שיטת מיצוי לא מתפרקת לאפיון מבנה מולקולרי של חלקיקי גליקוגן חיידקיים

Summary

מבנה הגליקוגן החיידקי מושפע מאוד משיטות מיצוי שעלולות לגרום לפירוק מולקולרי ו/או דגימה מוטה. חיוני לפתח שיטות למזעור בעיות אלה. כאן, הושוו ארבע שיטות מיצוי באמצעות חלוקת גודל והתפלגות אורך שרשרת כקריטריונים מרכזיים למזעור חפצי מיצוי.

Abstract

נכון לעכשיו, קיימות מגוון שיטות מיצוי גליקוגן, הפוגעות במבנה המרחבי של הגליקוגן או מחלצות גליקוגן באופן חלקי בלבד, מה שמוביל לאפיון מוטה של המבנה המולקולרי העדין של הגליקוגן. כדי להבין את השינויים הדינמיים של מבני הגליקוגן ואת הפונקציות המגוונות של חלקיקי גליקוגן בחיידקים, חיוני לבודד גליקוגן עם פירוק מינימלי. במחקר זה, מודגמת שיטת בידוד גליקוגן קלה על ידי שימוש במשקעי מים קרים (CW) באמצעות אולטרה-צנטריפוגה בשיפוע צפיפות סוכר (SDGU-CW). השיטה המסורתית של חומצה טריכלורואצטית (TCA) ושיטת אשלגן הידרוקסיד (KOH) בוצעו גם לשם השוואה. זן מעבדה נפוץ, Escherichia coli BL21(DE3), שימש כאורגניזם מודל במחקר זה למטרות הדגמה. לאחר חילוץ חלקיקי גליקוגן בשיטות שונות, המבנים שלהם נותחו והושוו באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) עבור התפלגות גודל החלקיקים ואלקטרופורזה נימית בסיוע פלואורופור (FACE) עבור התפלגות אורך שרשרת ליניארית. הניתוח אישר כי לגליקוגן המופק באמצעות SDGU-CW יש פירוק מינימלי.

Introduction

גליקוגן הוא פוליסכריד מסועף מאוד המורכב משאריות גלוקוזיל וגם כמות קטנה אך משמעותית של חלבונים, בהם כל שאריות הגלוקוזיל מקושרות זו לזו באמצעות קשרים α-1,4-גליקוזידיים בשרשראות ליניאריות וקשרים α-1,6-גליקוזידיים בנקודות הסתעפות¹. המבנה של חלקיקי גליקוגן מחולק בדרך כלל לשלוש היררכיות: 1) אוליגומרים קצרי שרשרת, 2) חלקיקי β כדוריים (בקוטר ~20 ננומטר), ו-3) חלקיקי α גדולים בצורת שושנה המצטברים יחד על ידי חלקיקים β, שקוטרם נע בערך עד 300 ננומטר. לאחרונה נמצא כי לחלקיקי גליקוגן α יש שני מצבים מבניים באיקריוטים, כלומר מצב שביר ומצב יציב. כאן, שבריריות פירושה פירוק של חלקיקי α גדולים יותר לחלקיקי β קטנים יותר בנוכחות גורם כאוטרופי כמו DMSO². ניתוחים נוספים מצאו כי חלקיקי גליקוגן α בכבד הסוכרתי הם שבירים באופן עקבי³ וחלקיקי α השבריריים מתפרקים הרבה יותר מהר מחלקיקי α יציבים⁴. לפיכך, שבריריות מבנית של גליקוגן עלולה להחמיר מצבים היפרגליקמיים בסוכרת ^2,4, מה שהופך את החלקיק α השביר לסמן ביולוגי פתולוגי פוטנציאלי של סוכרת ברמה המולקולרית. עם זאת, קיומם של חלקיקי גליקוגן α בפרוקריוטים מדווח רק באופן ספורדי⁵, ואין דיווח על שני מצבים מבניים שונים של חלקיקי גליקוגן α בחיידקים.

