Méthode d’extraction non dégradative pour la caractérisation de la structure moléculaire de particules de glycogène bactérien

Résumé

La structure du glycogène bactérien est grandement influencée par les méthodes d’extraction, ce qui peut entraîner une dégradation moléculaire et/ou un échantillonnage biaisé. Il est essentiel de développer des méthodes pour minimiser ces problèmes. Ici, quatre méthodes d’extraction ont été comparées en utilisant la distribution de taille et la distribution de longueur de chaîne comme critères clés pour minimiser les artefacts d’extraction.

Résumé

À l’heure actuelle, il existe une variété de méthodes d’extraction du glycogène, qui endommagent la structure spatiale du glycogène ou n’extraient que partiellement le glycogène, ce qui conduit à une caractérisation biaisée de la structure moléculaire fine du glycogène. Pour comprendre les changements dynamiques des structures du glycogène et les fonctions polyvalentes des particules de glycogène dans les bactéries, il est essentiel d’isoler le glycogène avec une dégradation minimale. Dans cette étude, une méthode d’isolement du glycogène doux est démontrée en utilisant la précipitation d’eau froide (CW) via l’ultra-centrifugation du gradient de densité de sucre (SDGU-CW). La méthode traditionnelle à l’acide trichloracétique (TCA) et la méthode à l’hydroxyde de potassium (KOH) ont également été effectuées à des fins de comparaison. Une souche de laboratoire couramment utilisée, Escherichia coli BL21(DE3), a été utilisée comme organisme modèle dans cette étude à des fins de démonstration. Après avoir extrait des particules de glycogène à l’aide de différentes méthodes, leurs structures ont été analysées et comparées par chromatographie d’exclusion stérique (SEC) pour la distribution granulométrique des particules et par électrophorèse capillaire assistée par fluorophore (FACE) pour les distributions de longueur de chaîne linéaire. L’analyse a confirmé que le glycogène extrait via SDGU-CW présentait une dégradation minimale.

Introduction

Le glycogène est un polysaccharide très ramifié qui se compose de résidus glucosyliques et également d’une quantité petite mais significative de protéines, dans laquelle tous les résidus glucosyles sont liés entre eux par des liaisons α-1,4-glycosidiques en chaînes linéaires et des liaisons α-1,6-glycosidiques aux points de ramification¹. La structure des particules de glycogène est généralement divisée en trois hiérarchies : 1) les oligomères à chaîne courte, 2) les particules β sphériques (~20 nm de diamètre) et 3) les grandes particules de α en forme de rosette agrégées par β particules, dont le diamètre varie approximativement jusqu’à 300 nm. Récemment, il a été constaté que les particules de glycogène α ont deux états structurels chez les eucaryotes, c’est-à-dire un état fragile et un état stable. Ici, la fragilité signifie la dissociation de particules de α plus grandes en particules de β plus petites en présence d’un agent chaotrope comme le DMSO². Des analyses plus approfondies ont révélé que les particules de α de glycogène dans le foie diabétique sont constamment fragiles³ et que les particules α fragiles se dégradent beaucoup plus rapidement que les particules α stables⁴. Ainsi, la fragilité structurelle du glycogène peut exacerber les états hyperglycémiques dans le diabète ^2,4, ce qui fait de la particule α fragile un biomarqueur pathologique potentiel du diabète au niveau moléculaire. Cependant, l’existence de particules de α de glycogène chez les procaryotes n’est signalée que sporadiquement⁵, et il n’y a pas de rapport sur les deux états structurels différents des particules de glycogène α chez les bactéries.

Afin de comprendre les fonctions physiologiques des particules de glycogène bactérien, il est essentiel de déterminer la structure fine des molécules de glycogène, ce qui nécessite une isolation du glycogène avec un rendement maximal et une dégradation minimale¹. Jusqu’à présent, diverses techniques ont été développées pour l’extraction du glycogène, y compris, mais sans s’y limiter, l’extraction à l’eau chaude, l’extraction à l’acide trichloracétique (TCA) et l’extraction alcaline chaude (hydroxyde de potassium, KOH)⁶. De plus, une autre méthode couramment utilisée pour l’isolement du glycogène eucaryote, la méthode d’ultra-centrifugation par gradient de densité de sucre (SDGU), a également été signalée pour l’isolement du glycogène bactérien chez Selenomonas ruminantium et Fibrobacter succinogenes ^7,8. Bien que les avantages et les inconvénients de ces méthodes aient été largement discutés dans les études eucaryotes ^9,10, il existe rarement des études comparatives de structures fines de glycogène isolées par différentes méthodes d’extraction chez les bactéries du point de vue des structures des particules de glycogène.

