前子宫 从前肠胚形成到晚期器官生成的小鼠胚胎培养

摘要

增强的全胚胎培养平台允许植入后小鼠胚胎的连续和稳健的 宫外 发育长达六天，从前肠胚形成阶段到高级器官发生。在该协议中，我们详细介绍了使用静态板和旋转瓶系统成功培养胚胎的标准程序。

摘要

植入后哺乳动物胚胎培养方法通常效率低下，仅限于解剖子宫后的短时间。最近已经开发了平台，用于从卵筒阶段到晚期器官发生的高度健壮和长时间的小鼠胚胎 宫外 培养。这些平台使孕前胚胎（E5.5）能够适当和忠实地发育，直到后肢形成阶段（E11）。在这些环境中，晚期胃泌尿胚胎（E7.5）在旋转瓶中生长，而从预气胚形成阶段（E5.5或E6.5）的扩展培养需要静态和旋转瓶培养的组合。此外，对_O2 和_CO2 浓度、气体压力、葡萄糖水平的敏感调节以及使用特定的 宫前 培养基对于胚胎的正常发育至关重要。这里提供了用于延长 宫前 小鼠胚胎培养的详细分步方案。从原肠胚形成到器官发生， 在子宫外 生长正常小鼠胚胎的能力代表了表征胚胎发育过程中不同实验扰动效应的宝贵工具。

引言

哺乳动物胚胎的宫内发育限制了对植入后发育早期阶段的研究^1，2。发育中的胚胎的不可接近性阻碍了对胚胎植入子宫后发生的关键发育过程的理解，例如动物身体计划的建立，生殖层的规范或组织和器官的形成。此外，早期植入后胚胎的尺寸非常小，使得在^E103之前的子宫内通过活体成像难以观察。在这些阶段无法观察和操纵活胚胎，限制了对早期植入后胚胎发生的研究，仅限于发育过程中的快照。

植入前哺乳动物胚胎体外培养的方案已建立良好，可靠且经常使用⁴。然而，建立能够支持哺乳动物胚胎正常生长的宫外培养系统的尝试收效甚微⁵。一个多世纪以来，人们已经提出了各种培养技术，主要是通过在常规静态板^6，7，⁸或旋转瓶（滚筒培养）中培养胚胎^5，9，10。事实证明，这些平台有助于扩大植入后哺乳动物发育的知识^11，12，尽管对于正常胚胎存活效率低下且仅限于短期。胚胎早在培养开始后24-48 h就开始出现发育迟缓和形态异常。

本研究为建立 宫前 胚胎培养系统提供了详细说明，该系统允许在植入后发育长达六天的条件下从前胚形成阶段持续发育到高级器官发生阶段¹³。本文描述了通过在静态板和辊培养平台上结合培养，支持E7.5胚胎（神经板和头褶阶段）生长直至后肢形成阶段（~E11）和E5.5 / E6.5扩展培养的改进的滚轮培养方案。

研究方案

所有动物实验均根据魏茨曼科学研究所的动物保护指南进行，并得到相关魏茨曼研究所IACUC的批准（#01390120-1，01330120-2，33520117-2）。根据赫尔辛基兰巴姆医疗中心委员会（#RMB-0452-15）的批准，要求健康的孕妇知情同意从脐带采集血液。健康成年人被要求根据魏茨曼科学研究所赫尔辛基委员会的指导方针（#1566-3）进行知情同意。

1. 培养基准备

1. 使用500mL不含酚红和L-谷氨酰胺的Dulbecco改性鹰培养基（DMEM）制备解剖培养基，补充10%胎牛血清，5m青霉素/链霉素，并使用0.22μm过滤器进行过滤灭菌。
   注意:将解剖培养基保持在4°C下长达1个月。
2. 使用25%的胚胎培养基加上50%的大鼠血清和25%的人脐带血血清（HCS）或人成人血清（HBS），每天在生物罩内新鲜制备 子宫前 胚胎培养基（EUCM）。
3. 为了制备胚胎培养基，在500毫升不含酚红和L-谷氨酰胺的DMEM中加入5毫升谷氨酰胺，5毫升HEPES和5毫升青霉素/链霉素。准备10-15 mL等分试样，并将其储存在4°C下长达两个月。
   注意:如果遇到任何污染，请将抗生素浓度加倍。
4. 在56°C下加热灭活大鼠血清30-45分钟，并通过0.22μm聚偏二氟乙烯过滤器过滤。在灭活当天使用血清进行培养。解冻HCS或HBS并立即将其用于实验。
   注意:商业大鼠血清提供一致的结果（至少测试了4个批次，没有明显的变化）。或者，可以在 内部 获得高质量的大鼠血清^{，如前所述8，14}。如果HCS不可用，请将其替换为 内部收集的HBS。大鼠血清，HCS和HBS可以重新冷冻一次，并保持在-20°C以在另一天使用。解冻并将重新冷冻的血清与更大体积的新鲜解冻血清混合，不要重新冷冻。

