Eine nicht-degradative Extraktionsmethode zur Charakterisierung der molekularen Struktur von bakteriellen Glykogenpartikeln

Zusammenfassung

Die bakterielle Glykogenstruktur wird durch Extraktionsmethoden stark beeinflusst, was zu molekularem Abbau und/oder verzerrter Probenahme führen kann. Es ist wichtig, Methoden zu entwickeln, um diese Probleme zu minimieren. In dieser Arbeit wurden vier Extraktionsmethoden verglichen, wobei die Größenverteilung und die Kettenlängenverteilung als Schlüsselkriterien für die Minimierung von Extraktionsartefakten herangezogen wurden.

Zusammenfassung

Derzeit gibt es eine Vielzahl von Glykogen-Extraktionsmethoden, die entweder die räumliche Struktur des Glykogens schädigen oder Glykogen nur teilweise extrahieren, was zu einer verzerrten Charakterisierung der feinen molekularen Struktur des Glykogens führt. Um die dynamischen Veränderungen der Glykogenstrukturen und die vielseitigen Funktionen von Glykogenpartikeln in Bakterien zu verstehen, ist es unerlässlich, Glykogen mit minimalem Abbau zu isolieren. In dieser Studie wird eine milde Glykogenisolationsmethode unter Verwendung von Kaltwasserfällung ( CW) mittels Zuckerdichtegradienten-Ultrazentrifugation (SDGU-CW) demonstriert. Zum Vergleich wurden auch die traditionelle Methode der Trichloressigsäure (TCA) und der Kaliumhydroxid (KOH)-Methode durchgeführt. Ein häufig verwendeter Laborstamm, Escherichia coli BL21(DE3), wurde in dieser Studie zu Demonstrationszwecken als Modellorganismus verwendet. Nach Extraktion von Glykogenpartikeln mit verschiedenen Methoden wurden deren Strukturen mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) für die Partikelgrößenverteilung und Fluorophor-gestützter Kapillarelektrophorese (FACE) für lineare Kettenlängenverteilungen analysiert und verglichen. Die Analyse bestätigte, dass das über SDGU-CW extrahierte Glykogen nur einen minimalen Abbau aufwies.

Einleitung

Glykogen ist ein stark verzweigtes Polysaccharid, das aus Glucosylresten und auch einer kleinen, aber signifikanten Menge an Proteinen besteht, bei denen alle Glucosylreste über α-1,4-glykosidische Bindungen in linearen Ketten und α-1,6-glykosidische Bindungen an den Verzweigungspunkten¹ miteinander verknüpft sind. Die Struktur von Glykogenpartikeln wird im Allgemeinen in drei Hierarchien unterteilt: 1) kurzkettige Oligomere, 2) kugelförmige β Partikel (~20 nm Durchmesser) und 3) große rosettenförmige α Partikel, die durch β Partikel zusammengeballt werden, deren Durchmesser ungefähr bis zu 300 nm reicht. Kürzlich wurde festgestellt, dass Glykogen α Partikel in Eukaryoten zwei strukturelle Zustände aufweisen, d.h. einen fragilen und einen stabilen Zustand. Unter Fragilität versteht man hier die Dissoziation von größeren α Partikeln in kleinere β Partikel in Gegenwart eines chaotropen Mittels wie DMSO². Weitere Analysen ergaben, dass Glykogen-α-Partikel in der diabetischen Leber durchweg fragil^{sind 3} und die fragilen α-Partikel viel schneller abgebaut werden als stabile α-Partikel⁴. Daher kann die strukturelle Fragilität des Glykogens hyperglykämische Zustände bei Diabetes^{verschlimmern 2,4}, was fragile α-Partikel zu einem potenziellen pathologischen Biomarker für Diabetes auf molekularer Ebene macht. Über das Vorhandensein von Glykogen-α-Partikeln in Prokaryoten wird jedoch nur sporadisch berichtet⁵, und es gibt keine Berichte über die zwei unterschiedlichen Strukturzustände von Glykogen-α-Partikeln in Bakterien.

