Ex Utero Cultura de Embriões de Camundongos de Pregastrulation a Organogênese Avançada

Resumo

Uma plataforma aprimorada para a cultura de embriões integrais permite o desenvolvimento contínuo e robusto do ex útero de embriões de camundongos pós-implantação por até seis dias, desde estágios de pré-estresculação até organogênese avançada. Neste protocolo, detalhamos o procedimento padrão para a cultura de embriões bem sucedida usando placas estáticas e sistemas de garrafas rotativas.

Resumo

Métodos de cultura de embriões de mamíferos pós-postistas têm sido geralmente ineficientes e limitados a breves períodos após a dissecção fora do útero. Plataformas foram recentemente desenvolvidas para uma cultura ex utero altamente robusta e prolongada de embriões de camundongos desde estágios de cilindro de ovo até organogênese avançada. Essas plataformas permitem o desenvolvimento adequado e fiel de embriões pré-struladores (E5.5) até o estágio de formação de membros traseiros (E11). Embriões gastrulating tardios (E7.5) são cultivados em garrafas rotativas nessas configurações, enquanto a cultura estendida dos estágios de pré-estresculação (E5.5 ou E6.5) requer uma combinação de culturas estáticas e rotativas de garrafas. Além disso, regulação sensível da concentração de _O2 e _CO2 , pressão do gás, níveis de glicose e o uso de um meio específico de cultura ex utero são fundamentais para o desenvolvimento adequado de embriões. Aqui, é fornecido um protocolo passo-a-passo detalhado para a cultura estendida do embrião de camundongos ex-útero . A capacidade de cultivar embriões normais de camundongos ex utero de gastrulação à organogênese representa uma ferramenta valiosa para caracterizar o efeito de diferentes perturbações experimentais durante o desenvolvimento embrionário.

Introdução

O desenvolvimento intrauterino do embrião mamífero limitou o estudo dos estágios iniciais do desenvolvimento ^{pós-implantação1,2}. A inacessibilidade do embrião em desenvolvimento dificulta a compreensão dos principais processos de desenvolvimento que ocorrem após os implantes de embriões no útero, como o estabelecimento do plano corporal animal, especificação das camadas germinativas ou a formação de tecidos e órgãos. Além disso, o tamanho muito pequeno do embrião postimplantado precoce dificulta a observação por imagem intravital no útero antes do E103. A incapacidade de observar e manipular embriões vivos nessas fases restringiu o estudo da embriogênese pós-implantação precoce a instantâneos durante o desenvolvimento.

Protocolos para cultura in vitro de embriões mamíferos pré-implantação são bem estabelecidos, confiáveis e regularmente utilizados4. No entanto, as tentativas de estabelecer sistemas de cultura ex-uteria capazes de suportar o crescimento adequado do embrião de postulação de mamíferos tiveram sucesso ^limitado5. Uma variedade de técnicas culturais têm sido propostas por mais de um século, principalmente por cultivar os embriões em placas estáticas convencionais6,7,8 ou garrafas rotativas (culturas de rolo)^5,9,10. Essas plataformas se mostraram úteis na expansão do conhecimento sobre o desenvolvimento de mamíferos após a ^{implantação11,12}, apesar de serem altamente ineficientes para a sobrevivência normal de embriões e limitadas a períodos curtos. Os embriões começaram a apresentar retardamento do desenvolvimento e anomalias morfológicas logo 24-48 h após a iniciação cultural.

Este estudo fornece uma descrição detalhada para a criação do sistema de cultura de embriões ex utero que permite o desenvolvimento contínuo da pregastrulação aos estágios avançados de organogênese ao longo de até seis dias de desenvolvimento pós-implantação13. Este artigo descreve o protocolo de cultura de rolo aprimorado que suporta o crescimento de embriões E7.5 (placa neural e estágio de dobra de cabeça) até o estágio de formação de membros traseiros (~E11) e a cultura estendida de E5.5/E6.5, combinando cultura em placas estáticas e plataformas de cultura de rolo.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as Diretrizes de Proteção Animal do Instituto Weizmann de Ciência e aprovados pelo relevante Instituto Weizmann IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Mulheres grávidas saudáveis foram solicitadas a dar seu consentimento informado para coletar sangue de seu cordão umbilical, conforme aprovado pelo Comitê de Helsinque do Centro Médico de Rambam (#RMB-0452-15). Foram solicitados aos adultos saudáveis seu consentimento informado para ter sangue coletado de acordo com as diretrizes do Comitê de Helsinque do Instituto Weizmann de Ciência (#1566-3).

