Ex Utero Coltura di embrioni di topo dalla pregastrulazione all'organogenesi avanzata

Riepilogo

Una piattaforma potenziata per la coltura di embrioni interi consente uno sviluppo continuo e robusto in ex utero di embrioni di topo post-impianto per un massimo di sei giorni, dalle fasi di pre-costruzione fino all'organogenesi avanzata. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio la procedura standard per la coltura embrionale di successo utilizzando piastre statiche e sistemi di bottiglie rotanti.

Abstract

I metodi di coltura embrionale dei mammiferi post-impianto sono stati generalmente inefficienti e limitati a brevi periodi dopo la dissezione dall'utero. Recentemente sono state sviluppate piattaforme per colture ex utero altamente robuste e prolungate di embrioni di topo da stadi uovo-cilindro fino all'organogenesi avanzata. Queste piattaforme consentono uno sviluppo appropriato e fedele degli embrioni pregastrulanti (E5.5) fino allo stadio di formazione degli arti posteriori (E11). Gli embrioni a gastrulazione tardiva (E7.5) vengono coltivati in bottiglie rotanti in questi ambienti, mentre la coltura estesa dalle fasi di pre-costruzione (E5.5 o E6.5) richiede una combinazione di colture di bottiglie statiche e rotanti. Inoltre, la regolazione sensibile della concentrazione di _O2 e _CO2 , la pressione del gas, i livelli di glucosio e l'uso di uno specifico terreno di coltura ex utero sono fondamentali per il corretto sviluppo dell'embrione. Qui viene fornito un protocollo dettagliato passo-passo per la coltura estesa di embrioni di topo ex utero. La capacità di far crescere embrioni di topo normali ex utero dalla gastrulazione all'organogenesi rappresenta uno strumento prezioso per caratterizzare l'effetto di diverse perturbazioni sperimentali durante lo sviluppo embrionale.

Introduzione

Lo sviluppo intrauterino dell'embrione di mammifero ha limitato lo studio delle prime fasi dello sviluppo post-impianto1,2. L'inaccessibilità dell'embrione in via di sviluppo ostacola la comprensione dei principali processi di sviluppo che si verificano dopo l'impianto dell'embrione nell'utero, come la definizione del piano del corpo animale, la specifica degli strati germinali o la formazione di tessuti e organi. Inoltre, le dimensioni molto ridotte dell'embrione postimpinato precoce rendono difficile l'osservazione mediante imaging intravitale in utero prima di ^E103. L'incapacità di osservare e manipolare gli embrioni viventi in queste fasi ha limitato lo studio dell'embriogenesi post-impianto precoce a istantanee durante lo sviluppo.

I protocolli per la coltura in vitro di embrioni di mammiferi preimpianto sono ben consolidati, affidabili e utilizzati regolarmente4. Tuttavia, i tentativi di stabilire sistemi di coltura ex utero in grado di supportare una corretta crescita embrionale post-impianto di mammiferi hanno avuto un successo ^limitato5. Una varietà di tecniche di coltura sono state proposte per oltre un secolo, principalmente coltivando gli embrioni in piastre statiche convenzionali6,7,8 o bottiglie rotanti (colture a rulli)^5,9,10. Queste piattaforme si sono rivelate utili per ampliare le conoscenze sullo sviluppo dei mammiferi dopo l'impianto11,12, nonostante siano altamente inefficienti per la normale sopravvivenza degli embrioni e limitate a brevi periodi. Gli embrioni hanno iniziato a mostrare ritardo dello sviluppo e anomalie morfologiche già 24-48 ore dopo l'inizio della coltura.