על מנת להבין את הפונקציות הפיזיולוגיות של חלקיקי גליקוגן חיידקיים, חיוני לקבוע את המבנה העדין של מולקולות גליקוגן, הדורש בידוד גליקוגן עם תפוקה מקסימלית ופירוק מינימלי¹. עד כה פותחו טכניקות שונות למיצוי גליקוגן, כולל אך לא רק מיצוי מים חמים, מיצוי חומצה טריכלורואצטית (TCA) ומיצוי אלקליין חם (אשלגן הידרוקסיד, KOH)⁶. בנוסף, שיטה נוספת המשמשת בדרך כלל לבידוד גליקוגן אוקריוטי, שיטת שיפוע צפיפות הסוכר אולטרה-צנטריפוגה (SDGU), דווחה גם לבידוד גליקוגן חיידקי ב-Selenomonas ruminantium ו-Fibrobacter succinogenes ^7,8. למרות שהיתרונות והחסרונות של שיטות אלה נדונו בהרחבה במחקרים אוקריוטיים ^9,10, לעתים רחוקות ישנם מחקרים השוואתיים של מבנים עדינים של גליקוגן המבודדים באמצעות שיטות מיצוי שונות בחיידקים מנקודת המבט של מבני חלקיקי גליקוגן.

במחקר זה, נושא זה טופל על ידי שימוש ב-Escherichia coli BL21(DE3) כאורגניזם המודל. בסך הכל הושוו ארבע שיטות מיצוי גליקוגן, כלומר, מיצוי מים חמים משקעים TCA (TCA-HW), מיצוי מים קרים משקעים TCA (TCA-CW), מיצוי תמיסת KOH חמה 30% (KOH-HW) ומיצוי מים קרים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה בשיפוע צפיפות סוכרוז (SDGU-CW). לאחר מכן נמדדה התפלגות גודל חלקיקי הגליקוגן באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) בעוד שהתפלגות אורך השרשרת זוהתה באמצעות אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE), שניהם שימשו להערכת איכות שיטות המיצוי. בנוסף, היציבות והשבריריות של חלקיקי α גליקוגן חיידקיים הושוו גם בין שיטות המיצוי השונות על ידי השוואת התפלגות גודל החלקיקים לפני ואחרי הטיפול בחומר הכאוטרופי הנפוץ, דימתיל סולפוקסיד (DMSO). הנהלים המפורטים למיצוי גליקוגן ואפיון מבני מוצגים להלן. לסיכום, לשיטת SDGU-CW יש את ההשפעה הכוללת הטובה ביותר מבחינת שלמות מבנית הגליקוגן ולכן היא מומלצת למיצוי גליקוגן חיידקי במחקרים רלוונטיים עתידיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תרבית ואיסוף חיידקים

1. להחיות E. coli BL21(DE3) ממאגר גליצרול חיידקי (-80 מעלות צלזיוס) על ידי חיסון צלחת אגר LB סטרילית (10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר NaCl ו-15 גרם/ליטר אגר). הכניסו את הצלחת לחממה רגילה וטפחו למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
2. יש להרים מושבה בודדת ולחסן אותה למדיום נוזלי סטרילי של 10 מ"ל (10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים ו-10 גרם/ליטר NaCl). יש לערבב היטב באמצעות מערבולת ותרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-220 סל"ד.
   הערה: אלא אם צוין אחרת, כל תנאי התרבית הנוזלית היו 37 מעלות צלזיוס עם קצב טלטול של 220 סל"ד.
3. העבירו 1 מ"ל מתרבית E. coli הלילה ל-100 מ"ל של מדיום נוזלי LB סטרילי ותרבית למשך 5 שעות. העבירו 50 מ"ל ל-1 ליטר של 1x M9 בינוני מינימלי (3 גרם/ליטר KH₂PO₄, 0.5 גרם/ליטר NaCl, 6.78 גרם/ליטר Na₂HPO₄ ו-1 גרם/ליטר NH₄Cl) המכיל 0.8% D-(+)-גלוקוז. מערבבים היטב ומרבטים במשך 20 שעות.
   הערה: 1x M9 מדיום מינימלי וגלוקוז עוקרו בנפרד ולאחר מכן עורבבו בעת קירור לטמפרטורת החדר באופן אספטי.
4. לאחר תרבית של 20 שעות, תמיסת חיידקי צנטריפוגה ב-6,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט. אחסן את כדור התא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולאחר מכן יבש בהקפאה את הגלולה.
5. אטמו ואחסנו את אבקת החיידקים הליופילית במקרר (-20 מעלות צלזיוס) לשימוש מאוחר יותר.