Dans cette étude, cette question a été abordée en utilisant Escherichia coli BL21(DE3) comme organisme modèle. Au total, quatre méthodes d’extraction du glycogène ont été comparées, à savoir l’extraction à l’eau chaude précipitée au TCA (TCA-HW), l’extraction à l’eau froide précipitée au TCA (TCA-CW), l’extraction en solution chaude à 30 % KOH (KOH-HW) et l’extraction à l’eau froide par ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose (SDGU-CW). La distribution granulométrique des particules de glycogène a ensuite été mesurée par chromatographie d’exclusion stérique (SEC), tandis que la distribution de la longueur de la chaîne a été détectée par électrophorèse glucidique assistée par fluorophore (FACE), deux méthodes utilisées pour évaluer la qualité des méthodes d’extraction. De plus, la stabilité et la fragilité des particules de glycogène α bactérienne ont également été comparées entre les différentes méthodes d’extraction en comparant la distribution granulométrique avant et après traitement avec l’agent chaotrope couramment utilisé, le diméthylsulfoxyde (DMSO). Les procédures détaillées d’extraction du glycogène et de caractérisation structurale sont présentées ci-dessous. En résumé, la méthode SDGU-CW a le meilleur effet global en termes d’intégrité structurelle du glycogène et est donc recommandée pour l’extraction du glycogène bactérien dans les futures études pertinentes.

Protocole

1. Culture et collecte de bactéries

1. Réanimer E. coli BL21(DE3) à partir d’un stock de glycérol bactérien (-80 °C) en inoculant une plaque de gélose LB stérile (10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure, 10 g/L de NaCl et 15 g/L de gélose). Mettez la plaque dans un incubateur standard et cultivez toute la nuit à 37 °C.
2. Prélever une seule colonie et l’inoculer dans un milieu liquide stérile de 10 mL (10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 10 g/L de NaCl). Bien mélanger par vortex et culture pendant la nuit à 37 °C avec agitation à 220 tr/min.
   REMARQUE : Sauf indication contraire, toutes les conditions de culture liquide étaient de 37 °C avec un taux d’agitation de 220 tr/min.
3. Transvaser 1 mL de la culture d’E. coli pendant la nuit dans 100 mL de milieu liquide LB stérile et faire la culture pendant 5 h. Transférer 50 ml dans 1 L de 1x M9 minimal medium (3 g/L KH₂PO₄, 0,5 g/L de NaCl, 6,78 g/L de Na₂HPO₄ et 1 g/L de NH₄Cl) contenant 0,8 % de D-(+)-glucose. Bien mélanger, et cultiver pendant 20 h.
   REMARQUE : 1x M9 minimum et le glucose ont été stérilisés séparément, puis mélangés lors du refroidissement à température ambiante aseptique.
4. Après 20 h de culture, centrifuger la solution bactérienne à 6 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Jetez le surnageant. Conservez la pastille cellulaire à -80 °C pendant la nuit, puis lyophilisez-la.
5. Scellez et conservez la poudre bactérienne lyophilisée au réfrigérateur (-20 °C) pour une utilisation ultérieure.