2. 人脐带血血清和人成人血清的采集

1. 为了分离HCS，请在预定剖宫产当天从健康孕妇那里收集脐带血。
   1. 将脐带双夹在距脐带5-7厘米处，并在婴儿分娩后立即在钳子之间截取。
   2. 使用大口径14 G针头和50 mL注射器直接从脐静脉手动抽血，同时胎盘保持在 原位 以避免任何溶血痕迹。
      注意:在婴儿从手术场移出后收集血液，并抽取脐血进行临床试验。
2. 将收集的血液分配到5mL辅助凝血剂无菌试管中，并立即将其转移到4°C下15分钟以允许完全凝血。将凝固的试管在4°C下以2，500× g 离心10分钟。
3. 丢弃有溶血迹象的试管（粉红色血清）。使用5 mL移液器收集血清（黄色），并通过0.22μm过滤器过滤。立即在56°C水浴中热灭活血清45分钟。
4. 准备1-1.5mL等分试样的灭活血清，并将其储存在-80°C下长达六个月。如果需要，使用干冰在-70°C下运输。
5. 对于成人血清采集，从健康成人身上抽血，并按照与脐带血血清相同的方案立即分离血清。将HBS作为热灭活和过滤的等分试样在-80°C下储存长达六个月。
   注意: 内部 新鲜制备的人脐带血清和成人人血清比市售血清具有优越的效果。从健康女性（18 岁以上和 40 岁以下）收集 HCS，计划进行剖腹产。排除阴道分娩的妇女和患有任何慢性疾病或活动性疾病（包括妊娠糖尿病或高血压）的妇女。

