Ex Utero Pregastrülasyondan İleri Organogenez'e Fare Embriyolarının Kültürü

Özet

Tam embriyo kültürü için geliştirilmiş bir platform, pregastrülasyon aşamalarından ileri organogenezine kadar altı güne kadar postimplantasyon fare embriyolarının sürekli ve sağlam ekstre gelişimini sağlar. Bu protokolde statik plakalar ve dönen şişe sistemleri kullanılarak başarılı embriyo kültürü için standart prosedürü detaylandırıyoruz.

Özet

Postimplantasyon memeli embriyo kültürü yöntemleri genellikle verimsiz ve rahim dışı diseksiyon sonrası kısa sürelerle sınırlı olmuştur. Platformlar son zamanlarda yumurta silindir aşamalarından ileri organogenez kadar fare embriyolarının son derece sağlam ve uzun süreli ex utero kültürü için geliştirilmiştir. Bu platformlar, öngaztasyon embriyolarının (E5.5) arka ekstremite oluşum aşamasına (E11) kadar uygun ve sadık gelişimini sağlar. Geç gastrulating embriyoları (E7.5) bu ortamlarda dönen şişelerde yetiştirilirken, pregastrülasyon aşamalarından (E5.5 veya E6.5) genişletilmiş kültür statik ve dönen şişe kültürlerinin bir kombinasyonunu gerektirir. Ek olarak, _O2 ve _CO2 konsantrasyonunun hassas düzenlenmesi, gaz basıncı, glikoz seviyeleri ve belirli bir ex utero kültür ortamının kullanımı uygun embriyo gelişimi için kritik öneme sahiptir. Burada, genişletilmiş ex utero fare embriyo kültürü için ayrıntılı bir adım adım protokol sağlanmaktadır. Normal fare embriyolarının gastrülasyondan organogeneze kadar ekstresini yetiştirme yeteneği, embriyonik gelişim sırasında farklı deneysel pertürbasyonların etkisini karakterize etmek için değerli bir aracı temsil eder.

Giriş

Memeli embriyosunun intrauterin gelişimi postimplantasyon gelişiminin erken evrelerinin incelenmesini ^{sınırlamıştır1,2}. Gelişmekte olan embriyonun erişilemezliği, embriyo uterusa implante ettikten sonra meydana gelen hayvan vücut planının oluşturulması, mikrop katmanlarının belirtimi veya doku ve organların oluşumu gibi temel gelişimsel süreçlerin anlaşılmasını engeller. Ayrıca erken postimplane embriyonun çok küçük olması ^E103 öncesi rahim içi görüntüleme ile gözlem yapmayı zorlaştırır. Bu aşamalarda canlı embriyoların gözlemlenememesi ve manipüle edilmesi, erken postimplantasyon embriyogenezinin çalışmasını gelişim sırasında anlık görüntülerle kısıtlamıştır.

Preimplantasyon memeli embriyolarının in vitro kültürü için protokoller iyi kurulmuş, güvenilir ve düzenli olarak ^{kullanılmaktadır4}. Bununla birlikte, uygun memeli postimplantasyon embriyo büyümesini destekleyebilen ex utero kültür sistemleri kurma girişimleri sınırlı başarıya ^sahipti5. Bir asırdan fazla bir süredir, embriyoların geleneksel statik plakalarda ^6,7,8 veya dönen şişelerde (silindir kültürleri)5,9,10 kült haline getirildiği için çeşitli kültür teknikleri önerilmiştir. Bu platformlar, normal embriyo sağkalımında oldukça verimsiz olmasına ve kısa sürelerle sınırlı olmasına rağmen, implantasyondan sonra memeli gelişimi hakkındaki bilginin genişletilmesinde yardımcı olduğunu ^{kanıtladı11,12}. Embriyolar kültüre başladıktan sonra 24-48 saat gibi erken bir sürede gelişim geriliği ve morfolojik anomaliler göstermeye başladı.