2. Extraction du glycogène

1. Extraction à l’eau chaude précipitée à l’acide trichloracétique (TCA-HW)
   1. Pesez avec précision 500 mg de poudre d’E. coli BL21 (DE3) lyophilisée et mettez-la en suspension dans 20 ml de tampon de triéthanolamine (TEA) 0,05 M glacé. À l’aide d’un broyeur de cellules à ultrasons (25 % d’énergie, 4 °C), perturber les cellules bactériennes pendant 3 min (cycles de travail de 30 s et intervalles de 2 s). Assurez-vous qu’il n’y a pas de granulés évidents dans la solution.
      REMARQUE : La rupture cellulaire a été effectuée sur la glace. Ajustez le pH du tampon TEA à pH 7 par ajout de HCl et conservez-le à température ambiante.
   2. Transférez tout l’homogénat bactérien dans deux tubes d’ultracentrifugation de 10,4 mL (10 mL/tube). Remplissez les tubes avec de l’eau désionisée jusqu’en haut, et centrifugez-les à 104 000 x g dans une ultracentrifugeuse à 4 °C pendant 90 min. Jetez le surnageant.
   3. Ajouter 2 mL d’eau déminéralisée pour remettre la pastille en suspension dans chaque tube. Transférez la suspension dans un tube à centrifuger de 50 mL et ajoutez de l’eau déminéralisée jusqu’à un volume final de 20 mL. Faites chauffer et bouillir pendant 5 min pour dénaturer toutes les protéines.
   4. Centrifuger la suspension pendant 10 min à 18 000 x g et retenir le surnageant (S1). Traitez le précipité de la même manière qu’à l’étape 2.1.3. Mettez en commun le nouveau surnageant (S2) avec S1.
   5. Ajouter 50 % de TCA (0,1 volume) au surnageant (S1+S2) et placer le mélange sur de la glace pendant 10 min pour précipiter les macromolécules telles que l’ADN, l’ARN, les protéines, etc. Centrifuger le mélange à 18 000 x g pendant 10 min et mélanger le surnageant avec 1,5 volume d’éthanol absolu.
      REMARQUE : La concentration de TCA est de 50 % v/v. Pour le stockage, gardez-le à l’abri de la lumière.
   6. Faites précipiter le glycogène sur de la glace pendant 20 min et centrifugez à 18 000 x g pendant 10 min. Verser le surnageant.
   7. Dissoudre la pastille dans 5 mL de ddH₂O, puis ajouter 5 mL d’éthanol absolu glacé. Incuber la solution pendant la nuit à 4 °C et centrifuger à 18 000 x g pendant 10 min. Jetez le surnageant et conservez la pastille.
   8. Répétez les étapes « lavage et précipitation » comme à l’étape 2.1.7 deux fois de plus.
   9. Enfin, dissoudre le glycogène précipité dans 400 μL de ddH₂O dans un tube de 2 mL, pré-congeler à -80 °C et lyophiliser pour obtenir de la poudre de glycogène sèche.
2. Extraction à l’eau froide précipitée par l’acide trichloracétique (TCA-CW)
   REMARQUE : La méthode TCA-CW est la même que la méthode TCA-HW, sauf qu’après avoir jeté le surnageant, traiter la pastille sans l’ébullition (voir l’étape 2.1.3) et la remettre en suspension dans 20 mL de_ddH2O contenant 1 mg/mL de cocktail d’inhibiteurs de protéase.
   1. Pour préparer une solution cocktail d’inhibiteurs de protéase à 1 mg/mL, dissoudre 50 mg de cocktail d’inhibiteurs de protéase dans 1 mL d’eau désionisée et diluer dans un rapport de 50:1 (eau désionisée : solution cocktail d’inhibiteurs de protéase).
3. Extraction à l’eau froide par ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose (SDGU-CW)
   1. Dissoudre et homogénéiser 1 g de poudre d’E. coli lyophilisée dans 4 mL de tampon d’extraction de glycogène (GEB) avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase de 1 mg/mL.