Um die physiologischen Funktionen bakterieller Glykogenpartikel zu verstehen, ist es wichtig, die Feinstruktur von Glykogenmolekülen zu bestimmen, die eine Glykogenisolierung mit maximaler Ausbeute und minimalem Abbau erfordert¹. Bisher wurden verschiedene Techniken für die Glykogenextraktion entwickelt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Heißwasserextraktion, die Extraktion von Trichloressigsäure (TCA) und die Extraktion von heißalkalischen (Kaliumhydroxid, KOH)⁶. Darüber hinaus wurde eine andere Methode, die häufig für die Isolierung eukaryotischer Glykogen verwendet wird, die Zuckerdichtegradienten-Ultrazentrifugationsmethode (SDGU), auch für die Isolierung von bakteriellen Glykogen in Selenomonas ruminantium und Fibrobacter succinogenes berichtet ^7,8. Obwohl die Vor- und Nachteile dieser Methoden in eukaryotischen Studien ausführlich diskutiert wurden ^9,10, gibt es selten vergleichende Studien von Glykogen-Feinstrukturen, die mit verschiedenen Extraktionsmethoden in Bakterien aus der Perspektive der Glykogenpartikelstrukturen isoliert wurden.

In dieser Studie wurde dieses Problem anhand von Escherichia coli BL21(DE3) als Modellorganismus gelöst. Insgesamt wurden vier Glykogen-Extraktionsmethoden verglichen, nämlich die TCA-gefällte Heißwasserextraktion (TCA-HW), DIE TCA-gefällte Kaltwasserextraktion (TCA-CW), die Extraktion mit heißer 30%iger KOH-Lösung (KOH-HW) und die Kaltwasserextraktion mittels Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (SDGU-CW). Die Größenverteilung der Glykogenpartikel wurde dann mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) gemessen, während die Kettenlängenverteilung mittels Fluorophor-gestützter Kohlenhydratelektrophorese (FACE) nachgewiesen wurde, die beide zur Beurteilung der Qualität der Extraktionsmethoden verwendet wurden. Darüber hinaus wurden auch die Stabilität und Fragilität von bakteriellen Glykogen- α Partikeln zwischen den verschiedenen Extraktionsmethoden verglichen, indem die Partikelgrößenverteilung vor und nach der Behandlung mit dem häufig verwendeten Chaotropikum Dimethylsulfoxid (DMSO) verglichen wurde. Im Folgenden werden die detaillierten Verfahren zur Glykogenextraktion und strukturellen Charakterisierung vorgestellt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die SDGU-CW-Methode die beste Gesamtwirkung in Bezug auf die strukturelle Integrität des Glykogens hat und daher in zukünftigen relevanten Studien für die bakterielle Glykogenextraktion empfohlen wird.

Protokoll

1. Bakterienkultur und -sammlung

1. Reanimieren Sie E. coli BL21(DE3) aus bakteriellem Glycerinbestand (-80 °C) durch Beimpfen einer sterilen LB-Agarplatte (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl und 15 g/l Agar). Stellen Sie die Platte in einen normalen Inkubator und kultivieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
2. Nehmen Sie eine einzelne Kolonie und inokulieren Sie sie in ein steriles 10 ml steriles LB-Flüssigmedium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt und 10 g/l NaCl). Durch Vortexen gut mischen und über Nacht bei 37 °C kultivieren und bei 220 U/min schütteln.
   HINWEIS: Sofern nicht anders angegeben, betrugen alle Flüssigkulturbedingungen 37 °C mit einer Schüttelrate von 220 U/min.
3. 1 ml der E. coli-Kultur über Nacht in 100 ml steriles LB-Flüssigmedium überführen und 5 Stunden lang kultivieren. 50 mL auf 1 l 1x M9 minimales Medium (3 g/L_KH2PO₄, 0,5 g/L NaCl, 6,78 g/L Na₂HPO₄ und 1 g/L NH₄Cl) mit 0,8 % D-(+)-Glukose übertragen. Gut mischen und 20 Stunden lang kultivieren.
   HINWEIS: 1x M9 Minimalmedium und Glukose wurden getrennt sterilisiert und dann beim Abkühlen auf Raumtemperatur aseptisch gemischt.
4. Nach 20 h Kultivierung die Bakterienlösung bei 6.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. Lagern Sie das Zellpellet über Nacht bei -80 °C und trocknen Sie das Pellet anschließend gefrier.
5. Verschließen Sie das lyophilisierte Bakterienpulver und bewahren Sie es für die spätere Verwendung im Kühlschrank (-20 °C) auf.