Bu çalışma, pregastrülasyondan ileri organogenez evrelerine kadar altı güne kadar postimplantasyon gelişimine kadar sürekli gelişime izin veren ex utero embriyo kültür sistemini kurmak için ayrıntılı bir açıklama ^{sunmaktadır13}. Bu makalede, E7.5 embriyolarının (sinir plakası ve baş kat aşaması) arka ekskülasyon aşamasına (~E11) kadar büyümesini destekleyen geliştirilmiş silindir kültürü protokolü ve kültürü statik plakalar ve silindir kültürü platformlarında birleştirerek E5.5/E6.5'ten genişletilmiş kültür açıklanmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Weizmann Bilim Enstitüsü Hayvan Koruma Yönergelerine göre gerçeklendi ve ilgili Weizmann Enstitüsü IACUC tarafından onaylandı (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Sağlıklı hamile kadınlardan, Rambam Tıp Merkezi Helsinki Komitesi (#RMB-0452-15) tarafından onaylandığı gibi göbek kordonlarından kan toplamak için bilgilendirilmiş onay vermeleri istendi. Sağlıklı yetişkinlerden, Weizmann Bilim Enstitüsü Helsinki Komitesi'nin (#1566-3) yönergelerine göre kan toplanması için bilgilendirilmiş onayları istendi.

1. Medya hazırlığı

1. Diseksiyon ortamını, %10 fetal sığır serumu, 5 mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiş fenol kırmızısı ve L-glutamin içermeyen 500 mL Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) kullanarak hazırlayın ve 0,22 μm filtre kullanarak filtre sterilize edin.
   NOT: Diseksiyon ortamını 1 aya kadar 4 °C'de tutun.
2. Embriyonik ortamın %25'ini artı %50'sini sıçan serumu ve %25'ini insan göbek kordonu kan serumu (HCS) veya insan yetişkin kan serumu (HBS) kullanarak biyolojik bir davlumbazın içinde her kültür gününde ex utero embriyo kültürü ortamını (EUCM) taze olarak hazırlayın.
3. Embriyonik ortamı hazırlamak için fenol kırmızısı ve L-glutamin olmadan 500 mL DMEM'de 5 mL glutamin, 5 mL HEPES ve 5 mL penisilin/streptomisin ekleyin. 10-15 mL aliquots hazırlayın ve iki aya kadar 4 °C'de saklayın.
   NOT: Herhangi bir kirlenme yaşıyorsanız antibiyotik konsantrasyonu iki katına çıkarın.
4. Sıçan serumu 56 °C'de 30-45 dakika ısı inaktive edin ve 0,22 μm polivinylidene difluorid filtreden filtreleyin. Serumu aynı inaktivasyon gününde kültür için kullanın. HCS veya HBS'yi çözün ve deneyler için hemen kullanın.
   NOT: Ticari sıçan serumu tutarlı sonuçlar sağlar (belirgin bir varyasyon olmadan en az 4 lot test edilmiştir). Alternatif olarak, daha önce açıklandığı gibi şirket içinde yüksek kaliteli sıçan serumu elde ^{edilebilir8,14}. HCS kullanılamıyorsa, şirket içinde toplanan HBS ile değiştirin. Sıçan serumu, HCS ve HBS bir kez refrozen edilebilir ve farklı bir günde kullanılmak üzere -20 °C'de tutulabilir. Refrozen serumu daha büyük hacimli taze çözülmüş serumla çözün ve birleştirin ve yeniden çözmeyin.