3. 胚胎从E7.5到E11的 子宫 外滚轮培养

1. 设置辊培养箱和气体调节器
   1. 使用滚筒培养箱系统培养E7.5或更先进的胚胎。在胚胎解剖之前，在37°C下打开旋转器和加热装置至少1小时。将高压灭菌水加入进气瓶和出气试管中。
      注意:将温度计放在旋转滚筒旁边，并经常检查培养箱内温度的稳定性。尽快打开培养箱，因为延长的开放时间会增加温度并影响胚胎发育。必要时，在进气瓶和出口试管中加入更多的高压灭菌水，以在培养过程中将其保持在最低限度的一半容量。用布覆盖培养箱，保护培养箱内的胚胎免受光线照射。
   2. 按下主开关，然后打开氧气/氮气和 _CO2 控制器，打开气体调节模块（图 1A）。使用相应的控制器将氧气和 _CO2 值设置为 5%。打开气体调节器，通过移动压力变送器中的电压开关，将气体压力设置为~6.5-7磅/平方英寸（psi）（图1B）。使用数字压力表确认气体压力值。
   3. 通过检查在精密培养箱内分配的充满水的试管内产生的气泡速率来监测气体流量。通过关闭/打开水瓶盖上的气流阀来设置适当的气泡速率。确保气流允许以 每秒2-4个气泡 的速率形成气泡，或将气泡流设置为气泡流向充满水的出口管的第一个点。
   4. 用2mL培养基填充培养瓶，并将其插入空心旋转滚筒中进行预平衡1小时。使用空心硅包将瓶子密封到滚筒上。使用固体蹦极密封旋转滚筒中的空隙。
      注意:出口管中没有气泡（没有气体通过系统）或异常高的气体流量可能会影响胚胎发育。在出口试管缺乏气泡流的情况下，检查所有硅桶是否正确定位在旋转滚筒中并密封系统，并检查水瓶是否正确关闭并且所有管道都正确连接。没有气泡进入水瓶可能表明气体调节器出现故障。
2. 从怀孕小鼠中解剖小鼠胚胎
   1. 将解剖培养基在37°C和5%CO ₂ 的培养箱内预先平衡至少1小时。将盖子稍微打开以允许气体交换。
   2. 用宫颈脱位处死怀孕的雌性，用70%乙醇清洁雌性的腹部，用剪刀剪开皮肤和腹壁。找到子宫的一端，并在卵巢和子宫之间的交叉处切开。接下来，沿着子宫切开直到另一端，然后将其转移到充满室温Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）的100毫米培养皿中。
      注意:建议使用非激素启动，自然交配的雌性。
   3. 在DPBS中快速清洗概念，并成对切割，以方便胚胎处理。将所有概念对移动到60毫米培养皿中的预先平衡的解剖培养基中，并切成单独的概念。
   4. 通过使用一对粗镊子撕裂子宫组织来去除概念的子宫壁。使用细小的显微外科钳切开梨形蜕膜的尖端。将镊子插入胚胎旁边，平行于其长轴，并打开镊子将蜕膜分成两半。
   5. 最后，通过从蜕膜上抓住胚胎并使用细镊子将顶叶卵黄囊从胚胎上剥离，将完整的外壁锥体附着在卵筒上。
      注意:为避免影响胚胎，请在装有37°C加热板的显微镜上进行解剖，最长30-40分钟。一次解剖一窝胚胎。
   6. 解剖后，立即使用玻璃巴斯德移液管将胚胎转移到充满平衡解剖介质的新板中，以防止胚胎粘附在组织碎片上。
   7. 选择那些在神经板/早期头折叠阶段的胚胎，在外胚层中显示没有损伤，并将每瓶5-6个胚胎转移到预先交换的玻璃培养瓶中。
      注意:要准备玻璃巴斯德移液器，请使用玻璃切割器将其移液器的开口切成足够大小以适合胚胎，并将其保存在乙醇中以避免污染。在移植胚胎之前，用PBS清洗玻璃移液器。将胚胎转移到培养瓶中时，请确保携带尽可能少的解剖培养基，以避免稀释EUCM。
   8. 将瓶子置于37°C的旋转培养系统中，在5%_O2 和5%CO ₂的气氛中。
   9. 每天培养，从培养箱中逐个取出瓶子，以在立体显微镜下评估胚胎发育。取出瓶子时，确保用实心瓶盖住滚筒中的空孔。切下无菌塑料巴斯德移液管的尖端以适合胚胎大小，并将胚胎移动到培养皿中以方便观察。确保胚胎始终被培养基覆盖。
      注意:尽量减少胚胎在培养箱外的时间，以避免由于体温降低而对胚胎产生不利影响。小心处理胚胎，避免卵黄囊血管破裂，影响胚胎存活。
   10. 在培养第1天（相当于E8.5），将3个胚胎组转移到装有2mL新鲜和预先平衡的EUCM的新瓶中，其中含有额外的3mg / mL D-葡萄糖和13%_O2，5%CO ₂的气体混合物。
   11. 48小时后（相当于E9.5），将两个胚胎的组转移到一个新瓶中，在18%_O2 和5_%CO 2的气体气氛中，新鲜预热的EUCM加3.5mg / mL葡萄糖。
   12. 在培养72小时（相当于E10.5）时，将每个胚胎移动到含有1.5-2mL新鲜培养基的单独瓶中，其中补充了4mg / mL葡萄糖和21%_O2 和5%_CO2的气体供应。
       注意:胚胎在第4天培养的午夜左右达到最大生长。
   13. 使用细镊子去除卵黄囊和羊膜，并分离脐带以正确观察胚胎形态。关闭气体调节模块和精密培养箱。
       注意:根据胚胎阶段，通过在滚筒培养物中的玻璃瓶内孵育，预先平衡培养基1小时，并具有足够的气体气氛。每次使用后，用流动的蒸馏水进行三次洗涤，然后在70%乙醇中浸泡过夜洗涤，以清洁培养瓶和所有培养箱玻璃器皿。用流动的蒸馏水重新洗涤三次，让瓶子干燥过夜，然后用高压灭菌器灭菌。同样，定期高压灭菌硅塞。用70%乙醇彻底清洁所有解剖工具，并对其进行干燥消毒。