2. Glykogen-Extraktion

1. Extraktion von Trichloressigsäure mit gefälltem Heißwasser (TCA-HW)
   1. Wiegen Sie 500 mg gefriergetrocknetes E. coli BL21 (DE3)-Pulver genau ab und resuspendieren Sie es in 20 ml eiskaltem 0,05 M Triethanolamin (TEA)-Puffer. Verwenden Sie einen Ultraschall-Zellbrecher (25 % Energie, 4 °C), um Bakterienzellen 3 Minuten lang aufzubrechen (30 s Arbeitszyklen und 2 s Intervalle). Stellen Sie sicher, dass sich keine offensichtlichen Pellets in der Lösung befinden.
      HINWEIS: Der Zellaufschluss wurde auf dem Eis durchgeführt. Stellen Sie den pH-Wert des TEA-Puffers durch HCl-Zugabe auf pH 7 ein und lagern Sie ihn bei Raumtemperatur.
   2. Übertragen Sie das gesamte bakterielle Homogenat in zwei 10,4-ml-Ultrazentrifugenröhrchen (10 ml/Röhrchen). Füllen Sie die Röhrchen bis zum Rand mit entionisiertem Wasser und zentrifugieren Sie bei 104.000 x g in einer Ultrazentrifuge bei 4 °C für 90 min. Entsorgen Sie den Überstand.
   3. Fügen Sie 2 mL deionisiertes Wasser hinzu, um das Pellet in jedem Röhrchen wieder zu suspendieren. Die Suspension in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und deionisiertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 ml hinzufügen. Erhitzen und 5 Minuten kochen lassen, um alle Proteine zu denaturieren.
   4. Die Suspension wird 10 min lang bei 18.000 x g zentrifugiert und der Überstand (S1) bleibt erhalten. Behandeln Sie den Niederschlag auf die gleiche Weise wie in Schritt 2.1.3. Den neuen Überstand (S2) mit S1 zusammenfassen.
   5. Geben Sie 50 % TCA (0,1 Volumen) zum Überstand (S1+S2) und legen Sie die Mischung 10 Minuten lang auf Eis, um Makromoleküle wie DNA, RNA, Proteine usw. auszufällen. Das Gemisch wird bei 18.000 x g für 10 min zentrifugiert und der Überstand mit 1,5 Volumenprozent absolutem Ethanol vermischt.
      HINWEIS: Die Konzentration von TCA beträgt 50 % v/v. Halten Sie es zur Aufbewahrung lichtgeschützt.
   6. Glykogen 20 min auf Eis ausfällen und 10 min bei 18.000 x g zentrifugieren. Überstand ausgießen.
   7. Das Pellet wird in 5 mL ddH₂O aufgelöst und anschließend 5 mL eiskaltes absolutes Ethanol hinzugefügt. Die Lösung über Nacht bei 4 °C inkubieren und 10 min bei 18.000 x g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf.
   8. Wiederholen Sie die Schritte "Waschen und Ausfällen" wie in Schritt 2.1.7 noch zwei weitere Male.
   9. Zum Schluss wird das gefällte Glykogen in 400 μl ddH₂O in einem 2-ml-Röhrchen gelöst, bei -80 °C vorgefroren und gefriergetrocknet, um trockenes Glykogenpulver zu erhalten.
2. Trichloressigsäure gefällte Kaltwasserextraktion (TCA-CW)
   ANMERKUNG: Die TCA-CW-Methode ist die gleiche wie die TCA-HW-Methode, mit der Ausnahme, dass das Pellet nach dem Verwerfen des Überstands ohne Sieden behandelt wird (siehe Schritt 2.1.3) und in 20 ml ddH₂O mit 1 mg/ml Proteasehemmer-Cocktail resuspendiert wird.
   1. Zur Herstellung einer Proteasehemmer-Cocktaillösung von 1 mg/ml lösen Sie 50 mg Proteasehemmer-Cocktail in 1 ml deionisiertem Wasser auf und verdünnen Sie es im Verhältnis 50:1 (deionisiertes Wasser: Proteasehemmer-Cocktaillösung).
3. Kaltwasserextraktion mittels Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (SDGU-CW)
   1. 1 g gefriergetrocknetes E. coli-Pulver in 4 ml Glykogen-Extraktionspuffer (GEB) mit einem 1 mg/ml-Proteasehemmer-Cocktail auflösen und homogenisieren.