2. İnsan göbek kordonu kan serumu ve insan yetişkin kan serumu koleksiyonu

1. HCS'yi izole etmek için, planlanan sezaryen doğum gününde sağlıklı hamile kadınlardan göbek kordonu kanı toplayın.
   1. Göbek kordonu umbilicus'tan 5-7 cm uzakta çift kelepçeleyin ve bebeğin doğumundan hemen sonra kelepçeler arasında transect.
   2. Plasenta hemoliz izlerini önlemek için yerinde kalırken, büyük delikli 14 G iğne ve 50 mL şırıngayı doğrudan göbek damarından kullanarak manuel olarak kan çekin.
      NOT: Bebek ameliyat alanından çıkarıldıktan sonra kan toplayın ve klinik testler için göbek kanı çekilmiştir.
2. Toplanan kanı 5 mL prokoagülan steril test tüplerine dağıtın ve tam pıhtılaşmaya izin vermek için hemen 15 dakika boyunca 4 °C'ye aktarın. Pıhtılaşmış test tüplerini 2.500 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin.
3. Hemoliz belirtileri gösteren tüpleri atın (pembe-kırmızı serum). Serumu (sarı renk) 5 mL pipet kullanarak toplayın ve 0,22 μm filtreden geçirin. Serumu 56 °C'lik bir su banyosunda 45 dakika boyunca hemen ısı inaktive edin.
4. Inaktive serumun 1-1,5 mL aliquots'larını hazırlayın ve altı aya kadar -80 °C'de saklayın. Gerekirse kuru buz kullanarak -70 °C'de sevk edin.
5. Yetişkin insan kanı serumu toplanması için, sağlıklı yetişkinlerden kan alıp göbek kordonu kan serumu için açıklanan aynı protokole uyarak serumu hemen izole edin. HBS'yi altı aya kadar -80 °C'de ısı inaktive edilmiş ve filtrelenmiş aliquots olarak saklayın.
   NOT: Yeni olarak şirket içinde hazırlanan insan göbek kordonu serumu ve yetişkin insan serumu, piyasada bulunan seruma üstün sonuçlar verdi. Sezaryen doğum için planlanan 18 yaş üstü ve 40 yaşın altındaki sağlıklı kadınlardan HCS toplayın. Vajinal doğum yapan kadınları ve gestasyonel diyabet veya hipertansiyon da dahil olmak üzere herhangi bir kronik hastalığı veya aktif tıbbi durumu olan kadınları hariç tutun.