      REMARQUE : Le GEB se compose de 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 2 mM d’EDTA, 50 mM de NaF et 5 mM de pyrophosphate de sodium. Le GEB doit être ajusté à un pH de 8 avec du HCl.
   2. À l’aide d’un broyeur de cellules à ultrasons (25 % d’énergie, 4 °C), perturber les cellules bactériennes pendant 3 minutes (cycles de travail de 8 s et intervalles de 9 s). Assurez-vous que tout le processus est effectué sur la glace. Après la sonification, transférez l’homogénat bactérien dans un tube à centrifuger, remplissez-le de GEB jusqu’à un volume final de 10 mL et agitez le tube pour mélanger.
      REMARQUE : Ne pas homogénéiser trop longtemps car la chaleur générée peut dégrader le glycogène.
   3. Centrifugeuse à 6 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférez le surnageant dans un tube d’ultracentrifugation de 10,4 mL, remplissez le tube jusqu’en haut avec du GEB, puis centrifugez-le à 360 000 x g pendant 2 h à 4 °C.
      REMARQUE : Assurez-vous que le tube est rempli et qu’il n’y a pas de bulles d’air.
   4. Jeter le surnageant après la centrifugation et remettre le précipité en suspension avec 2 mL d’eau désionisée.
   5. Dans un nouveau tube d’ultracentrifugation, superposer lentement 4 mL de solution de saccharose à 75 % avec 4 mL de solution de saccharose à 37,5 %. Ensuite, superposez la suspension obtenue à l’étape 2.3.4 sur la solution de saccharose et complétez avec de l’eau désionisée (voir figure 1).
      REMARQUE : La concentration de saccharose est de 75 % [v/v] et de 37,5 % [v/v]. Soyez prudent lorsque vous faites le gradient de densité du saccharose et assurez-vous qu’il y a une stratification observable entre les deux solutions de saccharose. Assurez-vous également qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le tube de l’ultracentrifugeuse.
   6. Centrifuger à 360 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C et jeter le surnageant. Dissoudre la pastille dans 200 μL d’eau déminéralisée. Ajouter 800 μL d’éthanol absolu pour la précipitation du glycogène.
   7. Faites précipiter le glycogène à -20 °C pendant la nuit. Centrifuger à 4 000 x g pendant 10 min à 4 °C et jeter le surnageant.
   8. Dissoudre la pastille obtenue dans 400 μL de ddH₂O dans un tube de 2 mL, pré-congeler à -80 °C et lyophiliser pour obtenir de la poudre de glycogène sèche. Conserver la poudre de glycogène sèche à 4 °C pour l’analyse structurale.
      REMARQUE : La procédure détaillée est illustrée à la figure 1.
4. Extraction à chaud d’une solution d’hydroxyde de potassium à 30 % (KOH-HW)
   1. Faire bouillir de la poudre d’E. coli lyophilisée (50 mg) dans 1 mL de KOH à 30 % [p/v] pendant 1 h.
   2. Ajouter de l’éthanol à 67 % [v/v] contenant 15 mM de LiCl pour une précipitation à -20 °C pendant au moins 1 h. Centrifuger les échantillons à 16 000 x g à 4 °C pendant 20 min.
      REMARQUE : L’éthanol à 67 % [v/v] avec 15 mM de LiCl contient 0,6358 g de LiCl, 67 mL d’éthanol absolu et 33 mL d’eau déminéralisée.
   3. Redissoudre les granulés dans 1 mL de ddH₂O et chauffer pendant 10 min à 95 °C avec agitation intermittente.
   4. Répétez l’étape de précipitation de l’éthanol trois fois de plus, comme décrit à l’étape 2.4.2. Redissoudre la pastille finale dans 400 μL de ddH₂O dans un tube de 2 mL, pré-congeler à -80 °C et lyophiliser pour obtenir de la poudre de glycogène sèche.