Questo studio fornisce una descrizione dettagliata per la creazione del sistema di coltura embrionale ex utero che consente uno sviluppo continuo dalla fase pre-costruzione alle fasi avanzate di organogenesi fino a sei giorni di sviluppo post-impianto13. Questo documento descrive il protocollo di coltura a rulli migliorato che supporta la crescita degli embrioni E7.5 (piastra neurale e stadio headfold) fino allo stadio di formazione degli arti posteriori (~ E11) e la coltura estesa da E5.5 / E6.5 combinando la coltura su piastre statiche e piattaforme di coltura a rulli.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida per la protezione degli animali del Weizmann Institute of Science e approvati dal weizmann Institute IACUC (# 01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Alle donne incinte sane è stato chiesto di dare il loro consenso informato per raccogliere sangue dal loro cordone ombelicale, come approvato dal Rambam Medical Center Helsinki Committee (#RMB-0452-15). Agli adulti sani è stato chiesto il loro consenso informato per raccogliere il sangue secondo le linee guida del Comitato di Helsinki del Weizmann Institute of Science (# 1566-3).

1. Preparazione dei media

1. Preparare il mezzo di dissezione utilizzando 500 ml di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco senza rosso fenolo e L-glutammina, integrato con siero bovino fetale al 10%, 5 ml di penicillina / streptomicina e sterilizzare con filtro con un filtro da 0,22 μm.
   NOTA: Mantenere il mezzo di dissezione a 4 °C per un massimo di 1 mese.
2. Preparare il terreno di coltura embrionale ex utero (EUCM) ogni giorno di coltura all'interno di un cappuccio biologico utilizzando il 25% del mezzo embrionale più il 50% di siero di ratto e il 25% di siero del sangue del cordone ombelicale umano (HCS) o siero di sangue umano adulto (HBS).
3. Per preparare il mezzo embrionale, aggiungere 5 ml di glutammina, 5 ml di HEPES e 5 ml di penicillina / streptomicina in 500 ml di DMEM senza rosso fenolo e L-glutammina. Preparare aliquote da 10-15 ml e conservarle a 4 °C per un massimo di due mesi.
   NOTA: Raddoppiare la concentrazione di antibiotici in caso di contaminazione.
4. Inattivare termicamente il siero di ratto a 56 °C per 30-45 minuti e filtrare attraverso un filtro al polivinilidene difluoruro da 0,22 μm. Usa il siero per la cultura lo stesso giorno dell'inattivazione. Scongelare HCS o HBS e usarlo immediatamente per esperimenti.
   NOTA: Il siero di ratto commerciale fornisce risultati coerenti (un minimo di 4 lotti sono stati testati senza evidenti variazioni). In alternativa, il siero di ratto di alta qualità può essere ottenuto internamente come descritto in ^{precedenza8,14}. Se HCS non è disponibile, sostituirlo con HBS raccolto internamente. Il siero di ratto, HCS e HBS possono essere ricongelati una volta e mantenuti a -20 °C per l'uso in un giorno diverso. Scongelare e combinare il siero ricongelato con un volume maggiore di siero appena scongelato e non ricongelarlo.

2. Raccolta del siero del sangue del cordone ombelicale umano e del siero del sangue umano adulto

1. Per isolare l'HCS, raccogliere il sangue del cordone ombelicale da donne in gravidanza sane il giorno del parto cesareo programmato.
   1. Doppio morsetto del cordone ombelicale a 5-7 cm dall'ombelico e transetto tra i morsetti immediatamente dopo il parto del bambino.
   2. Prelevare manualmente il sangue utilizzando un ago da 14 G di grandi dimensioni e una siringa da 50 ml direttamente dalla vena ombelicale mentre la placenta rimane in situ per evitare qualsiasi traccia di emolisi.
      NOTA: Raccogliere il sangue dopo che il bambino è stato rimosso dal campo della chirurgia, e il sangue ombelicale è stato prelevato per i test clinici.
2. Erogare il sangue raccolto in provette sterili procoagulanti da 5 mL e trasferirle immediatamente a 4 °C per 15 minuti per consentire la completa coagulazione. Centrifugare le provette coagulate a 2.500 × g per 10 minuti a 4 °C.
3. Scartare i tubi che mostrano segni di emolisi (siero rosa-rosso). Raccogliere il siero (di colore giallo) utilizzando una pipetta da 5 ml e filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 μm. Inattivare il siero immediatamente a bagnomaria a 56 °C per 45 minuti.
4. Preparare aliquote da 1-1,5 ml del siero inattivato e conservarle a -80 °C per un massimo di sei mesi. Se necessario, spedire a -70 °C utilizzando ghiaccio secco.
5. Per la raccolta di siero di sangue umano adulto, prelevare il sangue da adulti sani e isolare immediatamente il siero seguendo lo stesso protocollo descritto per il siero del sangue del cordone ombelicale. Conservare l'HBS come aliquote inattivate dal calore e filtrate a -80 °C per un massimo di sei mesi.
   NOTA: Il siero del cordone ombelicale umano umano e il siero umano adulto preparato appena in-house hanno dato risultati superiori al siero disponibile in commercio. Raccogliere HCS da donne sane, di età superiore ai 18 anni e sotto i 40 anni previste per il parto cesareo. Escludere le donne che hanno partorito vaginalmente e le donne con qualsiasi malattia cronica o condizioni mediche attive, tra cui diabete gestazionale o ipertensione.