      HINWEIS: GEB besteht aus 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF und 5 mM Natriumpyrophosphat. Der GEB muss mit HCl auf pH 8 eingestellt werden.
   2. Verwenden Sie einen Ultraschall-Zellbrecher (25 % Energie, 4 °C), um Bakterienzellen 3 Minuten lang zu zerkleinern (8 s Arbeitszyklen und 9 s Intervalle). Stellen Sie sicher, dass der gesamte Vorgang auf dem Eis durchgeführt wird. Nach der Sonifikation wird das bakterielle Homogenat in ein Zentrifugenröhrchen überführt, es mit GEB bis zu einem Endvolumen von 10 mL gefüllt und das Röhrchen zum Mischen vortexen.
      HINWEIS: Nicht zu lange homogenisieren, da die erzeugte Hitze das Glykogen abbauen kann.
   3. Zentrifugieren bei 6.000 x g für 10 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand in ein 10,4-ml-Ultrazentrifugenröhrchen, füllen Sie das Röhrchen bis zum Rand mit GEB und zentrifugieren Sie dann bei 360.000 x g für 2 Stunden bei 4 °C.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Schlauch gefüllt ist und keine Luftblasen vorhanden sind.
   4. Der Überstand wird nach der Zentrifugation verworfen und der Niederschlag mit 2 mL entionisiertem Wasser resuspendiert.
   5. In einem neuen Ultrazentrifugenröhrchen langsam 4 ml 75%ige Saccharoselösung mit 4 ml 37,5%iger Saccharoselösung schichten. Anschließend wird die in Schritt 2.3.4 gewonnene Suspension auf die Saccharoselösung aufgetragen und mit entionisiertem Wasser aufgefüllt (siehe Abbildung 1).
      HINWEIS: Die Saccharosekonzentration beträgt 75 % [v/v] und 37,5 % [v/v]. Seien Sie vorsichtig bei der Erstellung des Saccharose-Dichtegradienten und stellen Sie sicher, dass zwischen den beiden Saccharoselösungen eine beobachtbare Schichtung vorhanden ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass sich keine Luftblasen im Ultrazentrifugenröhrchen befinden.
   6. Bei 360.000 x g für 2,5 h bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Lösen Sie das Pellet in 200 μl entionisiertem Wasser auf. Für die Glykogenfällung werden 800 μl absolutes Ethanol zugegeben.
   7. Glykogen über Nacht bei -20 °C ausfällen. Bei 4.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   8. Das resultierende Pellet wird in 400 μl ddH₂O in einem 2-ml-Röhrchen aufgelöst, bei -80 °C vorgefroren und gefriergetrocknet, um trockenes Glykogenpulver zu erhalten. Trockenes Glykogenpulver für die Strukturanalyse bei 4 °C aufbewahren.
      HINWEIS: Die detaillierte Vorgehensweise ist in Abbildung 1 dargestellt.
4. Extraktion aus heißer 30%iger Kaliumhydroxidlösung (KOH-HW)
   1. Kochen Sie gefriergetrocknetes E. coli-Pulver (50 mg) in 1 ml 30 % [w/v] KOH für 1 h.
   2. 67 % [v/v] Ethanol mit 15 mM LiCl zur Fällung bei -20 °C für mindestens 1 h zugeben. Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 x g bei 4 °C für 20 min.
      HINWEIS: 67 % [v/v] Ethanol mit 15 mM LiCl enthalten 0,6358 g LiCl, 67 mL absolutes Ethanol und 33 mL deionisiertes Wasser.
   3. Die Pellets werden in 1 mL ddH₂O wieder aufgelöst und 10 min lang bei 95 °C unter intermittierendem Rühren erhitzt.
   4. Wiederholen Sie den Schritt der Ethanolfällung noch dreimal, wie in Schritt 2.4.2 beschrieben. Das fertige Pellet in 400 μl ddH₂O in einem 2-ml-Röhrchen wieder auflösen, bei -80 °C vorfrieren und gefriertrocknen, um trockenes Glykogenpulver zu erhalten.

