Ex Utero Cultivo de embriones de ratón desde la pregastrulación hasta la organogénesis avanzada

Resumen

Una plataforma mejorada para el cultivo de embriones enteros permite el desarrollo continuo y robusto ex utero de embriones de ratón postimplantación durante un máximo de seis días, desde las etapas de pregastrulación hasta la organogénesis avanzada. En este protocolo, detallamos el procedimiento estándar para el cultivo exitoso de embriones utilizando placas estáticas y sistemas de botellas giratorias.

Resumen

Los métodos de cultivo de embriones de mamíferos postimplantación han sido generalmente ineficientes y limitados a breves períodos después de la disección fuera del útero. Recientemente se han desarrollado plataformas para el cultivo ex utero altamente robusto y prolongado de embriones de ratón desde las etapas de cilindro de huevo hasta la organogénesis avanzada. Estas plataformas permiten un desarrollo adecuado y fiel de embriones pregastrulantes (E5.5) hasta la etapa de formación del miembro posterior (E11). Los embriones de gastrulación tardía (E7.5) se cultivan en botellas giratorias en estos entornos, mientras que el cultivo extendido de las etapas de pregastrulación (E5.5 o E6.5) requiere una combinación de cultivos de botellas estáticas y giratorias. Además, la regulación sensible de la concentración de _O2 y _CO2 , la presión del gas, los niveles de glucosa y el uso de un medio de cultivo ex utero específico son críticos para el desarrollo adecuado del embrión. Aquí, se proporciona un protocolo detallado paso a paso para el cultivo extendido de embriones de ratón ex útero. La capacidad de cultivar embriones de ratón normales ex utero desde la gastrulación hasta la organogénesis representa una herramienta valiosa para caracterizar el efecto de diferentes perturbaciones experimentales durante el desarrollo embrionario.

Introducción

El desarrollo intrauterino del embrión de mamífero ha limitado el estudio de las primeras etapas del desarrollo postimplantacional1,2. La inaccesibilidad del embrión en desarrollo dificulta la comprensión de los procesos clave de desarrollo que ocurren después de que el embrión se implanta en el útero, como el establecimiento del plan corporal animal, la especificación de las capas germinales o la formación de tejidos y órganos. Además, el tamaño muy pequeño del embrión postimplantado temprano dificulta la observación por imágenes intravitales en el útero antes de E103. La incapacidad de observar y manipular embriones vivos en estas etapas ha restringido el estudio de la embriogénesis postimplantacional temprana a instantáneas durante el desarrollo.

Los protocolos para el cultivo in vitro de embriones de mamíferos preimplantacionales están bien establecidos, son confiables y se utilizan regularmente4. Sin embargo, los intentos de establecer sistemas de cultivo ex utero capaces de soportar el crecimiento adecuado de embriones postimplantacionales de mamíferos tuvieron un éxito ^limitado5. Desde hace más de un siglo se han propuesto diversas técnicas de cultivo, principalmente mediante el cultivo de los embriones en placas estáticas convencionales6,7,8 o botellas giratorias (cultivos con rodillos)^5,9,10. Estas plataformas demostraron ser útiles para ampliar el conocimiento sobre el desarrollo de los mamíferos después de la ^{implantación11,12}, a pesar de ser altamente ineficientes para la supervivencia embrionaria normal y limitadas a períodos cortos. Los embriones comenzaron a mostrar retraso en el desarrollo y anomalías morfológicas tan pronto como 24-48 h después del inicio del cultivo.

Este estudio proporciona una descripción detallada para configurar el sistema de cultivo embrionario ex utero que permite el desarrollo continuo desde la pregastrulación hasta las etapas avanzadas de organogénesis durante hasta seis días de desarrollo postimplantacional13. Este artículo describe el protocolo mejorado de cultivo de rodillos que apoya el crecimiento de embriones E7.5 (placa neural y etapa de pliegue de la cabeza) hasta la etapa de formación de la extremidad posterior (~ E11) y el cultivo extendido de E5.5 / E6.5 mediante la combinación de cultivo en placas estáticas y plataformas de cultivo de rodillos.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices de Protección Animal del Instituto Weizmann de Ciencia y fueron aprobados por el IACUC pertinente del Instituto Weizmann (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Se pidió a las mujeres embarazadas sanas que dieran su consentimiento informado para recolectar sangre de su cordón umbilical, según lo aprobado por el Comité del Centro Médico Rambam Helsinki (#RMB-0452-15). A los adultos sanos se les pidió su consentimiento informado para que se recolectara sangre de acuerdo con las pautas del Comité del Instituto Weizmann de Ciencias de Helsinki (# 1566-3).