2. מיצוי גליקוגן

1. מיצוי מים חמים עם חומצה טריכלורואצטית (TCA-HW)
   1. שקלו במדויק 500 מ"ג של אבקת E. coli BL21 (DE3) מיובשת בהקפאה והשעו אותה מחדש ב-20 מ"ל של מאגר טריאתנולאמין (TEA) קר כקרח. השתמש במגרסה תאים אולטראסונית (25% אנרגיה, 4 מעלות צלזיוס) כדי לשבש תאי חיידקים למשך 3 דקות (מחזורי עבודה של 30 שניות ומרווחים של 2 שניות). ודא שאין כדורים ברורים בתמיסה.
      הערה: שיבוש התאים בוצע על הקרח. התאימו את ה-pH של מאגר ה-TEA ל-pH 7 על ידי הוספת HCl ואחסנו בטמפרטורת החדר.
   2. העבירו את כל ההומוגנט החיידקי לשני צינורות אולטרה-צנטריפוגה של 10.4 מ"ל (10 מ"ל / צינור). מלאו את הצינורות במים נטולי יונים למעלה, וצנטריפוגה ב-104,000 x גרם באולטרה-צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
   3. הוסף 2 מ"ל מים נטולי יונים כדי להשעות מחדש את הגלולה בכל צינור. מעבירים את המתלים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ומוסיפים מים נטולי יונים לנפח סופי של 20 מ"ל. מחממים ומרתיחים במשך 5 דקות כדי לנטרל את כל החלבונים.
   4. צנטריפוגה את המתלים למשך 10 דקות ב-18,000 x g ושמרו על הסופרנטנט (S1). התייחס למשקעים באותו אופן כמו בשלב 2.1.3. צרף את הסופרנטנט החדש (S2) עם S1.
   5. הוסף 50% TCA (נפח 0.1) לסופרנטנט (S1+S2) והניח את התערובת על קרח למשך 10 דקות כדי לזרז מקרומולקולות כגון DNA, RNA, חלבונים וכו'. צנטריפוגה את התערובת ב-18,000 x גרם למשך 10 דקות וערבבו את הסופרנטנט עם נפח 1.5 של אתנול מוחלט.
      הערה: ריכוז ה-TCA הוא 50% v/v. לאחסון, הרחק אותו מאור.
   6. זרז גליקוגן על קרח למשך 20 דקות וצנטריפוגה ב-18,000 x גרם למשך 10 דקות. שפכו את הסופרנטנט.
   7. ממיסים את הגלולה ב-5 מ"ל של ddH₂O, ולאחר מכן מוסיפים 5 מ"ל אתנול מוחלט קר כקרח. דגרו את התמיסה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה ב-18,000 x גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושמרו את הגלולה.
   8. חזור על שלבי "שטיפה ומשקעים" כמו בשלב 2.1.7 פעמיים נוספות.
   9. לבסוף, ממיסים את הגליקוגן המשקע ב-400 מיקרוליטר של ddH₂O בשפופרת של 2 מ"ל, מקפיאים מראש ב-80 מעלות צלזיוס, ומייבשים בהקפאה לקבלת אבקת גליקוגן יבשה.
2. מיצוי מים קרים עם חומצה טריכלורואצטית (TCA-CW)
   הערה: שיטת TCA-CW זהה לשיטת TCA-HW אלא שלאחר השלכת הסופרנטנט, יש לטפל בגלולה ללא רתיחה (ראה שלב 2.1.3) ולהשעות אותה מחדש ב-20 מ"ל של ddH₂O המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז של 1 מ"ג/מ"ל.
   1. להכנת תמיסת קוקטייל מעכב פרוטאז של 1 מ"ג/מ"ל, ממיסים 50 מ"ג קוקטייל מעכב פרוטאז ב-1 מ"ל מים נטולי יונים ומדללים ביחס של 50:1 (מים נטולי יונים: תמיסת קוקטייל מעכב פרוטאז).
3. מיצוי מים קרים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות סוכרוז (SDGU-CW)
   1. ממיסים והומוגניזציה של 1 גרם אבקת E. coli מיובשת בהקפאה ב-4 מ"ל של מאגר מיצוי גליקוגן (GEB) עם קוקטייל מעכב פרוטאז של 1 מ"ג/מ"ל.
