Um método de extração não degradativo para caracterização da estrutura molecular de partículas de glicogênio bacteriano

Resumo

A estrutura do glicogênio bacteriano é muito afetada por métodos de extração que podem resultar em degradação molecular e/ou amostragem tendenciosa. É essencial desenvolver métodos para minimizar esses problemas. Aqui, quatro métodos de extração foram comparados usando a distribuição de tamanho e a distribuição do comprimento da cadeia como critérios-chave para minimizar os artefatos de extração.

Resumo

Atualmente, existe uma variedade de métodos de extração de glicogênio, que danificam a estrutura espacial do glicogênio ou extraem apenas parcialmente o glicogênio, levando à caracterização tendenciosa da estrutura molecular fina do glicogênio. Para entender as mudanças dinâmicas das estruturas do glicogênio e as funções versáteis das partículas de glicogênio nas bactérias, é essencial isolar o glicogênio com degradação mínima. Neste estudo, um método de isolamento de glicogênio leve é demonstrado usando precipitação de água fria (CW) via ultracentrifugação de gradiente de densidade de açúcar (SDGU-CW). O método tradicional do ácido tricloroacético (TCA) e o método do hidróxido de potássio (KOH) também foram realizados para comparação. Uma cepa de laboratório comumente usada, Escherichia coli BL21 (DE3), foi usada como organismo modelo neste estudo para fins de demonstração. Após a extração de partículas de glicogênio usando diferentes métodos, suas estruturas foram analisadas e comparadas por meio de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para distribuição de tamanho de partícula e eletroforese capilar assistida por fluoróforo (FACE) para distribuições de comprimento de cadeia linear. A análise confirmou que o glicogênio extraído via SDGU-CW teve degradação mínima.

Introdução

O glicogênio é um polissacarídeo altamente ramificado que consiste em resíduos de glicosila e também uma quantidade pequena, mas significativa, de proteínas, na qual todos os resíduos de glicosila estão ligados entre si por meio de ligações α-1,4-glicosídicas em cadeias lineares e ligações α-1,6-glicosídicas em pontos de ramificação¹. A estrutura das partículas de glicogênio é geralmente dividida em três hierarquias: 1) oligômeros de cadeia curta, 2) partículas β esféricas (~ 20 nm de diâmetro) e 3) grandes partículas de α em forma de roseta agregadas por partículas β, cujo diâmetro varia aproximadamente até 300 nm. Recentemente, descobriu-se que as partículas de glicogênio α têm dois estados estruturais nos eucariotos, ou seja, um estado frágil e um estado estável. Aqui, fragilidade significa a dissociação de partículas α maiores em partículas β menores na presença de um agente caotrópico como o DMSO². Análises posteriores descobriram que as partículas de glicogênio α no fígado diabético são consistentemente frágeis³ e as partículas frágeis α se degradam muito mais rapidamente do que as partículas α estáveis⁴. Assim, a fragilidade estrutural do glicogênio pode exacerbar as condições hiperglicêmicas no diabetes ^2,4, o que torna a partícula de α frágil um potencial biomarcador patológico do diabetes em nível molecular. No entanto, a existência de partículas de glicogênio α em procariontes é relatada apenas esporadicamente⁵, e não há relato dos dois estados estruturais diferentes de glicogênio α partículas em bactérias.

Para entender as funções fisiológicas das partículas de glicogênio bacteriano, é essencial determinar a estrutura fina das moléculas de glicogênio, o que requer isolamento de glicogênio com rendimento máximo e degradação mínima¹. Até agora, várias técnicas foram desenvolvidas para extração de glicogênio, incluindo, mas não se limitando a, extração com água quente, extração com ácido tricloroacético (TCA) e extração alcalina quente (hidróxido de potássio, KOH)⁶. Além disso, outro método comumente utilizado para isolamento de glicogênio eucariótico, o método de ultracentrifugação por gradiente de densidade de açúcar (SDGU), também foi relatado para isolamento de glicogênio bacteriano em Selenomonas ruminantium e Fibrobacter succinogenes ^7,8. Embora os prós e contras desses métodos tenham sido amplamente discutidos em estudos eucarióticos ^9,10, raramente há estudos comparativos de estruturas finas de glicogênio isoladas por diferentes métodos de extração em bactérias do ponto de vista das estruturas de partículas de glicogênio.