1. Preparação da mídia

1. Prepare o meio de dissecção utilizando 500 mL do Meio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco sem fenol vermelho e L-glutamina, suplementado com soro bovino fetal de 10%, 5 mL de penicilina/estreptomicina e esterilizador de filtros usando um filtro de 0,22 μm.
   NOTA: Mantenha o meio de dissecção em 4 °C por até 1 mês.
2. Prepare o meio de cultura de ex-embrião utero (EUCM) recentemente todos os dias de cultura dentro de uma encapuzada biológica usando 25% de meio embrionário mais 50% de soro de rato e 25% soro sanguíneo do cordão umbilical humano (HCS) ou soro sanguíneo adulto humano (HBS).
3. Para preparar o meio embrionário, adicione 5 mL de glutamina, 5 mL de HEPES e 5 mL de penicilina/estreptomicina em 500 mL de DMEM sem vermelho fenol e L-glutamina. Prepare alíquotas de 10-15 mL e armazene-as a 4 °C por até dois meses.
   NOTA: Dobre a concentração de antibióticos se sofrer alguma contaminação.
4. Inativar o soro de rato a 56 °C por 30-45 min e filtrar através de um filtro de difluoreto de polivinida de 0,22 μm. Use o soro para cultura no mesmo dia da inativação. Descongele HCS ou HBS e use-o imediatamente para experimentos.
   NOTA: O soro de rato comercial fornece resultados consistentes (um mínimo de 4 lotes foram testados sem variação evidente). Alternativamente, o soro de ratos de alta qualidade pode ser obtido internamente, conforme descrito ^{anteriormente8,14}. Se o HCS não estiver disponível, substitua-o por HBS coletados internamente. O soro de rato, o HCS e o HBS podem ser refrozen uma vez e mantidos a -20 °C para uso em um dia diferente. Descongele e combine o soro refrozen com um volume maior de soro recém-descongelado e não recongele novamente.

2. Coleta de soro sanguíneo do cordão umbilical humano e soro sanguíneo adulto humano

1. Para isolar o HCS, coletar sangue do cordão umbilical de gestantes saudáveis no dia do parto cesárário agendado.
   1. Fixar duas vezes o cordão umbilical de 5-7 cm do umbigo e transecte entre os grampos imediatamente após o parto do bebê.
   2. Retire manualmente sangue usando uma agulha de 14 G e uma seringa de 50 mL diretamente da veia umbilical enquanto a placenta permanece in situ para evitar quaisquer traços de hemólise.
      NOTA: Coletar sangue depois que o bebê for removido do campo da cirurgia, e o sangue umbilical foi extraído para exames clínicos.
2. Distribua o sangue coletado para tubos de ensaio estéreis procoagulantes de 5 mL e transfira-os imediatamente para 4 °C por 15 minutos para permitir a coagulação completa. Centrifugar os tubos de ensaio coagulados a 2.500 × g por 10 min a 4 °C.
3. Descartar tubos que mostram sinais de hemólise (soro rosa-vermelho). Colete o soro (cor amarela) usando uma pipeta de 5 mL e filtre-o através de um filtro de 0,22 μm. Inativar o soro imediatamente em um banho de água de 56 °C por 45 min.
4. Prepare 1-1,5 mL de alíquotas do soro inativado e armazene-os a -80 °C por até seis meses. Se necessário, envie a -70 °C usando gelo seco.
5. Para coleta de soro de sangue humano adulto, retire sangue de adultos saudáveis e isole imediatamente o soro seguindo o mesmo protocolo descrito para soro sanguíneo do cordão umbilical. Armazene o HBS como alíquotas inativadas e filtradas a -80 °C por até seis meses.
   NOTA: O soro do cordão umbilical humano e o soro humano adulto preparados recentemente internamente deram resultados superiores ao soro comercialmente disponível. Recolhimento de SM de mulheres saudáveis, maiores de 18 anos e menores de 40 anos agendado para parto por cesariana. Exclua mulheres que deram parto vaginal e mulheres com qualquer doença crônica ou condições médicas ativas, incluindo diabetes gestacional ou hipertensão.