3. Coltura ex utero di embrioni da E7,5 a E11

1. Impostazione dell'incubatore di colture a rulli e del regolatore di gas
   1. Coltura E7.5 o più embrioni avanzati utilizzando il sistema di incubatore di colture a rulli. Accendere il rotatore e l'unità di riscaldamento a 37 °C per almeno 1 ora prima delle dissezioni embrionali. Aggiungere acqua autoclavata alla bombola di ingresso del gas e alla provetta di uscita.
      NOTA: Posizionare un termometro adiacente al tamburo rotante e controllare frequentemente la stabilità della temperatura all'interno dell'incubatore. Aprire l'incubatrice il più rapidamente possibile poiché il tempo di apertura prolungato aumenterà la temperatura e influenzerà lo sviluppo dell'embrione. Se necessario, aggiungere più acqua autoclavata alla bombola di ingresso del gas e alla provetta di uscita per mantenerli ad una capacità minima di metà durante la coltura. Proteggere gli embrioni all'interno dell'incubatrice dalla luce coprendo l'incubatrice con un panno.
   2. Accendere il modulo regolatore del gas premendo l'interruttore principale e successivamente accendendo i regolatori di ossigeno/azoto e _CO2 (Figura 1A). Impostare i valori di ossigeno e _CO2 al 5% utilizzando i rispettivi controller. Aprire il regolatore del gas e impostare la pressione del gas su ~ 6,5-7 libbre per pollice quadrato (psi) spostando l'interruttore di tensione nel trasmettitore di pressione (Figura 1B). Confermare il valore della pressione del gas utilizzando un manometro digitale.
   3. Monitorare il flusso di gas controllando la velocità delle bolle create all'interno della provetta riempita d'acqua in uscita allocata all'interno dell'incubatore di precisione. Impostare la corretta velocità di bolla chiudendo / aprendo la valvola di flusso del gas sul coperchio della bottiglia d'acqua. Assicurarsi che il flusso di gas consenta la formazione di bolle ad una velocità di 2-4 bolle al secondo o impostare il flusso di bolle nel primo punto in cui il gorgogliamento esce dal tubo di uscita pieno d'acqua.
   4. Riempire le bottiglie di coltura con 2 ml di terreno di coltura e inserirle nel tamburo rotante scavato per la preequilibrazione per 1 ora. Usa i bungs di silicio scavati per sigillare le bottiglie al tamburo. Tenere sigillati gli spazi vuoti nel tamburo rotante usando i bungs solidi.
      NOTA: L'assenza di bolle nel tubo di uscita (nessun gas che passa attraverso il sistema) o un flusso di gas eccezionalmente elevato possono influenzare lo sviluppo dell'embrione. In caso di mancanza di flusso di bolle alla provetta di uscita, controllare che tutti i bung di silicio siano posizionati correttamente nel tamburo rotante e sigillare il sistema, e controllare che la bottiglia d'acqua sia chiusa correttamente e che tutti i tubi siano collegati correttamente. Una mancanza di gorgogliamento che entra nella bottiglia d'acqua può indicare un malfunzionamento nel regolatore del gas.
2. Dissezione di embrioni di topo da topi gravidi
   1. Preequilibratare il mezzo di dissezione all'interno di un incubatore a 37 °C e 5% di _CO2 per un minimo di 1 ora. Lasciare il coperchio leggermente aperto per consentire lo scambio di gas.
   2. Sacrificare la femmina incinta per lussazione cervicale, pulire l'addome della femmina con il 70% di etanolo e tagliare la pelle e la parete addominale con le forbici. Individuare un'estremità dell'utero e tagliare all'intersezione tra l'ovaio e l'utero. Quindi, tagliare lungo l'utero fino all'altra estremità e trasferirlo in una capsula di Petri da 100 mm riempita con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco a temperatura ambiente (DPBS).
      NOTA: Si raccomanda l'uso di femmine non innescate da ormoni, accoppiate naturalmente.
   3. Lavare rapidamente i conceptuses in DPBS e tagliarli a coppie per facilitare la gestione degli embrioni. Sposta tutte le coppie di conceptuse in un mezzo di dissezione preequilibrato in una capsula di Petri da 60 mm e tagliale in singoli conceptuses.