3. E7.5'ten E11'e kadar embriyoların ex utero silindir kültürü

1. Silindir kültürü inkübatörü ve gaz regülatörü kuruluyor
   1. Silindir kültürü inkübatör sistemini kullanarak Kültür E7.5 veya daha ileri embriyolar. Embriyo diseksiyonlarından önce rotator'ı ve ısıtma ünitesini 37 °C'de en az 1 saat açın. Gaz giriş şişesine ve çıkış test tüpüne otomatik olarak kapatılmış su ekleyin.
      NOT: Dönen tamburun bitişiğinde bir termometre yerleştirin ve sık sık inkübatörün içindeki sıcaklığın kararlılığını kontrol edin. İnkübatörü mümkün olduğunca çabuk açın, uzun açılış süresi sıcaklığı artıracak ve embriyo gelişimini etkileyecektir. Gerektiğinde, kültür sırasında minimum yarı kapasitede tutmak için gaz giriş şişesine ve çıkış test tüpüne daha fazla otoklavlı su ekleyin. Kuluçka makinesinin içindeki embriyoları bir bezle kaplayarak ışıktan koruyun.
   2. Ana anahtara basarak ve daha sonra Oksijen/Nitrojen ve _CO2 kontrolörlerini açarak gaz regülatör modülünü açın (Şekil 1A). İlgili kontrolörleri kullanarak oksijen ve _CO2 değerlerini %5 olarak ayarlayın. Gaz regülatörünü açın ve basınç vericislerindeki voltaj anahtarını hareket ettirerek gaz basıncını inç kare başına ~6,5-7 pound (psi) olarak ayarlayın (Şekil 1B). Dijital basınç göstergesi kullanarak gaz basıncı değerini onaylayın.
   3. Hassas inkübatörün içine tahsis edilen çıkış suyu dolu test tüpünün içinde oluşturulan kabarcıkların oranını kontrol ederek gaz akışını izleyin. Su şişesinin kapağındaki gaz akış vanasını kapatarak/açarak uygun kabarcık oranını ayarlayın. Gaz akışının saniyede 2-4 kabarcık hızında kabarcık oluşumuna izin verdiğinden emin olun veya kabarcık akışını kabarcıklanmanın su dolu çıkış tüpüne çıktığı ilk noktada ayarlayın.
   4. Kültür şişelerini 2 mL kültür ortamı ile doldurun ve 1 saat önkoşul için oyulmuş dönen tambura takın. Şişeleri tambura kapatmak için oyulmuş silikon bung'ları kullanın. Katı maşaları kullanarak dönen tamburdaki boş alanları kapalı tutun.
      NOT: Çıkış tüpünde kabarcık olmaması (sistemden gaz gelmemesi) veya son derece yüksek bir gaz akışı embriyo gelişimini etkileyebilir. Çıkış test tüpüne kabarcık akışının olmaması durumunda, tüm silikon bungların dönen tamburda ve sızdırmazlık sisteminde düzgün bir şekilde konumlandırılıp konumlandırılmadığını kontrol edin ve su şişesinin düzgün bir şekilde kapatıldığını ve tüm borunun doğru bağlandığını kontrol edin. Su şişesine gelen kabarcıklanma eksikliği, gaz regülatöründeki bir arızaya işaret edebilir.
2. Fare embriyolarının hamile farelerden diseksiyonu
   1. Diseksiyon ortamını 37 °C'de bir inkübatörün içinde ve % 5 _CO2'de en az 1 saat boyunca önkoşul haline sokun. Gaz değişimine izin vermek için kapağı hafifçe açık bırakın.
   2. Hamile dişiyi servikal çıkık ile kurban edin, dişinin karnını% 70 etanol ile temizleyin ve cildi ve karın duvarını makasla kesin. Uterusun bir ucunun yerini bulun ve yumurtalık ile rahim arasındaki kavşakta kesin. Daha sonra, uterus boyunca diğer uca kadar kesin ve oda sıcaklığı Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) ile dolu 100 mm Petri kabına aktarın.
      NOT: Hormon astarlı olmayan, doğal olarak çiftleştirilmiş kadınların kullanılması önerilir.
   3. Kavramları DPBS'de hızlı bir şekilde yıkayın ve embriyo kullanımını kolaylaştırmak için çiftler halinde kesin. Tüm kavramsal çiftleri 60 mm Petri kabında önceden belirlenmiş diseksiyon ortamına taşıyın ve bireysel kavramlar halinde kesin.
   4. Bir çift brüt kümes gücü kullanarak uterus dokusunu yırtarak kavramüslerin rahim duvarını çıkarın. Armut şeklindeki yaprak dökenin ucunu kesmek için ince mikrocerrahi tokmaklar kullanın. Uzun eksenine paralel olarak embriyonun yanına tokaları yerleştirin ve yaprak dökenleri yarıya bölmek için tokaları açın.
   5. Son olarak, embriyoyu yaprak dökenden kavrayarak ve ince tokalar kullanarak parietal yumurta sarısı kesesini embriyodan soyarak yumurta silindirine bağlı sağlam ektoplacental koniyi bırakın.
      NOT: Embriyoyu etkilememek için, maksimum 30-40 dakika içinde 37 °C'de bir ısıtma plakası ile donatılmış bir mikroskopta diseksiyonlar gerçekleştirin. Bir seferde bir çöp embriyo dozhele.
   6. Diseksiyondan hemen sonra, embriyoların doku kalıntılarına yapışmasını önlemek için bir cam Pasteur pipet kullanarak embriyoları eşkenel diseksiyon ortamı ile dolu yeni bir plakaya aktarın.
   7. Epiblastta hasar göstermeyen sinir plakası/erken kafa katlama aşamasındaki embriyoları seçin ve şişe başına 5-6 embriyoyu önkoşulu cam kültür şişelerine aktarın.
      NOT: Cam Pasteur pipeti hazırlamak için pipet açıklığı bir cam kesici kullanarak embriyolara uyacak kadar yeterli bir boyuta kesin ve kirlenmeyi önlemek için etanolde tutun. Embriyoları aktarmadan önce cam pipeti PBS ile yıkayın. Embriyoları kültür şişesine aktarırken, EUCM'nin seyreltilmesini önlemek için diseksiyon ortamının mümkün olduğunca az hacmini taşıdığından emin olun.
   8. Şişeleri 37 °C'de dönen kültür sistemine% 5 O2 ve% 5 _CO2 atmosferine yerleştirin_.
   9. Kültürün her günü, embriyo gelişimini stereomikroskop altında değerlendirmek için şişeleri inkübatörden tek tek çıkarın. Bir şişeyi çıkarırken tamburdaki boş deliği katı bir bung ile kapattığınızdan emin olun. Embriyo boyutuna uyacak şekilde steril bir plastik Pasteur pipet ucunu kesin ve gözlemi kolaylaştırmak için embriyoları bir Petri kabına taşıyın. Embriyoların her zaman orta ile kaplı olduğundan emin olun.
      NOT: Vücut ısısındaki düşüş nedeniyle embriyolarda zararlı etkilerden kaçınmak için embriyoların inkübatör dışında olduğu süreyi en aza indirin. Embriyo sağkalımını etkileyen yumurta sarısı kesesi kan damarlarının yırtılmasını önlemek için embriyoları dikkatlice ele alın.
   10. Kültür 1. gününde (E8.5'e eşdeğer), 3 embriyodan oluşan grupları, ekstra 3 mg/mL D-glikoz ve %13 _O2, %5 _CO2 gaz karışımı içeren 2 mL taze ve önkoşullu EUCM içeren yeni bir şişeye aktarın.
   11. 48 saat sonra (E9.5'e eşdeğer), iki embriyodan oluşan grupları taze önceden ısıtılmış EUCM artı% 18 O2 ve% 5 _CO2 gaz atmosferinde 3.5 mg / mL glikoz ile yeni bir şişeye aktarın_.
   12. 72 saatlik kültürde (E10.5'e eşdeğer), her embriyonun 4 mg/ mL glikoz ve% 21 O2 ve% _{5 CO2} gaz kaynağı ile desteklenmiş 1.5-2 mL taze ortam içeren ayrı bir şişeye taşıyın.
       NOT: Embriyolar, 4.
   13. Yumurta sarısı kesesini ve amnionunu çıkarmak için ince forseps kullanın ve embriyo morfolojisinin uygun şekilde gözlemlenmesi için göbek kordonunu ayırın. Gaz düzenleme modülunu ve hassas inkübatörü kapatın.
       NOT: Embriyo aşamasına göre yeterli gaz atmosferine sahip silindir kültüründe bir cam şişenin içinde kuluçka yaparak kültür ortamını 1 saat önceden kesinleştirin. Kültür şişelerini ve tüm inkübatör cam eşyaları her kullanımdan sonra akan damıtılmış su ile üç yıkama ve ardından% 70 etanol içine batırılmış bir gece yıkama yaparak temizleyin. Damıtılmış su ile üç kez yeniden yıkayın, şişelerin bir gecede kurumasına izin verin ve otoklavla sterilize edin. Aynı şekilde, silikon fişleri düzenli olarak otoklavleyin. Tüm diseksiyon aletlerini% 70 etanol ile iyice temizleyin ve kuru sterilize edin.