Neste estudo, esse problema foi abordado usando Escherichia coli BL21 (DE3) como organismo modelo. Um total de quatro métodos de extração de glicogênio foram comparados, a saber, extração em água quente precipitada por TCA (TCA-HW), extração em água fria precipitada por TCA (TCA-CW), extração em solução quente de KOH a 30% (KOH-HW) e extração em água fria usando ultracentrifugação com gradiente de densidade de sacarose (SDGU-CW). A distribuição do tamanho das partículas de glicogênio foi então medida por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), enquanto a distribuição do comprimento da cadeia foi detectada por eletroforese de carboidratos assistida por fluoróforo (FACE), ambas usadas para avaliar a qualidade dos métodos de extração. Além disso, a estabilidade e fragilidade das partículas de glicogênio α bacteriano também foram comparadas entre os vários métodos de extração, comparando a distribuição do tamanho das partículas antes e depois do tratamento com o agente caotrópico comumente usado, dimetilsulfóxido (DMSO). Os procedimentos detalhados para extração de glicogênio e caracterização estrutural são apresentados a seguir. Em resumo, o método SDGU-CW tem o melhor efeito geral em termos de integridade estrutural do glicogênio e, portanto, é recomendado para extração de glicogênio bacteriano em futuros estudos relevantes.

Protocolo

1. Cultura e coleta de bactérias

1. Ressuscite E. coli BL21 (DE3) do estoque de glicerol bacteriano (-80 ° C) inoculando a placa de ágar LB estéril (10 g / L de triptona, 5 g / L de extrato de levedura, 10 g / L de NaCl e 15 g / L de ágar). Coloque a placa em uma incubadora padrão e cultive durante a noite a 37 °C.
2. Pegue uma única colônia e inocule-a em um meio líquido LB estéril de 10 mL (10 g / L de triptona, 5 g / L de extrato de levedura e 10 g / L de NaCl). Misture bem por vórtice e cultura durante a noite a 37 °C com agitação a 220 rpm.
   NOTA: A menos que especificado de outra forma, todas as condições de cultura líquida foram de 37 ° C com uma taxa de agitação de 220 rpm.
3. Transfira 1 mL da cultura de E. coli durante a noite para 100 mL de meio líquido LB estéril e cultive por 5 h. Transfira 50 mL para 1 L de 1x meio mínimo M9 (3 g/L KH₂PO₄, 0,5 g/L NaCl, 6,78 g/L Na₂HPO₄ e 1 g/L NH₄Cl) contendo 0,8% de D-(+)-glicose. Misture bem e cultive por 20 h.
   NOTA: 1x meio mínimo M9 e glicose foram esterilizados separadamente e depois misturados ao esfriar à temperatura ambiente assepticamente.
4. Após cultura por 20 h, centrifugue a solução bacteriana a 6.000 x g por 15 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante. Armazene o pellet celular a -80 °C durante a noite e, em seguida, liofilize o pellet.
5. Sele e armazene o pó bacteriano liofilizado em uma geladeira (-20 ° C) para uso posterior.