   4. Rimuovere la parete uterina dei conceptuses strappando il tessuto uterino usando un paio di pinze grossolane. Utilizzare una pinza microchirurgica fine per tagliare la punta della decidua a forma di pera. Inserire la pinza accanto all'embrione parallelamente al suo asse lungo e aprire la pinza per dividere la decidua a metà.
   5. Infine, lasciare intatto il cono ectoplacentare attaccato al cilindro dell'uovo afferrando l'embrione dalla decidua e staccando il sacco vitellino parietale dall'embrione usando una pinza fine.
      NOTA: Per evitare di influenzare l'embrione, eseguire dissezioni su un microscopio dotato di piastra riscaldante a 37 °C entro un massimo di 30-40 min. Seziona una cucciolata di embrioni alla volta.
   6. Subito dopo la dissezione, trasferire gli embrioni su una nuova piastra riempita con un mezzo di dissezione equilibrato utilizzando una pipetta Pasteur di vetro per evitare che gli embrioni si attacchino ai detriti tissutali.
   7. Selezionare quegli embrioni nella piastra neurale / fase iniziale di piegatura della testa che non mostrano danni nell'epiblasto e trasferire 5-6 embrioni per bottiglia alle bottiglie di coltura di vetro preequilibrate.
      NOTA: Per preparare la pipetta Pasteur in vetro, tagliare l'apertura della pipetta a una dimensione adeguata per adattarsi agli embrioni usando un tagliavetro e tenerla in etanolo per evitare contaminazioni. Lavare la pipetta di vetro con PBS prima di trasferire gli embrioni. Quando si trasferiscono gli embrioni nella bottiglia di coltura, assicurarsi di trasportare il minor volume possibile del mezzo di dissezione per evitare di diluire l'EUCM.
   8. Posizionare le bottiglie nel sistema di coltura rotante a 37 °C, in un'atmosfera del 5% di _O2 e del 5% di _CO2.
   9. Ogni giorno di coltura, rimuovere i flaconi uno per uno dall'incubatrice per valutare lo sviluppo embrionale sotto uno stereomicroscopio. Assicurati di chiudere il foro vuoto nel tamburo con un bung solido quando rimuovi una bottiglia. Tagliare la punta di una pipetta Pasteur di plastica sterile per adattarla alle dimensioni dell'embrione e spostare gli embrioni in una capsula di Petri per facilitare l'osservazione. Assicurati che gli embrioni siano sempre coperti da un mezzo.
      NOTA: Ridurre al minimo il tempo per il quale gli embrioni sono al di fuori dell'incubatrice per evitare effetti dannosi negli embrioni a causa di una diminuzione della temperatura corporea. Maneggiare attentamente gli embrioni per evitare la rottura dei vasi sanguigni del sacco vitellino, influenzando la sopravvivenza dell'embrione.
   10. Al giorno di coltura 1 (equivalente a E8.5), trasferire gruppi di 3 embrioni in un nuovo flacone con 2 ml di EUCM fresco e preequilibrato contenente 3 mg/mL extra di D-glucosio e una miscela di gas del 13% di _O2, 5% di _CO2.
   11. Dopo 48 ore (equivalenti a E9,5), trasferire gruppi di due embrioni in un nuovo flacone con EUCM preriscaldato fresco più 3,5 mg/mL di glucosio in un'atmosfera gassosa del 18% di _O2 e del 5% di _CO2.
   12. A 72 ore di coltura (equivalenti a E10,5), spostare ogni embrione in un singolo flacone contenente 1,5-2 ml di terreno fresco integrato con 4 mg/mL di glucosio e un apporto di gas del 21% di _O2 e del 5% di _CO2.
       NOTA: Gli embrioni raggiungono la loro massima crescita verso la mezzanotte del giorno di coltura 4.
   13. Utilizzare una pinza fine per rimuovere il sacco vitellino e l'amnione e staccare il cordone ombelicale per una corretta osservazione della morfologia dell'embrione. Spegnere il modulo di regolazione del gas e l'incubatore di precisione.
       NOTA: Preequilibrare il terreno di coltura per 1 ora mediante incubazione all'interno di una bottiglia di vetro nella coltura a rulli con un'atmosfera di gas adeguata in base allo stadio embrionale. Pulire le bottiglie di coltura e tutti gli oggetti in vetro dell'incubatore dopo ogni utilizzo eseguendo tre lavaggi con acqua distillata corrente seguita da un lavaggio notturno immerso nel 70% di etanolo. Lavare tre volte con acqua distillata corrente, lasciare asciugare le bottiglie durante la notte e sterilizzare in autoclave. Allo stesso modo, autoclave i tappi di silicio regolarmente. Pulire accuratamente tutti gli strumenti di dissezione con etanolo al 70% e sterilizzarli a secco.