4. Genişletilmiş embriyo kültürü E5.5/E6.5'ten E11'e

1. Statik plakalarda erken somit evresine (E8.5) kadar kültür pregastrülasyonu (E5.5) ve erken gastrülasyon (E6.5) embriyoları.
2. Diseksiyon ortamını 37 °C'de %5 _CO2'ye sahip bir inkübatörde 1 saat boyunca önkoşul haline sokun.
   NOT: Gaz değişimine izin vermek için tüpün kapağını tamamen kapatmayın.
3. Her kuyuya 250 μL taze hazırlanmış EUCM ekleyerek kültür plakalarını hazırlayın. Plakaları önkoşasyon için 37 °C'de bir _CO2 inkübatörünün içine yerleştirin.
   NOT: Embriyo büyümesi için 8 kuyu plakası çok uygun olsa da, plakanın büyüklüğüne göre ortamın hacmi ayarlanarak başka bir tabakta kültür yapılabilir.
4. Yumurta silindir embriyolarını E7.5 için açıklanan tekniği izleyerek rahim dışına serkt. Embriyonun parietal yumurta sarısı kesesini çıkarın ve sağlam ektoplacental koniyi yumurta silindirine bağlı bırakın.
5. Bir mikropipette kullanarak 8 kuyulu plakanın her kuyusuna ayrı embriyoları aktarın ve plakayı 37 °C'de% 5 _CO2 ile inkübatörün içine yerleştirin.
6. Embriyoları stereomikroskop altında görüntüleyin ve kültür için sadece iyi biçimlendirilmiş amniyotik boşluğa sahip olanları, belirgin bir hasar olmadan ve Reichert'in zarı olmadan seçin.
   NOT: E5.5 embriyolarını transfer etmek için 20 μL pipet ucu ve E6.5 embriyoları transfer etmek için 200 μL uç kullanın. E6.5'ten başlayan kültürler söz konusu olduğunda, HCS yeni toplanan HBS ile değiştirilebilir.
7. Ortamın yarısını çıkarın ve 24 saat kültürden sonra 250 μL taze hazırlanmış önceden hazırlanmış EUCM ekleyin, embriyoların her zaman kültür ortamına daldırılmasını sağlayın. E5.5'ten başlayan kültürler söz konusu olduğunda, iki günlük kültürden sonra (E7.5'e eşdeğer), 200 μL'yi çıkarın ve 250 μL yeni EUCM ekleyin.
   NOT: Statik kültür sırasında embriyolar plakaya (esas olarak plastik plakalar kullanırken) bağlanabilir ve bu da embriyo gelişimini ciddi şekilde tehlikeye atacaktır. Embriyonun plakaya bağlanması, E5.5 embriyolarının kültlemesinin ilk gününde daha sık görülür. Bağlanmayı önlemek için, ince, steril tokmaklar kullanarak embriyoları plaka yüzeyinden dikkatlice uzaklaştırın. Plakanın yüzeyine sadece ektoplacental koninin bağlı kaldığını doğrulayın.
8. Embriyoları erken somit aşamasında silindir kültürüne aktarın (4-7 somit; E5.5'te ekilen embriyolar için üç günlük kültürden sonra ve kültürler için iki gün E6.5'te başladı), daha önce E8.5 evre embriyolar için açıklanan endikasyonları takip edin.
   NOT: Embriyoların yukarıda belirtilenden farklı somite aşamalarında silindir kültürüne aktarılması, daha fazla gelişmenin başarısız olmasına neden olur. E7.5 ex utero kültürlerinin aksine, embriyoları% 21 oksijen ve% 5 _CO2 sabit bir atmosferde tutmak mümkündür, bu da dinamik oksijen konsantrasyonuna sahip atmosferlere göre embriyo gelişiminde biraz daha yüksek bir verimlilik sağlar.