2. Extração de glicogênio

1. Extração com água quente precipitada com ácido tricloroacético (TCA-HW)
   1. Pese com precisão 500 mg de pó liofilizado de E. coli BL21 (DE3) e ressuspenda-o em 20 mL de tampão de trietanolamina (TEA) 0,05 M gelado. Use um triturador de células ultrassônico (25% de energia, 4 ° C) para interromper as células bacterianas por 3 minutos (ciclos de trabalho de 30 s e intervalos de 2 s). Certifique-se de que não haja pellets óbvios na solução.
      NOTA: A ruptura celular foi realizada no gelo. Ajuste o pH do tampão TEA para pH 7 por adição de HCl e armazene em temperatura ambiente.
   2. Transferir todo o homogeneizado bacteriano para dois tubos de ultracentrífuga de 10,4 mL (10 mL/tubo). Encha os tubos com água deionizada até o topo e centrifugue a 104.000 x g em uma ultracentrífuga a 4 °C por 90 min. Descarte o sobrenadante.
   3. Adicione 2 mL de água deionizada para ressuspender o pellet em cada tubo. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 50 mL e adicione água deionizada até um volume final de 20 mL. Aqueça e ferva por 5 min para desnaturar todas as proteínas.
   4. Centrifugar a suspensão durante 10 min a 18.000 x g e reter o sobrenadante (S1). Tratar o precipitado da mesma forma que no passo 2.1.3. Agrupe o novo sobrenadante (S2) com S1.
   5. Adicione 50% de TCA (0,1 volume) ao sobrenadante (S1+S2) e coloque a mistura no gelo por 10 min para precipitar macromoléculas como DNA, RNA, proteínas, etc. Centrifugue a mistura a 18.000 x g por 10 min e misture o sobrenadante com 1,5 volume de etanol absoluto.
      NOTA: A concentração de TCA é de 50% v/v. Para armazenamento, mantenha-o longe da luz.
   6. Precipite o glicogênio no gelo por 20 min e centrifugue a 18.000 x g por 10 min. Despeje o sobrenadante.
   7. Dissolva o pellet em 5 mL de ddH₂O e, em seguida, adicione 5 mL de etanol absoluto gelado. Incubar a solução durante a noite a 4 °C e centrifugar a 18.000 x g durante 10 min. Rejeitar o sobrenadante e guardar o sedimento.
   8. Repita as etapas de "lavagem e precipitação" como na etapa 2.1.7 mais duas vezes.
   9. Finalmente, dissolva o glicogênio precipitado em 400 μL de ddH₂O em um tubo de 2 mL, pré-congele a -80 ° C e liofilize para obter o pó de glicogênio seco.
2. Extração de água fria precipitada com ácido tricloroacético (TCA-CW)
   NOTA: O método TCA-CW é o mesmo que o método TCA-HW, exceto que, após descartar o sobrenadante, trate o pellet sem ferver (consulte a etapa 2.1.3) e ressuspenda-o em 20 mL de ddH₂O contendo 1 mg / mL de coquetel inibidor de protease.
   1. Para preparar uma solução de coquetel de inibidores de protease de 1 mg / mL, dissolva 50 mg de coquetel de inibidores de protease em 1 mL de água deionizada e dilua na proporção de 50:1 (água deionizada: solução de coquetel de inibidores de protease).
3. Extração de água fria por ultracentrifugação com gradiente de densidade de sacarose (SDGU-CW)
   1. Dissolva e homogeneize 1 g de pó de E. coli liofilizado em 4 mL de tampão de extração de glicogênio (GEB) com um coquetel inibidor de protease de 1 mg / mL.