4. Coltura embrionale estesa da E5.5/E6.5 a E11

1. Embrioni di coltura pre-strulazione (E5.5) e gastrulazione precoce (E6.5) fino allo stadio di somite precoce (E8.5) in piastre statiche.
2. Preequilibrare il mezzo di dissezione per 1 ora in un incubatore con il 5% di _CO2 a 37 °C.
   NOTA: Per consentire lo scambio di gas, non chiudere completamente il coperchio del tubo.
3. Preparare le piastre di coltura aggiungendo 250 μL di EUCM appena preparato a ciascun pozzetto. Posizionare le piastre all'interno di un incubatore a _CO2 a 37 °C per la preequilibrazione.
   NOTA: Sebbene le piastre a 8 pozzetti siano adatte per la crescita dell'embrione, la coltura può essere eseguita in qualsiasi altra piastra regolando il volume del mezzo in base alle dimensioni della piastra.
4. Sezionare gli embrioni cilindrici dell'uovo fuori dall'utero seguendo la tecnica descritta per E7.5. Rimuovere il sacco vitellino parietale dell'embrione e lasciare intatto il cono ectoplacentare attaccato al cilindro dell'uovo.
5. Trasferire i singoli embrioni in ciascun pozzetto della piastra a 8 pozzetti utilizzando una micropipetta e posizionare la piastra all'interno dell'incubatrice con il 5% di _CO2 a 37 °C.
6. Immaginate gli embrioni sotto uno stereomicroscopio e selezionate per la coltura solo quelli con una cavità amniotica ben formata, senza danni evidenti e senza la membrana di Reichert.
   NOTA: utilizzare punte di pipetta da 20 μL per trasferire embrioni E5.5 e punte da 200 μL per trasferire embrioni E6.5. Nel caso di colture a partire da E6.5, l'HCS può essere sostituito da HBS appena raccolto.
7. Rimuovere metà del mezzo e aggiungere 250 μL di EUCM preriscaldato appena preparato dopo 24 ore di coltura, assicurando che gli embrioni siano sempre immersi nel terreno di coltura. Nel caso di colture a partire da E5.5, dopo due giorni di coltura (equivalente a E7.5), rimuovere 200 μL e aggiungere 250 μL di nuovo EUCM.
   NOTA: Durante la coltura statica, gli embrioni potrebbero attaccarsi alla piastra (principalmente quando si usano piastre di plastica), il che comprometterà gravemente lo sviluppo dell'embrione. L'attaccamento dell'embrione alla piastra è più frequente il primo giorno di coltura di embrioni E5.5. Per evitare l'attaccamento, spingere con attenzione gli embrioni lontano dalla superficie della piastra usando una pinza fine e sterile. Verificare che solo il cono ectoplacentare rimanga attaccato alla superficie della piastra.
8. Trasferire gli embrioni nella coltura a rulli allo stadio iniziale di somite (4-7 somiti; dopo tre giorni di coltura per gli embrioni espiantati a E5,5 e due giorni per le colture iniziate a E6,5), seguendo le stesse indicazioni descritte in precedenza per gli embrioni allo stadio E8,5.
   NOTA: Il trasferimento degli embrioni alla coltura a rulli in stadi somiti diversi da quelli sopra indicati comporta il fallimento di un ulteriore sviluppo. A differenza delle colture esogene E7.5, è possibile mantenere gli embrioni in un'atmosfera costante del 21% di ossigeno e del 5% di _CO2, fornendo un'efficienza leggermente superiore dello sviluppo embrionale rispetto alle atmosfere con concentrazione dinamica di ossigeno.