3. Bestimmung der Glykogenstruktur

1. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
   1. Resuspendieren Sie Glykogenpulver in 50 mM Tris-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7) mit einer Endkonzentration von 1 mg/ml.
   2. Verdünnen Sie die Suspension 10-fach und tragen Sie die verdünnte Suspension auf das 400-Mesh-Kupfergitter mit Glimmentladung auf.
   3. Nach 2 Minuten ziehen Sie die überschüssige Probe mit einem Filterpapier vom Gitter und färben Sie das Gitter mit 2-3 Tropfen 1% Uranylacetat.
   4. Verwenden Sie ein Transmissionselektronenmikroskop, das bei 75 kV arbeitet, um die Präparate zu untersuchen.
2. Größenausschluss-Chromatographie (SEC)
   1. Vorbereitung der mobilen Phase: Bereiten Sie 0,02 % (w/w) Natriumazid und 50 mM Natriumnitratlösungen in entionisiertem Wasser vor und filtrieren Sie durch eine 0,45 μm Filtermembran. Verwenden Sie das oszillierende Ultraschall-Wasserbad, um die Lösung mehr als 15 Minuten lang zu beschallen, um Luftblasen zu entfernen.
   2. Probenvorbereitung: Verwenden Sie die mobile Phase, um Glykogenpulver so aufzulösen, dass die Endkonzentration 1 mg/ml beträgt. Die Lösung über Nacht bei 80 °C in einem Thermomischer inkubieren. Die gelöste Probe wird bei 6.000 x g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand in ein Standard-SEC-Fläschchen überführt.
   3. Vorbereitung von DMSO-behandelten Glykogenproben
      1. 1 mg Glykogenpulver in 300 μl DMSO auflösen und über Nacht bei 80 °C in einem Thermomischer inkubieren. Fügen Sie 4x Volumen Ethanol hinzu, um Glykogen auszufällen, und zentrifugieren Sie die Lösung bei 6.000 x g.
      2. Das Pellet zweimal mit Ethanol waschen, das Pellet in ddH₂O auflösen und lyophilisieren.
      3. Analysieren Sie das gefriergetrocknete Glykogenpulver mittels SEC, indem Sie die Proben wie oben beschrieben vorbereiten.
   4. Verwenden Sie das SEC-System mit Vorsäulen und 1000- und 10000-Säulen für die Analyse der Glykogenpartikelgrößenverteilung. Halten Sie die Säulen bei 80 °C und die Flussrate bei 0,3 mL/min.
3. Fluorophor-unterstützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE)
   1. Glykogen-Entzweigung
      HINWEIS: Bei der Verwendung von FACE zum Nachweis der Kettenlängenverteilung (CLD) müssen alle zu testenden Proben einer Vorbehandlung der Entzweigung unterzogen werden.
      1. Geben Sie 0,5 mg Glykogenpulver, 90 μl heißes Wasser (90 °C), 1,5 μl_{NaN-3-Lösung} , 3,5 μl Isoamylase (200 U/ml) und 8 μl Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH 3,5) in ein Reagenzglas.
         HINWEIS: Isoamylase wird zugesetzt, um die verzweigte Kette der zu testenden Probe spezifisch zu durchtrennen. Isoamylase ist ein entzweigendes Enzym, das die α-(1-6)-Bindung spezifisch zerstören kann, ohne die α-(1-4)-Bindung zu zerstören, so dass es die Glykogen-Seitenkette spezifisch spalten kann, ohne die Struktur der Hauptkette zu zerstören.