3. Détermination de la structure du glycogène

1. Microscopie électronique à transmission (MET)
   1. Mettre en suspension la poudre de glycogène dans une solution saline tamponnée au tris de 50 mM (pH 7) avec une concentration finale de 1 mg/mL.
   2. Effectuez une dilution 10 fois de la suspension et appliquez la suspension diluée sur la grille de cuivre à décharge luminescente de 400 mailles.
   3. Après 2 min, prélevez l’échantillon excédentaire de la grille à l’aide d’un papier filtre et colorez la grille avec 2-3 gouttes d’acétate d’uranyle à 1 %.
   4. Utiliser un microscope électronique à transmission fonctionnant à 75 kV pour examiner les préparations.
2. Chromatographie d’exclusion stérique (SEC)
   1. Préparation de la phase mobile : préparer des solutions d’azoture de sodium à 0,02 % (p/p) et de nitrate de sodium à 50 mM dans de l’eau désionisée, et filtrer à travers une membrane filtrante de 0,45 m. Utilisez le bain-marie oscillant à ultrasons pour soniser la solution pendant plus de 15 minutes afin d’éliminer les bulles d’air.
   2. Préparation de l’échantillon : Utilisez la phase mobile pour dissoudre la poudre de glycogène de sorte que la concentration finale soit de 1 mg/mL. Incuber la solution à 80 °C pendant la nuit dans un thermomixeur. Centrifuger l’échantillon dissous à 6 000 x g pendant 10 min à température ambiante et transférer le surnageant dans un flacon SEC standard.
   3. Préparation d’échantillons de glycogène traité au DMSO
      1. Dissoudre 1 mg de glycogène en poudre dans 300 μL de DMSO et l’incuber à 80 °C pendant la nuit dans un thermomélangeur. Ajoutez 4 fois le volume d’éthanol pour précipiter le glycogène et centrifugez la solution à 6 000 x g.
      2. Lavez le granulé deux fois avec de l’éthanol, dissolvez le granulé dans du ddH₂O et lyophilisez.
      3. Analysez la poudre de glycogène lyophilisée via SEC en préparant des échantillons comme décrit ci-dessus.
   4. Utilisez le système SEC avec des pré-colonnes, et 1000 et 10000 colonnes pour l’analyse de la distribution granulométrique des particules de glycogène. Maintenez les colonnes à 80 °C et le débit à 0,3 mL/min.
3. Électrophorèse des glucides assistée par fluorophore (FACE)
   1. Débranchage du glycogène
      REMARQUE : Lors de l’utilisation de FACE pour détecter la distribution de la longueur de la chaîne (CLD), tous les échantillons à tester doivent subir le prétraitement de débranchage.
      1. Ajoutez 0,5 mg de glycogène en poudre, 90 μL d’eau chaude (90 °C), 1,5 μL de solution de NaN₃ , 3,5 μL d’isoamylase (200 U/mL) et 8 μL de tampon d’acide acétique-acétate de sodium (pH 3,5) dans un tube à essai.
         REMARQUE : L’isoamylase est ajoutée pour couper spécifiquement la chaîne ramifiée de l’échantillon à tester. L’isoamylase est une enzyme débranchante qui peut détruire spécifiquement la liaison α-(1-6) sans détruire la liaison α-(1-4), de sorte qu’elle peut spécifiquement cliver la chaîne latérale du glycogène sans détruire la structure de la chaîne principale.
      2. Incuber le mélange à 37 °C pendant 3 h dans un thermomixeur. Après avoir préparé le pH neutre avec 8 μL de solution de NaOH 0,1 M, incuber le mélange à 80 °C pendant 1 h dans un thermomélangeur.
      3. Ajoutez 4 fois plus d’éthanol absolu au mélange pour précipiter le glycogène. Ensuite, centrifuger à 6 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Lavez le granulé deux fois avec de l’éthanol, dissolvez le granulé dans du ddH₂O et lyophilisez.
   2. Préparation de la solution fluorescente
      1. Centrifugez le flacon de réactif APTS (sel trisodique d’acide 8-aminopyrène-1,3,6-trisulfonique) (chaque flacon contient 5 mg d’APTS) à 4 000 x g pendant 2 min. Ajouter 50 μL de solution d’acide acétique à 15 % pour dissoudre la poudre, bien mélanger et centrifuger à 4 000 x g pendant 2 min à température ambiante pour obtenir une solution d’acide acétique APTS 0,2 M.
         REMARQUE : Conservez la solution APTS au réfrigérateur à -20 °C.It doit être utilisée complètement dans les deux semaines suivant son ouverture. Sinon, il sera inactivé. L’APTS est un colorant chargé négativement couramment utilisé qui se lie à l’extrémité réductrice de la chaîne glycogène. Étant donné que les chaînes avec différents degrés de polymérisation (DP) ne portent toutes qu’une seule charge négative, FACE peut les séparer en fonction de leurs différents rapports masse/charge. De cette façon, les signaux de différentes valeurs DP sont détectés par le détecteur de fluorescence.
   3. Transférez le glycogène déramifié dans un tube à essai et ajoutez 1,5 μL de solution d’APTS et 1,5 μL de solution de cyanoborohydrure de sodium. Incuber à 60 °C pendant 1,5 h dans l’obscurité. Ajouter 80 μL d’eau déminéralisée, centrifuger à 4 000 x g pendant 10 min à température ambiante et conserver le surnageant.
   4. Introduire l’échantillon dans le système d’électrophorèse capillaire en injectant pendant 3 s à 0,5 psi (3,4 kPa au-dessus de la pression atmosphérique).
      REMARQUE : Les glucanes linéaires marqués par fluorescence ont été séparés par une tension appliquée de 30 kV et un courant approximatif de 14 mA à 25 °C. Les zones de pics ont donné des quantités relatives de glucanes de masses différentes (degré de polymérisation (DP) des glucanes dans les pics adjacents différait de 1 DP). La température de l’échantillon a été maintenue à 18 °C.