      הערה: GEB מורכב מ-50 מ"מ טריס, 150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 50 מ"מ NaF ו-5 מ"מ נתרן פירופוספט. יש להתאים את GEB ל-pH 8 עם HCl.
   2. השתמש במגרסה תאים אולטראסונית (25% אנרגיה, 4 מעלות צלזיוס) כדי לשבש תאי חיידקים למשך 3 דקות (מחזורי עבודה של 8 שניות ומרווחים של 9 שניות). ודא שכל התהליך מתבצע על הקרח. לאחר הסוניפיקציה, העבירו את ההומוגנט החיידקי לצינור צנטריפוגה, מלאו אותו ב-GEB לנפח סופי של 10 מ"ל, ומערבלו את הצינור לערבוב.
      הערה: אין לבצע הומוגניזציה במשך זמן רב מדי מכיוון שהחום שנוצר עלול לפגוע בגליקוגן.
   3. צנטריפוגה ב-6,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינור אולטרה-צנטריפוגה של 10.4 מ"ל, מלאו את הצינור למעלה ב-GEB, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-360,000 x גרם למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: ודא שהצינור מלא ואין בועות אוויר.
   4. השליכו את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה והשעו את המשקעים עם 2 מ"ל מים נטולי יונים.
   5. בצינור אולטרה-צנטריפוגה חדש, שכבה איטית של 4 מ"ל של תמיסת סוכרוז 75% עם 4 מ"ל של תמיסת סוכרוז 37.5%. לאחר מכן, שכבו את התרחיף שהתקבל בשלב 2.3.4 על גבי תמיסת הסוכרוז, ומלאו במים נטולי יונים (ראה איור 1).
      הערה: ריכוז הסוכרוז הוא 75% [v/v] ו-37.5% [v/v]. היזהר בעת ביצוע שיפוע צפיפות הסוכרוז וודא שיש שכבות ניכרות בין שתי תמיסות הסוכרוז. כמו כן, ודא שאין בועות אוויר בצינור האולטרה-צנטריפוגה.
   6. צנטריפוגה ב-360,000 x גרם למשך 2.5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט. ממיסים את הגלולה ב -200 מיקרוליטר מים נטולי יונים. הוסף 800 מיקרוליטר אתנול מוחלט למשקעי גליקוגן.
   7. זרז גליקוגן ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. צנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
   8. ממיסים את הגלולה המתקבלת ב-400 מיקרוליטר של ddH₂O בצינור של 2 מ"ל, מקפיאים מראש ב-80 מעלות צלזיוס, ומייבשים בהקפאה לקבלת אבקת גליקוגן יבשה. שמור על אבקת גליקוגן יבשה ב-4 מעלות צלזיוס לניתוח מבני.
      הערה: הנוהל המפורט מתואר באיור 1.
4. מיצוי תמיסת אשלגן הידרוקסיד חם 30% (KOH-HW)
   1. מרתיחים אבקת E. coli מיובשת בהקפאה (50 מ"ג) ב-1 מ"ל של 30% [w/v] KOH למשך שעה.
   2. הוסף 67% [v/v] אתנול המכיל 15 מ"מ LiCl למשקעים ב-20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. צנטריפוגה את הדגימות ב-16,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      הערה: 67% [v/v] אתנול עם 15 מ"מ LiCl מכיל 0.6358 גרם LiCl, 67 מ"ל אתנול מוחלט ו-33 מ"ל מים נטולי יונים.
   3. ממיסים מחדש את הכדורים ב-1 מ"ל של ddH₂O ומחממים למשך 10 דקות ב-95 מעלות צלזיוס עם תסיסה לסירוגין.
   4. חזור על שלב משקעי האתנול שלוש פעמים נוספות כמתואר בשלב 2.4.2. ממיסים מחדש את הגלולה הסופית ב-400 מיקרוליטר של ddH₂O בשפופרת של 2 מ"ל, מקפיאים מראש ב-80 מעלות צלזיוס ומייבשים בהקפאה לקבלת אבקת גליקוגן יבשה.

