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Method Article
* これらの著者は同等に貢献しました
細菌のグリコーゲン構造は、分子の分解や偏ったサンプリングを引き起こす可能性のある抽出方法によって大きく影響を受けます。これらの問題を最小限に抑えるための方法を開発することが不可欠です。ここでは、抽出アーチファクトを最小限に抑えるための主要な基準として、サイズ分布とチェーン長分布を使用して、4つの抽出方法を比較しました。
現在、グリコーゲンの空間構造を損傷するか、グリコーゲンを部分的にしか抽出しないさまざまなグリコーゲン抽出方法が存在し、グリコーゲンの微細分子構造のバイアスがかかっています。グリコーゲン構造の動的変化や細菌中のグリコーゲン粒子の多様な機能を理解するためには、分解を最小限に抑えてグリコーゲンを単離することが不可欠です。本研究では、糖密度勾配超遠心分離法(SDGU-CW) による 冷水(CW)沈殿法により、軽度のグリコーゲン単離法を実証した。比較のために、従来のトリクロロ酢酸(TCA)法と水酸化カリウム(KOH)法も実施しました。この研究では、一般的に使用される実験室株である 大腸菌 BL21(DE3)をモデル生物として使用し、デモンストレーション目的で使用しました。グリコーゲン粒子をさまざまな方法で抽出した後、粒子径分布についてはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で、直線鎖長分布では蛍光色素支援キャピラリー電気泳動(FACE)により、その構造を解析し、比較しました。この分析により、 SDGU-CWで 抽出したグリコーゲンの分解が最小限であることが確認されました。
グリコーゲンは、グルコシル残基と少量ではあるが大量のタンパク質からなる高度に分岐した多糖類であり、すべてのグルコシル残基は、直鎖のα-1,4-グリコシド結合と分岐点1のα-1,6-グリコシド結合を介して結合されています。グリコーゲン粒子の構造は、一般的に、1)短鎖オリゴマー、2)球状β粒子(直径~20nm)、3)直径が約300nmまでのβ粒子が凝集した大きなロゼット状のα粒子の3つの階層に分けられます。近年、真核生物ではグリコーゲン粒子αが壊れやすい状態と安定な状態の2つの構造状態を持っていることが分かってきました。ここで、脆弱性とは、DMSO2のようなカオトロピック剤の存在下で、大きなα粒子が小さなβ粒子に解離することを意味します。さらなる分析により、糖尿病性肝臓のグリコーゲンα粒子は一貫して壊れやすく3、壊れやすいα粒子は安定したα粒子よりもはるかに速く分解することがわかりました4。したがって、グリコーゲンの構造的脆弱性は、糖尿病の高血糖状態を悪化させる可能性があり2,4、これにより、脆弱なα粒子は分子レベルで糖尿病の潜在的な病理学的バイオマーカーになります。しかし、原核生物におけるグリコーゲンα粒子の存在は散発的にしか報告されておらず5、細菌におけるグリコーゲンα粒子の2つの異なる構造状態についての報告はありません。
細菌のグリコーゲン粒子の生理機能を理解するためには、グリコーゲン分子の微細構造を決定することが不可欠であり、そのためには最大の収量と最小限の分解でグリコーゲンを分離する必要があります1。これまでに、グリコーゲン抽出には、熱水抽出、トリクロロ酢酸(TCA)抽出、および高温アルカリ(水酸化カリウム、KOH)抽出6を含むがこれらに限定されないさまざまな技術が開発されてきました。さらに、真核生物のグリコーゲン単離に一般的に使用される別の方法である糖密度勾配超遠心分離(SDGU)法も、Selenomonas ruminantiumおよびFibrobacter succinogenesの細菌グリコーゲン単離について報告されています7,8。これらの方法の長所と短所は真核生物の研究9,10で広く議論されていますが、グリコーゲン粒子構造の観点から細菌のさまざまな抽出方法によって単離されたグリコーゲン微細構造の比較研究はほとんどありません。
本研究では、 大腸菌 BL21(DE3)をモデル生物として、この問題に取り組みました。TCA沈殿温水抽出法(TCA-HW)、TCA沈殿水抽出法(TCA-CW)、高温30%KOH溶液抽出法(KOH-HW)、ショ糖密度勾配超遠心法による冷水抽出法(SDGU-CW)の計4つのグリコーゲン抽出法を比較した。次に、グリコーゲンの粒度分布をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC) で 測定し、鎖長分布を蛍光色素補助糖質電気泳動(FACE) で 検出しました。これらはどちらも抽出法の品質評価に使用されました。さらに、一般的に使用されるカオトロピック剤であるジメチルスルホキシド(DMSO)で処理する前後の粒子サイズ分布を比較することにより、細菌グリコーゲンα粒子の安定性と脆弱性もさまざまな抽出方法間で比較しました。グリコーゲン抽出と構造特性評価の詳細な手順を以下に示します。要約すると、SDGU-CW法はグリコーゲン構造的完全性の点で全体的に最高の効果を持っているため、将来の関連研究で細菌グリコーゲン抽出に推奨されます。
1. 細菌の培養と収集
2. グリコーゲン抽出
3. グリコーゲン構造の決定
グリコーゲン粒子のサイズ分布
一連の研究により、糖尿病肝臓のグリコーゲンα粒子は壊れやすく、水素結合かく乱物質であるDMSO 11,12,13,14で簡単に分解できることが示されています。本研究では、4つの異なる方法で抽出された細菌グリコーゲンの粒子サ?...