      NOTA: O GEB consiste em 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 50 mM de NaF e 5 mM de pirofosfato de sódio. O GEB precisa ser ajustado para pH 8 com HCl.
   2. Use um triturador de células ultrassônico (25% de energia, 4 °C) para interromper as células bacterianas por 3 min (ciclos de trabalho de 8 s e intervalos de 9 s). Certifique-se de que todo o processo seja realizado no gelo. Após a sonificação, transfira o homogeneizado bacteriano para um tubo de centrífuga, encha-o com GEB até um volume final de 10 mL e vortex o tubo para misturar.
      NOTA: Não homogeneizar por muito tempo, pois o calor gerado pode degradar o glicogênio.
   3. Centrifugue a 6.000 x g por 10 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga de 10,4 mL, encha o tubo até o topo com GEB e, em seguida, centrifugue a 360.000 x g por 2 h a 4 ° C.
      NOTA: Certifique-se de que o tubo esteja cheio e que não haja bolhas de ar.
   4. Rejeitar o sobrenadante após centrifugação e ressuspender o precipitado com 2 ml de água desionizada.
   5. Em um novo tubo de ultracentrífuga, coloque lentamente 4 mL de solução de sacarose a 75% com 4 mL de solução de sacarose a 37,5%. Em seguida, colocar a suspensão obtida no passo 2.3.4 sobre a solução de sacarose e completar com água desionizada (ver figura 1).
      NOTA: A concentração de sacarose é de 75% [v/v] e 37,5% [v/v]. Tenha cuidado ao fazer o gradiente de densidade de sacarose e certifique-se de que haja uma estratificação observável entre as duas soluções de sacarose. Além disso, certifique-se de que não haja bolhas de ar no tubo da ultracentrífuga.
   6. Centrifugue a 360.000 x g por 2,5 h a 4 ° C e descarte o sobrenadante. Dissolver o pellet em 200 μL de água desionizada. Adicione 800 μL de etanol absoluto para precipitação de glicogênio.
   7. Precipitar glicogênio a -20 °C durante a noite. Centrifugue a 4.000 x g por 10 min a 4 °C e descarte o sobrenadante.
   8. Dissolva o pellet resultante em 400 μL de ddH₂O em um tubo de 2 mL, pré-congele a -80 °C e liofilize para obter o pó de glicogênio seco. Conservar o pó de glicogénio seco a 4 °C para análise estrutural.
      NOTA: O procedimento detalhado é ilustrado na Figura 1.
4. Extração quente de solução de hidróxido de potássio a 30% (KOH-HW)
   1. Ferva o pó liofilizado de E. coli (50 mg) em 1 mL de KOH a 30% [p / v] por 1 h.
   2. Adicionar 67% de etanol [v/v] contendo 15 mM de LiCl para precipitação a -20 °C durante pelo menos 1 h. Centrifugar as amostras a 16.000 x g a 4 °C durante 20 min.
      NOTA: 67% [v/v] de etanol com 15 mM de LiCl contém 0,6358 g de LiCl, 67 mL de etanol absoluto e 33 mL de água deionizada.
   3. Dissolva novamente os grânulos em 1 mL de ddH₂O e aqueça por 10 min a 95 °C com agitação intermitente.
   4. Repetir o passo de precipitação do etanol mais três vezes, conforme descrito no passo 2.4.2. Dissolva novamente o pellet final em 400 μL de ddH₂O em um tubo de 2 mL, pré-congele a -80 ° C e liofilize para obter pó de glicogênio seco.