Risultati

Le condizioni di coltura a rulli descritte per gli embrioni E7.5 (fase di gastrulazione tardiva) supportano una crescita embrionale costante e normale con un'efficienza media vicina al 75% dopo 4 giorni di coltura (Figura 2 e Tabella 1). L'efficienza dello sviluppo embrionale può variare in base a diversi background genetici di topo, ma è costantemente robusta (Figura 2C). L'integrazione con HBS invece di HCS produce un'efficienza di ~ 68% dop...

Discussione

Il protocollo di coltura qui presentato può sostenere uno sviluppo corretto e continuo dell'embrione di topo ex utero per un massimo di sei giorni, da E5.5 a E11. In precedenza, gli embrioni in queste fasi di sviluppo potevano svilupparsi normalmente in coltura solo per brevi periodi (fino a 48 h)¹⁵. L'accoppiamento del modulo di regolazione del gas all'incubatore di coltura a rulli per un controllo preciso della concentrazione di ossigeno e della pressione iperbarica del gas è fondamen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore size filter (250 mL)	JetBiofil	FCA-206-250
0.22 µm pore size syringe PVDF filter	Millipore	SLGV033RS
8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat	iBidi	80827/80826
Bottle with adaptor cap for gas inlet	Arad Technologies
Bungs (Hole)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 06	Used to seal the bottles to the drum
Bungs (Solid)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 07	Used to seal the rotating drum
Culture bottles	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 03/BTC 04	Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04
D(+)-glucose Monohydrate	J.T. Baker
Diamond knife	Fine Science Tools	10100-30/45
Digital Pressure Gauge	Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd	BX-DPG80
DMEM	GIBCO	11880
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Biological industries	02-020-1A
Fetal Bovine Serum	Biological industries	04-013-1A
Gas regulation module	Arad Technologies	HannaLab1
Glutamax	GIBCO	35050061	glutamine
Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
HEPES	GIBCO	15630056
Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)	Fine Science Tools	11255-20
Pasteur pipettes (glass)	Hilgenberg	3150102
Pasteur pipettes (plastic)	Alexred	SO P12201
Penicillin/Streptomycin	Biological industries	03-031-1B
Petri Dishes (60 mm and 100 mm)	Falcon	351007/351029
Precision incubator system	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC01	BTC01 model with gas bubbler kit
Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)	Greiner Bio-One	#456005
Rat whole embryo culture serum	ENVIGO Bioproducts	B-4520
Stereoscopic microscope equipped with heating plate	Nikon	SMZ18
Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration	Pic Solution
Surgical scissors	Fine Science Tools	14094-11