, farklı ekstraksiyon yöntemlerinden glikojen partiküllerinin farklı boyut dağılımları gözlemlenmiştir, bu da has...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC system	Agilent	1260 infinity II	Particle size distribution
Analytical column	PSS	10-1000	-
Centrifuge	Eppendorf	5420	-
Filter membrane	Cambio	Km-0220	-
Fluorescence-assisted capillary electrophoresis system	Beckman Coulter	-	Chain length distribution
Freeze dryer	Xinzhi	SCIENTZ-10N	Lyophilization of bacteria and glycogen
Freezer	Thermo Fisher	Forma 900	Sample storage
Guard column	PSS	SUPPERMA	-
Incubator	Thermo Fisher	PR505750R-CN	-
Low-speed large-capacity centrifuge	Hexi	HR/T20MM	Sample centrifugation
Multiskan FC microplate reader	Thermo Fisher	1410101	-
Optima XPN ultracentrifuge	Beckman	XPN-100/90/80	For glycogen
Oscillator	Xinbao	SHZ-82	-
PA-800 Plus System	Beckman Coulter	A66528	-
pH meter	Mettler Toledo	FE28 -TRIS	-
Refractive index detector	Wyatt	Optilab T-rEX	-
Refrigerator	Haier	BCD-406WDPD	-
Thermomixer	Shanghai Jingxin	JXH-100	Sample incubation
Transmission electron microscope	Hitachi Corporation	H-7000	Glycogen particle morphology
Ultracentrifuge tube	Beckman	355651	-
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinzhi	Scientz-IID	Bacteria disruptor
Ultrasonic oscillating water bath	Jietuo	JT-1027HTD	-
Vortex mixer	Tiangen	OSE-VX-01	-
Water system	Merck Millipore	H2O-MM-UV-T	Deionized water
Material
8-Aminopyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid Trisodium Salt	Sigma-Aldrich	196504-57-1	-
Absolute ethanol	Guoyao	10009228	-
Agar powder	Solarbio	A1890	-
Alpha-amylase	Megazyme	E-BLAAM-40ML	-
Amyloglucosidase	Megazyme	E-AMGDF-40ML	-
cOmplete Mini	Roche	4693159001	-
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1kg	-
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC	Glycogen quantification
Dimethyl sulfoxide	Vicmed	Vic147	Chaotropic agent
E. coli BL21(DE3)	Tiangen	CB105-02	-
Ethylene diamine tetra-acetic acid	Vicmed	Vic1488	-
Glacial acetic acid	Guoyao	10000218	-
Glycerol	Guoyao	10010618	Bacterial storage
Hydrochloric acid	Guoyao	10011008	-
Hydroxymethyl aminomethane	Sigma-Aldrich	V900483-500g	-
Isoamylase	MegaZyme	9067-73-6	Glycogen debranch
Lithium chloride	Sigma-Aldrich	62476-100g	-
M9, Minimal Salts, 5×	Sigma-Aldrich	M6030-1kg	Bacterial culture
Potassium hydroxide	Guoyao	10017008	-
Pullulan standard	PSS	-	-
Sodium acetate trihydrate	Guoyao	10018718	-
Sodium azide	Sigma-Aldrich	26628-22-8	-
Sodium chloride	Guoyao	10019318	Bacterial culture
Sodium cyanoborohydride	Huaweiruike	hws001297	-
Sodium diphosphate	Sigma-Aldrich	71515-250g	-
Sodium Fluoride	Macklin	S817988-250g	-
Sodium hydroxide	Guoyao	10019762	-
Sodium nitrate	Guoyao	10019928	-
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	V900195-500g	-
Sucrose	Guoyao	10021463	-
Trichloroacetic acid	Guoyao	40091961	-
Tryptone	Oxoid	LP0042	Bacterial culture
Yeast Extract	Oxoid	LP0021	Bacterial culture