      2. Die Mischung bei 37 °C 3 h in einem Thermomischer inkubieren. Nachdem Sie den pH-Wert mit 8 μl 0,1 M NaOH-Lösung neutral gemacht haben, inkubieren Sie die Mischung bei 80 °C für 1 h in einem Thermomischer.
      3. Fügen Sie der Mischung 4x Volumen absolutes Ethanol hinzu, um Glykogen auszufällen. Anschließend bei 6.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Das Pellet zweimal mit Ethanol waschen, das Pellet in ddH₂O auflösen und lyophilisieren.
   2. Herstellung der Fluoreszenzlösung
      1. Zentrifugieren Sie die APTS (8-Aminopyren-1,3,6-Trisulfonsäure-Trinatriumsalz) Reagenzflasche (jede Flasche enthält 5 mg APTS) bei 4.000 x g für 2 min. Fügen Sie 50 μl 15%ige Essigsäurelösung hinzu, um das Pulver aufzulösen, mischen Sie gut und zentrifugieren Sie sie bei 4.000 x g für 2 Minuten bei Raumtemperatur, um 0,2 M APTS-Essigsäurelösung zu erhalten.
         HINWEIS: Bewahren Sie die APTS-Lösung im Kühlschrank bei -20 ° C auf C.It muss nach dem Öffnen innerhalb von zwei Wochen vollständig verbraucht werden. Andernfalls wird es deaktiviert. APTS ist ein häufig verwendeter negativ geladener Farbstoff, der an das reduzierende Ende der Glykogenkette bindet. Da die Ketten mit unterschiedlichen Polymerisationsgraden (DP) alle nur eine negative Ladung tragen, kann FACE sie anhand ihres unterschiedlichen Masse-Ladungs-Verhältnisses trennen. Auf diese Weise werden Signale unterschiedlicher DP-Werte vom Fluoreszenzdetektor detektiert.
   3. Übertragen Sie das entzweigte Glykogen in ein Reagenzglas und fügen Sie 1,5 μl APTS-Lösung und 1,5 μl Natriumcyanoborohydrid-Lösung hinzu. Bei 60 °C 1,5 h im Dunkeln inkubieren. 80 μl entionisiertes Wasser zugeben, bei 4.000 x g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand aufbewahren.
   4. Die Probe wird durch Injektion für 3 s bei 0,5 psi (3,4 kPa über dem Atmosphärendruck) in das Kapillarelektrophoresesystem eingeführt.
      HINWEIS: Fluoreszenzmarkierte lineare Glucane wurden durch eine angelegte Spannung von 30 kV und einen Strom von ca. 14 mA bei 25 °C getrennt. Die Peakbereiche ergaben relative Mengen an Glucanen mit unterschiedlichen Massen (Polymerisationsgrad (DP) von Glucanen in benachbarten Peaks unterschied sich um 1 DP). Die Probentemperatur wurde bei 18 °C gehalten.

Ergebnisse

Größenverteilung von Glykogenpartikeln
Eine Reihe von Studien hat gezeigt, dass Glykogen-α-Partikel in der diabetischen Leber zerbrechlich sind und im Wasserstoffbrückendisruptor DMSO 11,12,13,14 leicht auseinander gebrochen werden können. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, wie sich die Partikelgröße und die strukturelle Sta...