3. קביעת מבנה גליקוגן

1. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)
   1. יש להשהות מחדש את אבקת הגליקוגן בתמיסת מלח עם 50 מ"מ Tris-buffered (pH 7) עם ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.
   2. בצע דילול פי 10 של המתלה והחל את המתלה המדולל על רשת הנחושת בעלת 400 הרשת.
   3. לאחר 2 דקות, משוך את הדגימה העודפת מהרשת באמצעות נייר סינון וצבוע את הרשת ב-2-3 טיפות של 1% אורניל אצטט.
   4. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים שידור הפועל ב-75 קילו וולט כדי לבחון את התכשירים.
2. כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)
   1. הכנת שלב נייד: הכינו תמיסות נתרן אזיד 0.02% (w/w) ו-50 מ"מ נתרן חנקתי במים נטולי יונים, וסננו דרך קרום סינון של 0.45 מיקרומטר. השתמש באמבט המים המתנודד האולטראסוני כדי לסוניזציה של התמיסה למשך יותר מ-15 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
   2. הכנת דגימה: השתמש בשלב הנייד כדי להמיס אבקת גליקוגן כך שהריכוז הסופי יהיה 1 מ"ג/מ"ל. דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתרמו-מיקסר. צנטריפוגה את הדגימה המומסת ב-6,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ומעבירה את הסופרנטנט לבקבוקון SEC סטנדרטי.
   3. הכנת דגימות גליקוגן שטופלו ב-DMSO
      1. ממיסים 1 מ"ג של אבקת גליקוגן ב-300 מיקרוליטר של DMSO ומדגרים אותה ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתרמו-מיקסר. הוסף פי 4 נפח אתנול כדי לזרז גליקוגן וצנטריפוגה את התמיסה ב-6,000 x גרם.
      2. שוטפים את הגלולה פעמיים עם אתנול, ממיסים את הכדור ב-ddH₂O וליופיליזציה.
      3. נתח את אבקת הגליקוגן המיובשת בהקפאה באמצעות SEC על ידי הכנת דגימות כמתואר לעיל.
   4. השתמש במערכת SEC עם עמודות מוקדמות, ועמודות 1000 ו-10000 לניתוח התפלגות גודל חלקיקי הגליקוגן. שמור על העמודות על 80 מעלות צלזיוס וקצב הזרימה על 0.3 מ"ל לדקה.
3. אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE)
   1. הסתעפות גליקוגן
      הערה: בעת שימוש ב-FACE כדי לזהות התפלגות אורך שרשרת (CLD), כל הדגימות שייבדקו צריכות לעבור טיפול מקדים של הסתעפות.
      1. הוסף למבחנה 0.5 מ"ג אבקת גליקוגן, 90 מיקרוליטר מים חמים (90 מעלות צלזיוס), 1.5 מיקרוליטר תמיסת NaN₃ , 3.5 מיקרוליטר איזועמילאז (200 U/mL) ו-8 מיקרוליטר חומצה אצטית-נתרן אצטט (pH 3.5).
         הערה: איזועמילאז מתווסף כדי לחתוך באופן ספציפי את השרשרת המסועפת של הדגימה לבדיקה. איזואמילאז הוא אנזים מסתעף שיכול להרוס באופן ספציפי את הקשר α-(1-6) מבלי להרוס את הקשר α-(1-4), כך שהוא יכול לבקע באופן ספציפי את שרשרת הצד של הגליקוגן מבלי להרוס את מבנה השרשרת הראשית.