3. Determinação da estrutura do glicogênio

1. Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)
   1. Ressuspenda o pó de glicogênio em solução salina tamponada com Tris 50 mM (pH 7) com uma concentração final de 1 mg / mL.
   2. Faça uma diluição de 10 vezes da suspensão e aplique a suspensão diluída na grade de cobre de 400 mesh de descarga luminescente.
   3. Após 2 min, retire o excesso de amostra da grade usando um papel de filtro e mante a grade com 2-3 gotas de acetato de uranila a 1%.
   4. Utilizar um microscópio electrónico de transmissão a 75 kV para examinar as preparações.
2. Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)
   1. Preparação da fase móvel: preparar soluções de azida sódica a 0,02% (p/p) e nitrato de sódio a 50 mM em água deionizada e filtrar através de uma membrana filtrante de 0,45 μm. Use o banho-maria oscilante ultrassônico para sonicar a solução por mais de 15 min para remover bolhas de ar.
   2. Preparação da amostra: Use a fase móvel para dissolver o pó de glicogênio de modo que a concentração final seja de 1 mg/mL. Incubar a solução a 80 °C durante a noite num termomisturador. Centrifugue a amostra dissolvida a 6.000 x g por 10 min à temperatura ambiente e transfira o sobrenadante para um frasco SEC padrão.
   3. Preparação de amostras de glicogênio tratadas com DMSO
      1. Dissolver 1 mg de glicogénio em pó em 300 μL de DMSO e incubar a 80 °C durante a noite num termomisturador. Adicione 4x volume de etanol para precipitar o glicogênio e centrifugue a solução a 6.000 x g.
      2. Lavar o pellet duas vezes com etanol, dissolver o pellet em ddH₂O e liofilizar.
      3. Analise o pó de glicogênio liofilizado via SEC preparando amostras conforme descrito acima.
   4. Use o sistema SEC com pré-colunas e 1000 e 10000 colunas para a análise da distribuição do tamanho das partículas de glicogênio. Mantenha as colunas a 80 °C e a vazão a 0,3 mL/min.
3. Eletroforese de carboidratos assistida por fluoróforo (FACE)
   1. Desramificação de glicogênio
      NOTA: Ao usar o FACE para detectar a distribuição do comprimento da cadeia (CLD), todas as amostras a serem testadas precisam passar pelo pré-tratamento de desramificação.
      1. Adicione 0,5 mg de glicogênio em pó, 90 μL de água quente (90 ° C), 1,5 μL de solução de NaN₃ , 3,5 μL de isoamilase (200 U / mL) e 8 μL de tampão ácido acético-acetato de sódio (pH 3,5) a um tubo de ensaio.
         NOTA: A isoamilase é adicionada para cortar especificamente a cadeia ramificada da amostra a ser testada. A isoamilase é uma enzima desramificante que pode destruir especificamente a ligação α-(1-6) sem destruir a ligação α-(1-4), de modo que pode clivar especificamente a cadeia lateral do glicogênio sem destruir a estrutura da cadeia principal.
      2. Incubar a mistura a 37 °C durante 3 h num termomisturador. Depois de tornar o pH neutro com 8 μL de solução de NaOH 0,1 M, incube a mistura a 80 °C por 1 h em um termomisturador.
      3. Adicione 4x o volume de etanol absoluto à mistura para precipitar o glicogênio. Em seguida, centrifugue a 6.000 x g por 10 min em temperatura ambiente. Lave o pellet duas vezes com etanol, dissolva o pellet em ddH₂O e liofilize.
   2. Preparação da solução fluorescente
      1. Centrifugue o frasco de reagente APTS (sal trissódico de ácido 8-aminopireno-1,3,6-trissulfônico) (cada frasco contém 5 mg de APTS) a 4.000 x g por 2 min. Adicione 50 μL de solução de ácido acético a 15% para dissolver o pó, misture bem e centrifugue a 4.000 x g por 2 min em temperatura ambiente para obter uma solução de ácido acético APTS 0,2 M.
         NOTA: Mantenha a solução APTS na geladeira a -20 °C.It deve ser usada completamente dentro de duas semanas depois de aberta. Caso contrário, ele será desativado. APTS é um corante carregado negativamente comumente usado que se liga à extremidade redutora da cadeia de glicogênio. Como as cadeias com diferentes graus de polimerização (DP) carregam apenas uma carga negativa, o FACE pode separá-las com base em suas diferentes relações massa-carga. Desta forma, sinais de diferentes valores de DP são detectados pelo detector de fluorescência.
   3. Transfira o glicogênio desramificado para um tubo de ensaio e adicione 1,5 μL de solução de APTS e 1,5 μL de solução de cianoborohidreto de sódio. Incubar a 60 °C durante 1,5 h no escuro. Adicione 80 μL de água deionizada, centrifugue a 4.000 x g por 10 min em temperatura ambiente e mantenha o sobrenadante.
   4. Introduzir a amostra no sistema de eletroforese capilar injetando durante 3 s a 0,5 psi (3,4 kPa acima da pressão atmosférica).
      NOTA: Os glucanos lineares marcados com fluorescência foram separados por meio de tensão aplicada de 30 kV e uma corrente aproximada de 14 mA a 25 °C. As áreas dos picos forneceram quantidades relativas de glucanos com diferentes massas (grau de polimerização (DP) dos glucanos em picos adjacentes diferiu em 1 DP). A temperatura da amostra foi mantida em 18 °C.

Resultados

Distribuição de tamanho de partículas de glicogênio
Uma série de estudos mostrou que as partículas de glicogênio α no fígado diabético são frágeis e facilmente quebradas no disruptor de ligações de hidrogênio DMSO 11,12,13,14. O presente estudo testou como o tamanho das partículas e a estabilidade estrutural mudaram para o gl...