4. 胚胎培养期从E5.5/E6.5延长至E11

1. 在静态板中培养预原肠胚形成（E5.5）和早期原肠胚形成（E6.5）胚胎，直到早期体参阶段（E8.5）。
2. 在37°C下用5%CO ₂ 的培养箱中预先平衡解剖培养基1小时。
   注:要进行气体交换，请勿完全关闭管盖。
3. 通过向每个孔中加入250μL新鲜制备的EUCM来制备培养板。将板置于37°C的_CO2 培养箱内进行预交换。
   注意:虽然8孔板非常适合胚胎生长，但可以通过根据板的大小调整培养基的体积在任何其他板中进行培养。
4. 按照E7.5描述的技术将卵圆柱形胚胎从子宫中解剖出来。取出胚胎的顶叶卵黄囊，并将完整的外壁锥体附着在卵筒上。
5. 使用微量移液管将单个胚胎转移到8孔板的每个孔中，并将板置于37°C下具有5%CO ₂ 的培养箱内。
6. 在立体显微镜下对胚胎进行成像，并仅选择具有良好形成的羊膜腔的胚胎进行培养，没有明显的损伤并且没有Reichert膜。
   注意:使用20μL移液器吸头转移E5.5胚胎，使用200μL吸头转移E6.5胚胎。对于从E6.5开始培养，HCS可以被新鲜收集的HBS取代。
7. 培养24小时后，取出一半培养基并加入250μL新鲜制备的预热EUCM，确保胚胎始终浸入培养基中。对于从E5.5开始培养的情况，经过两天的培养（相当于E7.5），除去200μL并加入250μL新的EUCM。
   注意:在静态培养过程中，胚胎可能会附着在板上（主要是在使用塑料板时），这将严重损害胚胎发育。胚胎附着在培养E5.5胚胎的第一天更频繁。为了防止附着，使用精细的无菌镊子小心地将胚胎推离板表面。验证只有外壁锥体仍然附着在板的表面上。
8. 在早期somite阶段将胚胎转移到滚筒培养物中（4-7个somite;经过三天的培养，对于在E5.5处开始的胚胎，对于在E6.5开始的培养物，经过两天），遵循前面描述的E8.5阶段胚胎的相同适应症。
   注意:在与上述不同的体参阶段将胚胎转移到滚筒培养物中会导致进一步发育失败。与E7.5 宫前 培养物相比，可以将胚胎保持在21%氧气和5%CO ₂的恒定大气中，提供比动态氧气浓度的气氛略高的胚胎发育效率。

结果

描述的E7.5胚胎（晚期原胚期）的滚轮培养条件支持恒定和正常的胚胎生长，4个培养日后的平均效率接近75%（图2 和 表1）。胚胎发育的效率可能因不同的小鼠遗传背景而异，但始终是稳健的（图2C）。补充HBS代替HCS在 宫前 培养4天后产生约68%的效率，这取决于小鼠的遗传背景（图2D 和 表2）。 子...

讨论

本文介绍的培养方案可以在子宫外维持适当和连续的小鼠胚胎发育长达六天，从E5.5到E11。以前，处于这些发育阶段的胚胎只能在短时间内（长达48小时）在培养物中正常发育¹⁵。将气体调节模块耦合到滚筒培养箱以精确控制氧气浓度和高压气体压力对于本文所述的正确小鼠胚胎培养至关重要。将气体压力增加到7 psi可增强氧气扩散，允许胚胎在高达21%O2 / 5%_CO2的大气...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore size filter (250 mL)	JetBiofil	FCA-206-250
0.22 µm pore size syringe PVDF filter	Millipore	SLGV033RS
8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat	iBidi	80827/80826
Bottle with adaptor cap for gas inlet	Arad Technologies
Bungs (Hole)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 06	Used to seal the bottles to the drum
Bungs (Solid)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 07	Used to seal the rotating drum
Culture bottles	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 03/BTC 04	Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04
D(+)-glucose Monohydrate	J.T. Baker
Diamond knife	Fine Science Tools	10100-30/45
Digital Pressure Gauge	Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd	BX-DPG80
DMEM	GIBCO	11880
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Biological industries	02-020-1A
Fetal Bovine Serum	Biological industries	04-013-1A
Gas regulation module	Arad Technologies	HannaLab1
Glutamax	GIBCO	35050061	glutamine
Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
HEPES	GIBCO	15630056
Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)	Fine Science Tools	11255-20
Pasteur pipettes (glass)	Hilgenberg	3150102
Pasteur pipettes (plastic)	Alexred	SO P12201
Penicillin/Streptomycin	Biological industries	03-031-1B
Petri Dishes (60 mm and 100 mm)	Falcon	351007/351029
Precision incubator system	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC01	BTC01 model with gas bubbler kit
Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)	Greiner Bio-One	#456005
Rat whole embryo culture serum	ENVIGO Bioproducts	B-4520
Stereoscopic microscope equipped with heating plate	Nikon	SMZ18
Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration	Pic Solution
Surgical scissors	Fine Science Tools	14094-11