      2. דגרו את התערובת בחום של 37 מעלות למשך 3 שעות בתרמו-מיקסר. לאחר הפיכת ה-pH לניטרלי עם 8 מיקרוליטר של תמיסת NaOH של 0.1 M, דגרו את התערובת ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעה בתרמו-מיקסר.
      3. הוסף נפח פי 4 של אתנול מוחלט לתערובת כדי לזרז גליקוגן. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 6,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים את הגלולה פעמיים עם אתנול, ממיסים את הגלולה ל-ddH₂O ועושים ליופיליזציה.
   2. הכנת תמיסת פלורסנט
      1. צנטריפוגה בקבוק המגיב APTS (8-Aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) (כל בקבוק מכיל 5 מ"ג APTS) ב-4,000 x g למשך 2 דקות. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת חומצה אצטית 15% כדי להמיס את האבקה, לערבב היטב ולצנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל תמיסת חומצה אצטית של 0.2 M APTS.
         הערה: שמור את תמיסת ה-APTS במקרר בטמפרטורה של -20 מעלות C.It יש להשתמש בה לחלוטין תוך שבועיים לאחר הפתיחה. אחרת, הוא יושבת. APTS הוא צבע נפוץ בעל מטען שלילי שנקשר לקצה המפחית של שרשרת הגליקוגן. מכיוון שהשרשראות בעלות דרגות פילמור שונות (DP) נושאות כולן מטען שלילי אחד בלבד, FACE יכול להפריד ביניהן על סמך יחסי המסה למטען השונים שלהן. באופן זה, אותות של ערכי DP שונים מתגלים על ידי גלאי הקרינה.
   3. העבירו את הגליקוגן המסועף למבחנה והוסיפו 1.5 מיקרוליטר של תמיסת APTS ו-1.5 מיקרוליטר של תמיסת נתרן ציאנובורוהידריד. דגירה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי בחושך. הוסף 80 מיקרוליטר מים נטולי יונים, צנטריפוגה ב -4,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ושמור על הסופרנטנט.
   4. הכנס את הדגימה למערכת האלקטרופורזה הנימים על ידי הזרקה למשך 3 שניות ב-0.5 psi (3.4 kPa מעל הלחץ האטמוספרי).
      הערה: גלוקנים ליניאריים בעלי תווית פלואורסצנטית הופרדו באמצעות מתח מופעל של 30 קילו וולט וזרם משוער של 14 mA ב-25 מעלות צלזיוס. אזורי השיא נתנו כמויות יחסיות של גלוקנים עם מסות שונות (דרגת פילמור (DP) של גלוקנים בפסגות סמוכות הייתה שונה ב-1 DP). טמפרטורת הדגימה נשמרה על 18 מעלות צלזיוס.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התפלגות גודל של חלקיקי גליקוגן
סדרה של מחקרים הראתה כי חלקיקי α הגליקוגן בכבד הסוכרתי הם שבירים ומתפרקים בקלות במשבש קשרי המימן DMSO 11,12,13,14. המחקר הנוכחי בדק כיצד גודל החלקיקים והיציבות המבנ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