グリコーゲンは、多くの細菌で確認されている重要なエネルギー貯蔵庫です16。グリコーゲン粒子の生理機能を解剖するためには、グリコーゲン分子の微細構造をより深く理解することが不可欠です。これまでに、細菌培養物からグリコーゲンを抽出するためのさまざまな方法が開発されてきました。しかし、抽出方法によってグリコーゲン粒子の?...
著者には利益相反はありません。
この研究の完了に大いに役立った洞察と専門知識を提供してくれたクイーンズランド大学と揚州大学のロバート・G・ギルバート教授に大いに感謝します。私たちは、中国国家自然科学基金会(第31900022号、第32171281号)、江蘇省自然科学基金会(No.BK20180997)、徐州医科大学の若い科学技術革新チーム(No.TD202001)、および江蘇青蘭プロジェクト(2020)。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Agilent 1260 infinity SEC system | Agilent | 1260 infinity II | Particle size distribution |
Analytical column | PSS | 10-1000 | - |
Centrifuge | Eppendorf | 5420 | - |
Filter membrane | Cambio | Km-0220 | - |
Fluorescence-assisted capillary electrophoresis system | Beckman Coulter | - | Chain length distribution |
Freeze dryer | Xinzhi | SCIENTZ-10N | Lyophilization of bacteria and glycogen |
Freezer | Thermo Fisher | Forma 900 | Sample storage |
Guard column | PSS | SUPPERMA | - |
Incubator | Thermo Fisher | PR505750R-CN | - |
Low-speed large-capacity centrifuge | Hexi | HR/T20MM | Sample centrifugation |
Multiskan FC microplate reader | Thermo Fisher | 1410101 | - |
Optima XPN ultracentrifuge | Beckman | XPN-100/90/80 | For glycogen |
Oscillator | Xinbao | SHZ-82 | - |
PA-800 Plus System | Beckman Coulter | A66528 | - |
pH meter | Mettler Toledo | FE28 -TRIS | - |
Refractive index detector | Wyatt | Optilab T-rEX | - |
Refrigerator | Haier | BCD-406WDPD | - |
Thermomixer | Shanghai Jingxin | JXH-100 | Sample incubation |
Transmission electron microscope | Hitachi Corporation | H-7000 | Glycogen particle morphology |
Ultracentrifuge tube | Beckman | 355651 | - |
Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinzhi | Scientz-IID | Bacteria disruptor |
Ultrasonic oscillating water bath | Jietuo | JT-1027HTD | - |
Vortex mixer | Tiangen | OSE-VX-01 | - |
Water system | Merck Millipore | H2O-MM-UV-T | Deionized water |
Material | |||
8-Aminopyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid Trisodium Salt | Sigma-Aldrich | 196504-57-1 | - |
Absolute ethanol | Guoyao | 10009228 | - |
Agar powder | Solarbio | A1890 | - |
Alpha-amylase | Megazyme | E-BLAAM-40ML | - |
Amyloglucosidase | Megazyme | E-AMGDF-40ML | - |
cOmplete Mini | Roche | 4693159001 | - |
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1kg | - |
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) | Megazyme | K-GLUC | Glycogen quantification |
Dimethyl sulfoxide | Vicmed | Vic147 | Chaotropic agent |
E. coli BL21(DE3) | Tiangen | CB105-02 | - |
Ethylene diamine tetra-acetic acid | Vicmed | Vic1488 | - |
Glacial acetic acid | Guoyao | 10000218 | - |
Glycerol | Guoyao | 10010618 | Bacterial storage |
Hydrochloric acid | Guoyao | 10011008 | - |
Hydroxymethyl aminomethane | Sigma-Aldrich | V900483-500g | - |
Isoamylase | MegaZyme | 9067-73-6 | Glycogen debranch |
Lithium chloride | Sigma-Aldrich | 62476-100g | - |
M9, Minimal Salts, 5× | Sigma-Aldrich | M6030-1kg | Bacterial culture |
Potassium hydroxide | Guoyao | 10017008 | - |
Pullulan standard | PSS | - | - |
Sodium acetate trihydrate | Guoyao | 10018718 | - |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | 26628-22-8 | - |
Sodium chloride | Guoyao | 10019318 | Bacterial culture |
Sodium cyanoborohydride | Huaweiruike | hws001297 | - |
Sodium diphosphate | Sigma-Aldrich | 71515-250g | - |
Sodium Fluoride | Macklin | S817988-250g | - |
Sodium hydroxide | Guoyao | 10019762 | - |
Sodium nitrate | Guoyao | 10019928 | - |
Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | V900195-500g | - |
Sucrose | Guoyao | 10021463 | - |
Trichloroacetic acid | Guoyao | 40091961 | - |
Tryptone | Oxoid | LP0042 | Bacterial culture |
Yeast Extract | Oxoid | LP0021 | Bacterial culture |
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