Discussão

O glicogênio é uma importante reserva de energia que foi identificada em muitas bactérias¹⁶. Para dissecar as funções fisiológicas das partículas de glicogênio, é essencial ter uma melhor compreensão da estrutura fina das moléculas de glicogênio. Até agora, uma variedade de métodos foi desenvolvida para extrair glicogênio da cultura bacteriana. No entanto, diferentes distribuições de tamanho de partículas de glicogênio foram observadas a partir ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC system	Agilent	1260 infinity II	Particle size distribution
Analytical column	PSS	10-1000	-
Centrifuge	Eppendorf	5420	-
Filter membrane	Cambio	Km-0220	-
Fluorescence-assisted capillary electrophoresis system	Beckman Coulter	-	Chain length distribution
Freeze dryer	Xinzhi	SCIENTZ-10N	Lyophilization of bacteria and glycogen
Freezer	Thermo Fisher	Forma 900	Sample storage
Guard column	PSS	SUPPERMA	-
Incubator	Thermo Fisher	PR505750R-CN	-
Low-speed large-capacity centrifuge	Hexi	HR/T20MM	Sample centrifugation
Multiskan FC microplate reader	Thermo Fisher	1410101	-
Optima XPN ultracentrifuge	Beckman	XPN-100/90/80	For glycogen
Oscillator	Xinbao	SHZ-82	-
PA-800 Plus System	Beckman Coulter	A66528	-
pH meter	Mettler Toledo	FE28 -TRIS	-
Refractive index detector	Wyatt	Optilab T-rEX	-
Refrigerator	Haier	BCD-406WDPD	-
Thermomixer	Shanghai Jingxin	JXH-100	Sample incubation
Transmission electron microscope	Hitachi Corporation	H-7000	Glycogen particle morphology
Ultracentrifuge tube	Beckman	355651	-
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinzhi	Scientz-IID	Bacteria disruptor
Ultrasonic oscillating water bath	Jietuo	JT-1027HTD	-
Vortex mixer	Tiangen	OSE-VX-01	-
Water system	Merck Millipore	H2O-MM-UV-T	Deionized water
Material
8-Aminopyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid Trisodium Salt	Sigma-Aldrich	196504-57-1	-
Absolute ethanol	Guoyao	10009228	-
Agar powder	Solarbio	A1890	-
Alpha-amylase	Megazyme	E-BLAAM-40ML	-
Amyloglucosidase	Megazyme	E-AMGDF-40ML	-
cOmplete Mini	Roche	4693159001	-
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1kg	-
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC	Glycogen quantification
Dimethyl sulfoxide	Vicmed	Vic147	Chaotropic agent
E. coli BL21(DE3)	Tiangen	CB105-02	-
Ethylene diamine tetra-acetic acid	Vicmed	Vic1488	-
Glacial acetic acid	Guoyao	10000218	-
Glycerol	Guoyao	10010618	Bacterial storage
Hydrochloric acid	Guoyao	10011008	-
Hydroxymethyl aminomethane	Sigma-Aldrich	V900483-500g	-
Isoamylase	MegaZyme	9067-73-6	Glycogen debranch
Lithium chloride	Sigma-Aldrich	62476-100g	-
M9, Minimal Salts, 5×	Sigma-Aldrich	M6030-1kg	Bacterial culture
Potassium hydroxide	Guoyao	10017008	-
Pullulan standard	PSS	-	-
Sodium acetate trihydrate	Guoyao	10018718	-
Sodium azide	Sigma-Aldrich	26628-22-8	-
Sodium chloride	Guoyao	10019318	Bacterial culture
Sodium cyanoborohydride	Huaweiruike	hws001297	-
Sodium diphosphate	Sigma-Aldrich	71515-250g	-
Sodium Fluoride	Macklin	S817988-250g	-
Sodium hydroxide	Guoyao	10019762	-
Sodium nitrate	Guoyao	10019928	-
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	V900195-500g	-
Sucrose	Guoyao	10021463	-
Trichloroacetic acid	Guoyao	40091961	-
Tryptone	Oxoid	LP0042	Bacterial culture
Yeast Extract	Oxoid	LP0021	Bacterial culture