Diskussion

Glykogen ist eine wichtige Energiereserve, die in vielen Bakterien nachgewiesen wurde¹⁶. Um die physiologischen Funktionen von Glykogenpartikeln zu verstehen, ist es wichtig, die Feinstruktur der Glykogenmoleküle besser zu verstehen. Bisher wurde eine Vielzahl von Methoden entwickelt, um Glykogen aus Bakterienkulturen zu gewinnen. Bei verschiedenen Extraktionsmethoden wurden jedoch unterschiedliche Größenverteilungen von Glykogenpartikeln beobachtet, was auf ei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC system	Agilent	1260 infinity II	Particle size distribution
Analytical column	PSS	10-1000	-
Centrifuge	Eppendorf	5420	-
Filter membrane	Cambio	Km-0220	-
Fluorescence-assisted capillary electrophoresis system	Beckman Coulter	-	Chain length distribution
Freeze dryer	Xinzhi	SCIENTZ-10N	Lyophilization of bacteria and glycogen
Freezer	Thermo Fisher	Forma 900	Sample storage
Guard column	PSS	SUPPERMA	-
Incubator	Thermo Fisher	PR505750R-CN	-
Low-speed large-capacity centrifuge	Hexi	HR/T20MM	Sample centrifugation
Multiskan FC microplate reader	Thermo Fisher	1410101	-
Optima XPN ultracentrifuge	Beckman	XPN-100/90/80	For glycogen
Oscillator	Xinbao	SHZ-82	-
PA-800 Plus System	Beckman Coulter	A66528	-
pH meter	Mettler Toledo	FE28 -TRIS	-
Refractive index detector	Wyatt	Optilab T-rEX	-
Refrigerator	Haier	BCD-406WDPD	-
Thermomixer	Shanghai Jingxin	JXH-100	Sample incubation
Transmission electron microscope	Hitachi Corporation	H-7000	Glycogen particle morphology
Ultracentrifuge tube	Beckman	355651	-
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinzhi	Scientz-IID	Bacteria disruptor
Ultrasonic oscillating water bath	Jietuo	JT-1027HTD	-
Vortex mixer	Tiangen	OSE-VX-01	-
Water system	Merck Millipore	H2O-MM-UV-T	Deionized water
Material
8-Aminopyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid Trisodium Salt	Sigma-Aldrich	196504-57-1	-
Absolute ethanol	Guoyao	10009228	-
Agar powder	Solarbio	A1890	-
Alpha-amylase	Megazyme	E-BLAAM-40ML	-
Amyloglucosidase	Megazyme	E-AMGDF-40ML	-
cOmplete Mini	Roche	4693159001	-
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1kg	-
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC	Glycogen quantification
Dimethyl sulfoxide	Vicmed	Vic147	Chaotropic agent
E. coli BL21(DE3)	Tiangen	CB105-02	-
Ethylene diamine tetra-acetic acid	Vicmed	Vic1488	-
Glacial acetic acid	Guoyao	10000218	-
Glycerol	Guoyao	10010618	Bacterial storage
Hydrochloric acid	Guoyao	10011008	-
Hydroxymethyl aminomethane	Sigma-Aldrich	V900483-500g	-
Isoamylase	MegaZyme	9067-73-6	Glycogen debranch
Lithium chloride	Sigma-Aldrich	62476-100g	-
M9, Minimal Salts, 5×	Sigma-Aldrich	M6030-1kg	Bacterial culture
Potassium hydroxide	Guoyao	10017008	-
Pullulan standard	PSS	-	-
Sodium acetate trihydrate	Guoyao	10018718	-
Sodium azide	Sigma-Aldrich	26628-22-8	-
Sodium chloride	Guoyao	10019318	Bacterial culture
Sodium cyanoborohydride	Huaweiruike	hws001297	-
Sodium diphosphate	Sigma-Aldrich	71515-250g	-
Sodium Fluoride	Macklin	S817988-250g	-
Sodium hydroxide	Guoyao	10019762	-
Sodium nitrate	Guoyao	10019928	-
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	V900195-500g	-
Sucrose	Guoyao	10021463	-
Trichloroacetic acid	Guoyao	40091961	-
Tryptone	Oxoid	LP0042	Bacterial culture
Yeast Extract	Oxoid	LP0021	Bacterial culture