Résultats

Distribution granulométrique des particules de glycogène
Une série d’études ont montré que les particules de α de glycogène dans le foie diabétique sont fragiles et se décomposent facilement dans le perturbateur de liaison hydrogène DMSO 11,12,13,14. La présente étude a testé comment la taille des particules et la stabilité s...

Discussion

Le glycogène est une réserve d’énergie importante qui a été identifiée chez de nombreuses bactéries¹⁶. Pour disséquer les fonctions physiologiques des particules de glycogène, il est essentiel de mieux comprendre la structure fine des molécules de glycogène. Jusqu’à présent, diverses méthodes ont été développées pour extraire le glycogène de la culture bactérienne. Cependant, différentes distributions de taille des particules de glycogène...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC system	Agilent	1260 infinity II	Particle size distribution
Analytical column	PSS	10-1000	-
Centrifuge	Eppendorf	5420	-
Filter membrane	Cambio	Km-0220	-
Fluorescence-assisted capillary electrophoresis system	Beckman Coulter	-	Chain length distribution
Freeze dryer	Xinzhi	SCIENTZ-10N	Lyophilization of bacteria and glycogen
Freezer	Thermo Fisher	Forma 900	Sample storage
Guard column	PSS	SUPPERMA	-
Incubator	Thermo Fisher	PR505750R-CN	-
Low-speed large-capacity centrifuge	Hexi	HR/T20MM	Sample centrifugation
Multiskan FC microplate reader	Thermo Fisher	1410101	-
Optima XPN ultracentrifuge	Beckman	XPN-100/90/80	For glycogen
Oscillator	Xinbao	SHZ-82	-
PA-800 Plus System	Beckman Coulter	A66528	-
pH meter	Mettler Toledo	FE28 -TRIS	-
Refractive index detector	Wyatt	Optilab T-rEX	-
Refrigerator	Haier	BCD-406WDPD	-
Thermomixer	Shanghai Jingxin	JXH-100	Sample incubation
Transmission electron microscope	Hitachi Corporation	H-7000	Glycogen particle morphology
Ultracentrifuge tube	Beckman	355651	-
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinzhi	Scientz-IID	Bacteria disruptor
Ultrasonic oscillating water bath	Jietuo	JT-1027HTD	-
Vortex mixer	Tiangen	OSE-VX-01	-
Water system	Merck Millipore	H2O-MM-UV-T	Deionized water
Material
8-Aminopyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid Trisodium Salt	Sigma-Aldrich	196504-57-1	-
Absolute ethanol	Guoyao	10009228	-
Agar powder	Solarbio	A1890	-
Alpha-amylase	Megazyme	E-BLAAM-40ML	-
Amyloglucosidase	Megazyme	E-AMGDF-40ML	-
cOmplete Mini	Roche	4693159001	-
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1kg	-
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC	Glycogen quantification
Dimethyl sulfoxide	Vicmed	Vic147	Chaotropic agent
E. coli BL21(DE3)	Tiangen	CB105-02	-
Ethylene diamine tetra-acetic acid	Vicmed	Vic1488	-
Glacial acetic acid	Guoyao	10000218	-
Glycerol	Guoyao	10010618	Bacterial storage
Hydrochloric acid	Guoyao	10011008	-
Hydroxymethyl aminomethane	Sigma-Aldrich	V900483-500g	-
Isoamylase	MegaZyme	9067-73-6	Glycogen debranch
Lithium chloride	Sigma-Aldrich	62476-100g	-
M9, Minimal Salts, 5×	Sigma-Aldrich	M6030-1kg	Bacterial culture
Potassium hydroxide	Guoyao	10017008	-
Pullulan standard	PSS	-	-
Sodium acetate trihydrate	Guoyao	10018718	-
Sodium azide	Sigma-Aldrich	26628-22-8	-
Sodium chloride	Guoyao	10019318	Bacterial culture
Sodium cyanoborohydride	Huaweiruike	hws001297	-
Sodium diphosphate	Sigma-Aldrich	71515-250g	-
Sodium Fluoride	Macklin	S817988-250g	-
Sodium hydroxide	Guoyao	10019762	-
Sodium nitrate	Guoyao	10019928	-
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	V900195-500g	-
Sucrose	Guoyao	10021463	-
Trichloroacetic acid	Guoyao	40091961	-
Tryptone	Oxoid	LP0042	Bacterial culture
Yeast Extract	Oxoid	LP0021	Bacterial culture