Sonuçlar

E7.5 embriyoları için tanımlanan silindir kültürü koşulları (geç gastrülasyon evresi) 4 kültür gününden sonra ortalama %75'e yakın verimle sabit ve normal embriyo büyümesini destekler (Şekil 2 ve Tablo 1). Embriyo gelişiminin verimliliği çeşitli fare genetik geçmişlerine göre değişebilir, ancak sürekli olarak sağlamdır (Şekil 2C). HCS yerine HBS ile takviye, farelerin genetik arka planına bağlı olarak 4 günlük...

Tartışmalar

Burada sunulan kültür protokolü, E5.5'ten E11'e kadar altı güne kadar uygun ve sürekli fare embriyosu geliştirme ex uterosunu sürdürebilir. Daha önce, bu gelişim aşamalarında embriyolar kültürde sadece kısa süreler için (48 saate kadar) normal olarak gelişebilirdi ¹⁵. Gaz regülasyon modülünün oksijen konsantrasyonunun ve hiperbarik gaz basıncının hassas kontrolü için silindir kültürü inkübatörüne kaplanması, burada açıklanan uygun fare embriyo kültür...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore size filter (250 mL)	JetBiofil	FCA-206-250
0.22 µm pore size syringe PVDF filter	Millipore	SLGV033RS
8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat	iBidi	80827/80826
Bottle with adaptor cap for gas inlet	Arad Technologies
Bungs (Hole)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 06	Used to seal the bottles to the drum
Bungs (Solid)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 07	Used to seal the rotating drum
Culture bottles	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 03/BTC 04	Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04
D(+)-glucose Monohydrate	J.T. Baker
Diamond knife	Fine Science Tools	10100-30/45
Digital Pressure Gauge	Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd	BX-DPG80
DMEM	GIBCO	11880
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Biological industries	02-020-1A
Fetal Bovine Serum	Biological industries	04-013-1A
Gas regulation module	Arad Technologies	HannaLab1
Glutamax	GIBCO	35050061	glutamine
Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
HEPES	GIBCO	15630056
Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)	Fine Science Tools	11255-20
Pasteur pipettes (glass)	Hilgenberg	3150102
Pasteur pipettes (plastic)	Alexred	SO P12201
Penicillin/Streptomycin	Biological industries	03-031-1B
Petri Dishes (60 mm and 100 mm)	Falcon	351007/351029
Precision incubator system	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC01	BTC01 model with gas bubbler kit
Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)	Greiner Bio-One	#456005
Rat whole embryo culture serum	ENVIGO Bioproducts	B-4520
Stereoscopic microscope equipped with heating plate	Nikon	SMZ18
Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration	Pic Solution
Surgical scissors	Fine Science Tools	14094-11