1. Preparación de los medios

1. Preparar el medio de disección utilizando 500 ml de Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco sin rojo fenol y L-glutamina, complementado con suero bovino fetal al 10%, 5 ml de penicilina/estreptomicina, y esterilizar con filtro con un filtro de 0,22 μm.
   NOTA: Mantenga el medio de disección a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
2. Prepare el medio de cultivo embrionario ex utero (EUCM) fresco todos los días de cultivo dentro de una campana biológica utilizando el 25% del medio embrionario más el 50% de suero de rata y el 25% de suero de sangre de cordón umbilical humano (HCS) o suero de sangre humana para adultos (HBS).
3. Para preparar el medio embrionario, agregue 5 ml de glutamina, 5 ml de HEPES y 5 ml de penicilina/estreptomicina en 500 ml de DMEM sin rojo fenol y L-glutamina. Preparar alícuotas de 10-15 ml y almacenarlas a 4 °C durante un máximo de dos meses.
   NOTA: Duplique la concentración de antibióticos si experimenta alguna contaminación.
4. Inactivar térmicamente el suero de rata a 56 °C durante 30-45 min y filtrar a través de un filtro de difluoruro de polivinilideno de 0,22 μm. Use el suero para cultivo el mismo día de la inactivación. Descongele HCS o HBS y úselo inmediatamente para experimentos.
   NOTA: El suero comercial para ratas proporciona resultados consistentes (se probaron un mínimo de 4 lotes sin variación evidente). Alternativamente, se puede obtener suero para ratas de alta calidad internamente como se describió ^{anteriormente8,14}. Si HCS no está disponible, reemplácelo con HBS recolectado internamente. El suero de rata, HCS y HBS se pueden volver a congelar una vez y mantenerse a -20 ° C para su uso en un día diferente. Descongele y combine el suero recongelado con un mayor volumen de suero recién descongelado y no lo vuelva a congelar.

2. Recolección de suero sanguíneo del cordón umbilical humano y suero sanguíneo humano adulto

1. Para aislar el HCS, recolecte sangre del cordón umbilical de mujeres embarazadas sanas el día del parto por cesárea programado.
   1. Pinza doble el cordón umbilical a 5-7 cm del ombligo y transecta entre las pinzas inmediatamente después del parto del bebé.
   2. Extraiga sangre manualmente con una aguja de 14 G de gran diámetro y una jeringa de 50 ml directamente de la vena umbilical mientras la placenta permanece in situ para evitar cualquier rastro de hemólisis.
      NOTA: Recolectar sangre después de que el bebé sea retirado del campo de la cirugía, y la sangre umbilical ha sido extraída para pruebas clínicas.
2. Dispensar la sangre recolectada a tubos de ensayo estériles procoagulantes de 5 ml y transferirlos inmediatamente a 4 °C durante 15 minutos para permitir una coagulación completa. Centrifugar los tubos de ensayo coagulados a 2.500 × g durante 10 min a 4 °C.
3. Deseche los tubos que muestran signos de hemólisis (suero rosa-rojo). Recoger el suero (color amarillo) con una pipeta de 5 ml y filtrarlo a través de un filtro de 0,22 μm. Inactivar el suero inmediatamente en un baño de agua a 56 °C durante 45 min.
4. Prepare 1-1.5 ml de alícuotas del suero inactivado y guárdelas a -80 °C durante un máximo de seis meses. Si es necesario, envíe a -70 °C con hielo seco.
5. Para la recolección de suero sanguíneo humano en adultos, extraiga sangre de adultos sanos y aísle inmediatamente el suero siguiendo el mismo protocolo descrito para el suero de sangre de cordón umbilical. Guarde el HBS como alícuotas inactivadas por calor y filtradas a -80 °C durante un máximo de seis meses.
   NOTA: El suero del cordón umbilical humano y el suero humano adulto preparado recién hecho internamente dieron resultados superiores al suero disponible comercialmente. Recolectar HCS de mujeres sanas, mayores de 18 años y menores de 40 años programadas para el parto por cesárea. Excluya a las mujeres que dieron a luz vaginal y a las mujeres con cualquier enfermedad crónica o afecciones médicas activas, incluida la diabetes gestacional o la hipertensión.