3. Ex utero roller cultura de embriões de E7.5 a E11

1. Criação da incubadora de cultura de rolos e regulador de gás
   1. Cultura E7.5 ou embriões mais avançados usando o sistema de incubadora de cultura de rolo. Ligue o rotador e a unidade de aquecimento a 37 °C por pelo menos 1 h antes das dissecções do embrião. Adicione água autoclavada ao frasco de entrada de gás e ao tubo de ensaio de saída.
      NOTA: Coloque um termômetro adjacente ao tambor rotativo e verifique frequentemente a estabilidade da temperatura dentro da incubadora. Abrir a incubadora o mais rápido possível, pois o tempo de abertura prolongado aumentará a temperatura e afetará o desenvolvimento de embriões. Quando necessário, adicione mais água autoclavada ao frasco de entrada de gás e ao tubo de ensaio de saída para mantê-los com um mínimo de metade da capacidade durante a cultura. Proteja os embriões dentro da incubadora da luz cobrindo a incubadora com um pano.
   2. Ligue o módulo regulador de gás pressionando o interruptor principal e, posteriormente, ligando os controladores oxigênio/nitrogênio e _CO2 (Figura 1A). Defina os valores de oxigênio e _CO2 para 5% utilizando os respectivos controladores. Abra o regulador de gás e coloque a pressão do gás em ~6,5-7 libras por polegada quadrada (psi) movendo o interruptor de tensão no transmissor de pressão (Figura 1B). Confirme o valor da pressão do gás usando um medidor de pressão digital.
   3. Monitore o fluxo de gás verificando a taxa de bolhas criadas dentro do tubo de ensaio cheio de água de saída alocado dentro da incubadora de precisão. Ajuste a taxa de bolha adequada fechando/abrindo a válvula de fluxo de gás na tampa da garrafa de água. Certifique-se de que o fluxo de gás permite a formação de bolhas a uma taxa de 2-4 bolhas por segundo ou definir o fluxo de bolhas no primeiro ponto onde borbulhar sai para o tubo de saída cheio de água.
   4. Encha as garrafas de cultura com 2 mL de meio de cultura e conecte-as ao tambor giratório oco para pré-acolibração por 1h. Use os bungs de silício oco para selar as garrafas ao tambor. Mantenha selados os espaços vazios no tambor rotativo usando os bungs sólidos.
      NOTA: A ausência de bolhas no tubo de saída (sem gás que venha através do sistema) ou um fluxo de gás excepcionalmente alto pode afetar o desenvolvimento de embriões. No caso de falta de fluxo de bolhas para o tubo de ensaio de saída, verifique se todos os bungs de silício estão devidamente posicionados no tambor rotativo e selando o sistema, e verifique se a garrafa de água está fechada corretamente e toda a tubulação está conectada corretamente. A falta de borbulha surgindo no frasco de água pode indicar um mau funcionamento no regulador de gás.
2. Dissecção de embriões de camundongos de camundongos grávidas
   1. Pré-acolibrar o meio de dissecção dentro de uma incubadora a 37 °C e 5% de _CO2 para um mínimo de 1h. Deixe a tampa ligeiramente aberta para permitir a troca de gás.
   2. Sacrifique a fêmea grávida por luxação cervical, limpe o abdômen da fêmea com 70% de etanol, e corte a pele e a parede abdominal com uma tesoura. Localize uma extremidade do útero e corte na intersecção entre o ovário e o útero. Em seguida, corte ao longo do útero até a outra extremidade e transfira-o para uma placa de Petri de 100 mm cheia de soro fisco tamponado de dulbecco (DPBS).
      NOTA: Recomenda-se o uso de fêmeas não-hormonais e naturalmente acasaladas.
   3. Lave rapidamente os conceitos em DPBS e corte em pares para facilitar o manuseio de embriões. Mova todos os pares de conceitos para o meio de dissecção pré-aquilibrado em uma placa de Petri de 60 mm e corte em conceitos individuais.
   4. Remova a parede uterina dos conceitos rasgando o tecido uterino usando um par de fórceps brutos. Use fórceps microcirúrgicos finos para cortar a ponta da decidua em forma de pera. Insira as fórceps ao lado do embrião paralela ao seu longo eixo, e abra os fórceps para dividir o decidua em metades.