גליקוגן הוא מאגר אנרגיה חשוב שזוהה בחיידקים רבים¹⁶. כדי לנתח את הפונקציות הפיזיולוגיות של חלקיקי גליקוגן, חיוני להבין טוב יותר את המבנה העדין של מולקולות גליקוגן. עד כה פותחו מגוון שיטות להפקת גליקוגן מתרבית חיידקים. עם זאת, התפלגות גודל שונה של חלקיקי גליקו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC system	Agilent	1260 infinity II	Particle size distribution
Analytical column	PSS	10-1000	-
Centrifuge	Eppendorf	5420	-
Filter membrane	Cambio	Km-0220	-
Fluorescence-assisted capillary electrophoresis system	Beckman Coulter	-	Chain length distribution
Freeze dryer	Xinzhi	SCIENTZ-10N	Lyophilization of bacteria and glycogen
Freezer	Thermo Fisher	Forma 900	Sample storage
Guard column	PSS	SUPPERMA	-
Incubator	Thermo Fisher	PR505750R-CN	-
Low-speed large-capacity centrifuge	Hexi	HR/T20MM	Sample centrifugation
Multiskan FC microplate reader	Thermo Fisher	1410101	-
Optima XPN ultracentrifuge	Beckman	XPN-100/90/80	For glycogen
Oscillator	Xinbao	SHZ-82	-
PA-800 Plus System	Beckman Coulter	A66528	-
pH meter	Mettler Toledo	FE28 -TRIS	-
Refractive index detector	Wyatt	Optilab T-rEX	-
Refrigerator	Haier	BCD-406WDPD	-
Thermomixer	Shanghai Jingxin	JXH-100	Sample incubation
Transmission electron microscope	Hitachi Corporation	H-7000	Glycogen particle morphology
Ultracentrifuge tube	Beckman	355651	-
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinzhi	Scientz-IID	Bacteria disruptor
Ultrasonic oscillating water bath	Jietuo	JT-1027HTD	-
Vortex mixer	Tiangen	OSE-VX-01	-
Water system	Merck Millipore	H2O-MM-UV-T	Deionized water
Material
8-Aminopyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid Trisodium Salt	Sigma-Aldrich	196504-57-1	-
Absolute ethanol	Guoyao	10009228	-
Agar powder	Solarbio	A1890	-
Alpha-amylase	Megazyme	E-BLAAM-40ML	-
Amyloglucosidase	Megazyme	E-AMGDF-40ML	-
cOmplete Mini	Roche	4693159001	-
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1kg	-
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC	Glycogen quantification
Dimethyl sulfoxide	Vicmed	Vic147	Chaotropic agent
E. coli BL21(DE3)	Tiangen	CB105-02	-
Ethylene diamine tetra-acetic acid	Vicmed	Vic1488	-
Glacial acetic acid	Guoyao	10000218	-
Glycerol	Guoyao	10010618	Bacterial storage
Hydrochloric acid	Guoyao	10011008	-
Hydroxymethyl aminomethane	Sigma-Aldrich	V900483-500g	-
Isoamylase	MegaZyme	9067-73-6	Glycogen debranch
Lithium chloride	Sigma-Aldrich	62476-100g	-
M9, Minimal Salts, 5×	Sigma-Aldrich	M6030-1kg	Bacterial culture
Potassium hydroxide	Guoyao	10017008	-
Pullulan standard	PSS	-	-
Sodium acetate trihydrate	Guoyao	10018718	-
Sodium azide	Sigma-Aldrich	26628-22-8	-
Sodium chloride	Guoyao	10019318	Bacterial culture
Sodium cyanoborohydride	Huaweiruike	hws001297	-
Sodium diphosphate	Sigma-Aldrich	71515-250g	-
Sodium Fluoride	Macklin	S817988-250g	-
Sodium hydroxide	Guoyao	10019762	-
Sodium nitrate	Guoyao	10019928	-
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	V900195-500g	-
Sucrose	Guoyao	10021463	-
Trichloroacetic acid	Guoyao	40091961	-
Tryptone	Oxoid	LP0042	Bacterial culture
Yeast Extract	Oxoid	LP0021	Bacterial culture