   5. Finalmente, deixe o cone ectoplacental intacto preso ao cilindro de ovo, agarrando o embrião da decidua e descascando o saco de gema parietal do embrião usando fórceps finos.
      NOTA: Para evitar afetar o embrião, realize dissecções em um microscópio equipado com uma placa de aquecimento a 37 °C dentro de um máximo de 30-40 min. Disseca uma ninhada de embriões de cada vez.
   6. Imediatamente após a dissecação, transfira os embriões para uma nova placa cheia de meio de dissecção equilibrada usando uma pipeta pasteur de vidro para evitar que os embriões grudem nos detritos teciduais.
   7. Selecione os embriões na placa neural/estágio de dobra da cabeça inicial não mostrando nenhum dano no epiblasto e transfira 5-6 embriões por garrafa para as garrafas de cultura de vidro pré-aquilibradas.
      NOTA: Para preparar a pipeta pasteur de vidro, corte a abertura da pipeta em um tamanho adequado para caber os embriões usando um cortador de vidro, e mantenha-a no etanol para evitar contaminação. Lave a pipeta de vidro com PBS antes de transferir embriões. Ao transferir os embriões para a garrafa de cultura, certifique-se de carregar o menor volume possível do meio de dissecção para evitar a diluição do EUCM.
   8. Coloque as garrafas no sistema de cultura rotativa a 37 °C, em uma atmosfera de 5% de _O2 e 5% de _CO2.
   9. A cada dia de cultura, remova as garrafas uma a uma da incubadora para avaliar o desenvolvimento de embriões sob um estereóscópio. Certifique-se de fechar o orifício vazio no tambor com um bung sólido ao remover uma garrafa. Corte a ponta de uma pipeta pasteur de plástico estéril para caber o tamanho do embrião e mova os embriões para uma placa de Petri para facilitar a observação. Certifique-se de que os embriões estão sempre cobertos por meio.
      NOTA: Minimizar o tempo para o qual os embriões estão fora da incubadora para evitar efeitos prejudiciais nos embriões devido à diminuição da temperatura corporal. Manuseie os embriões cuidadosamente para evitar a ruptura dos vasos sanguíneos do saco de gema, afetando a sobrevivência do embrião.
   10. No dia 1 da cultura (equivalente ao E8.5), transfira grupos de 3 embriões para uma nova garrafa com 2 mL de EUCM fresco e pré-acolibrado contendo 3 mg/mL extra de D-glicose e uma mistura de gás de 13% _O2, 5% de _CO2.
   11. Após 48 h (equivalente a E9,5), transfira grupos de dois embriões para uma nova garrafa com EUCM pré-aquecido fresco mais 3,5 mg/mL de glicose em uma atmosfera de gás de 18% _O2 e 5% de _CO2.
   12. A 72h de cultura (equivalente a E10,5), mova cada embrião para um frasco individual contendo 1,5-2 mL de meio fresco suplementado com 4 mg/mL de glicose e um fornecimento de gás de 21% _O2 e 5% de _CO2.
       NOTA: Os embriões atingem seu crescimento máximo por volta da meia-noite do dia 4 da cultura.
   13. Use fórceps finos para remover o saco de gema e amnion, e desprender o cordão umbilical para observação adequada da morfologia do embrião. Desligue o módulo de regulação do gás e a incubadora de precisão.
       NOTA: Pré-acolibrar o meio de cultura por 1 hora por incubação dentro de uma garrafa de vidro na cultura do rolo com uma atmosfera de gás adequada de acordo com o estágio do embrião. Limpe as garrafas de cultura e todos os vidros da incubadora após cada uso, realizando três lavagens com água destilada em funcionamento seguida de uma lavagem durante a noite submersa em 70% de etanol. Relave três vezes com água destilada em funcionamento, deixe as garrafas secarem durante a noite e esterilize por autoclave. Da mesma forma, autoclave os plugues de silício regularmente. Limpe minuciosamente todas as ferramentas de dissecção com 70% de etanol e esterilize-as a seco.

4. Cultura estendida de embriões de E5.5/E6.5 para E11

1. A pré-corda cultural (E5.5) e os embriões gastruladores precoces (E6.5) até o estágio de somite precoce (E8.5) em placas estáticas.
2. Pré-acolibrar o meio de dissecção por 1h em uma incubadora com 5% de _CO2 a 37 °C.
   NOTA: Para permitir a troca de gás, não feche completamente a tampa do tubo.
3. Prepare as placas de cultura adicionando 250 μL de EUCM recém-preparado a cada poço. Coloque as placas dentro de uma incubadora de _CO2 a 37 °C para pré-sequilibração.
   NOTA: Embora as placas de 8 poços sejam adequadas para o crescimento de embriões, a cultura pode ser feita em qualquer outra placa, ajustando o volume do meio de acordo com o tamanho da placa.
4. Dissecar embriões de cilindro de ovo fora do útero seguindo a técnica descrita para E7.5. Remova o saco de gema parietal do embrião e deixe o cone ectoplacental intacto preso ao cilindro de ovo.
5. Transfira embriões individuais para cada poço da placa de 8 poços usando uma micropipette e coloque a placa dentro da incubadora com 5% de _CO2 a 37 °C.
6. Imagem os embriões sob um estereómico e selecione para a cultura apenas aqueles com uma cavidade amniótica bem formada, sem danos evidentes e sem a membrana do Reichert.
   NOTA: Use 20 dicas de pipeta μL para transferir embriões E5.5 e 200 dicas de μL para transferir embriões E6.5. No caso de culturas a partir de E6.5, o HCS pode ser substituído por HBS recém-coletado.
7. Remova metade do meio e adicione 250 μL de EUCM pré-armado recém-preparado após 24 horas de cultura, garantindo que os embriões estejam sempre imersos no meio da cultura. No caso das culturas a partir de E5.5, após dois dias de cultura (equivalente a E7,5), remova 200 μL e adicione 250 μL do novo EUCM.
   NOTA: Durante a cultura estática, os embriões podem se prender à placa (principalmente quando se usam placas plásticas), o que comprometerá severamente o desenvolvimento de embriões. A fixação do embrião à placa é mais frequente no primeiro dia de cultivo de embriões E5.5. Para evitar a fixação, afaste cuidadosamente os embriões da superfície da placa usando fórceps finos e estéreis. Verifique se apenas o cone ectoplacental permanece preso à superfície da placa.
8. Transfira os embriões para a cultura do rolo no estágio somite inicial (4-7 somites; após três dias de cultura para embriões explanados em E5.5 e dois dias para culturas iniciadas em E6.5), seguindo as mesmas indicações descritas anteriormente para embriões estágio E8.5.
   NOTA: Transferir os embriões para a cultura do rolo em estágios de somite diferentes do indicado acima resulta em falha de desenvolvimento posterior. Em contraste com as culturas ex uteroS E7.5, é possível manter os embriões em uma atmosfera constante de 21% de oxigênio e 5% de _CO2, proporcionando uma eficiência ligeiramente maior do desenvolvimento de embriões do que atmosferas com concentração dinâmica de oxigênio.

Resultados

As condições de cultura do rolo descritas para embriões E7.5 (estágio de gastrulação tardia) suportam o crescimento constante e normal do embrião com uma eficiência média próxima de 75% após 4 dias de cultura (Figura 2 e Tabela 1). A eficiência do desenvolvimento de embriões pode variar entre diversos antecedentes genéticos de camundongos, mas é consistentemente robusta (Figura 2C). A suplementação com HBS em vez de HCS produz u...

Discussão

O protocolo cultural aqui apresentado pode sustentar o desenvolvimento adequado e contínuo do embrião do camundongo ex utero por até seis dias, de E5.5 a E11. Anteriormente, os embriões nessas etapas de desenvolvimento podiam desenvolver-se normalmente na cultura apenas por curtos períodos (até 48 h)¹⁵. O acoplamento do módulo de regulação do gás à incubadora de cultura de rolo para controle preciso da concentração de oxigênio e pressão do gás hiperbárico é fundamental p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore size filter (250 mL)	JetBiofil	FCA-206-250
0.22 µm pore size syringe PVDF filter	Millipore	SLGV033RS
8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat	iBidi	80827/80826
Bottle with adaptor cap for gas inlet	Arad Technologies
Bungs (Hole)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 06	Used to seal the bottles to the drum
Bungs (Solid)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 07	Used to seal the rotating drum
Culture bottles	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 03/BTC 04	Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04
D(+)-glucose Monohydrate	J.T. Baker
Diamond knife	Fine Science Tools	10100-30/45
Digital Pressure Gauge	Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd	BX-DPG80
DMEM	GIBCO	11880
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Biological industries	02-020-1A
Fetal Bovine Serum	Biological industries	04-013-1A
Gas regulation module	Arad Technologies	HannaLab1
Glutamax	GIBCO	35050061	glutamine
Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
HEPES	GIBCO	15630056
Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)	Fine Science Tools	11255-20
Pasteur pipettes (glass)	Hilgenberg	3150102
Pasteur pipettes (plastic)	Alexred	SO P12201
Penicillin/Streptomycin	Biological industries	03-031-1B
Petri Dishes (60 mm and 100 mm)	Falcon	351007/351029
Precision incubator system	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC01	BTC01 model with gas bubbler kit
Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)	Greiner Bio-One	#456005
Rat whole embryo culture serum	ENVIGO Bioproducts	B-4520
Stereoscopic microscope equipped with heating plate	Nikon	SMZ18
Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration	Pic Solution
Surgical scissors	Fine Science Tools	14094-11