3. Cultivo con rodillos ex utero de embriones de E7.5 a E11

1. Instalación de la incubadora de cultivo de rodillos y el regulador de gas
   1. Cultivo E7.5 o embriones más avanzados utilizando el sistema de incubadora de cultivo con rodillos. Encienda el rotador y la unidad de calentamiento a 37 °C durante al menos 1 h antes de las disecciones embrionarias. Agregue agua en autoclave a la botella de entrada de gas y al tubo de ensayo de salida.
      NOTA: Coloque un termómetro adyacente al tambor giratorio y verifique con frecuencia la estabilidad de la temperatura dentro de la incubadora. Abra la incubadora lo más rápido posible, ya que el tiempo de apertura prolongado aumentará la temperatura y afectará el desarrollo del embrión. Cuando sea necesario, agregue más agua en autoclave a la botella de entrada de gas y al tubo de ensayo de salida para mantenerlos a un mínimo de la mitad de su capacidad durante el cultivo. Proteja los embriones dentro de la incubadora de la luz cubriendo la incubadora con un paño.
   2. Encienda el módulo regulador de gas presionando el interruptor principal y, posteriormente, encienda los controladores de oxígeno/nitrógeno y _CO2 (Figura 1A). Ajuste los valores de oxígeno y _CO2 al 5% utilizando los controladores respectivos. Abra el regulador de gas y ajuste la presión del gas a ~ 6.5-7 libras por pulgada cuadrada (psi) moviendo el interruptor de voltaje en el transmisor de presión (Figura 1B). Confirme el valor de la presión del gas mediante un manómetro digital.
   3. Controle el flujo de gas comprobando la tasa de burbujas creadas dentro del tubo de ensayo lleno de agua de salida asignado dentro de la incubadora de precisión. Ajuste la velocidad de burbuja adecuada cerrando / abriendo la válvula de flujo de gas en la tapa de la botella de agua. Asegúrese de que el flujo de gas permita la formación de burbujas a una velocidad de 2-4 burbujas por segundo o establezca el flujo de burbujas en el primer punto donde el burbujeo sale al tubo de salida lleno de agua.
   4. Llene las botellas de cultivo con 2 ml de medio de cultivo y conéctelas al tambor giratorio ahuecado para la preequilibración durante 1 h. Use los tapones de silicio ahuecados para sellar las botellas al tambor. Mantenga sellados los espacios vacíos en el tambor giratorio utilizando los tapones sólidos.
      NOTA: La ausencia de burbujas en el tubo de salida (sin gas que entre por el sistema) o un flujo de gas excepcionalmente alto pueden afectar el desarrollo embrionario. En el caso de una falta de flujo de burbujas al tubo de ensayo de salida, verifique que todos los tapones de silicio estén colocados correctamente en el tambor giratorio y selle el sistema, y verifique que la botella de agua esté cerrada correctamente y que todos los tubos estén conectados correctamente. La falta de burbujeo que entra en la botella de agua puede indicar un mal funcionamiento en el regulador de gas.
2. Disección de embriones de ratón de ratones preñados
   1. Preequilibrar el medio de disección dentro de una incubadora a 37 °C y 5% de _CO2 durante un mínimo de 1 h. Deje la tapa ligeramente abierta para permitir el intercambio de gases.
   2. Sacrificar a la hembra embarazada por luxación cervical, limpiar el abdomen de la hembra con etanol al 70% y cortar la piel y la pared abdominal con tijeras. Localice un extremo del útero y corte en la intersección entre el ovario y el útero. A continuación, corte a lo largo del útero hasta el otro extremo y transfiéralo a una placa de Petri de 100 mm llena de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco a temperatura ambiente.
      NOTA: Se recomienda el uso de hembras no preparadas con hormonas y apareadas naturalmente.
   3. Lave rápidamente los conceptos en DPBS y córtelos en pares para facilitar el manejo de embriones. Mueva todos los pares de conceptuses a un medio de disección preequilibrado en una placa de Petri de 60 mm y córtelos en conceptuses individuales.
   4. Retire la pared uterina de los conceptuses rasgando el tejido uterino con un par de fórceps gruesos. Use pinzas microquirúrgicas finas para cortar la punta de la decidua en forma de pera. Inserte los fórceps junto al embrión paralelos a su eje largo y abra los fórceps para dividir la decidua en mitades.
   5. Finalmente, deje el cono ectoplacental intacto unido al cilindro de huevo agarrando el embrión de la decidua y pelando el saco vitelino parietal del embrión con fórceps finos.
      NOTA: Para evitar afectar al embrión, realice disecciones en un microscopio equipado con una placa calefactora a 37 °C en un plazo máximo de 30-40 min. Diseccionar una camada de embriones a la vez.
   6. Inmediatamente después de la disección, transfiera los embriones a una nueva placa llena de medio de disección equilibrado utilizando una pipeta Pasteur de vidrio para evitar que los embriones se peguen a los restos de tejido.
   7. Seleccione aquellos embriones en la etapa de placa neural / pliegue temprano de la cabeza que no muestren daño en el epiblasto y transfiera 5-6 embriones por botella a las botellas de cultivo de vidrio preequilibradas.
      NOTA: Para preparar la pipeta Pasteur de vidrio, corte la abertura de la pipeta a un tamaño adecuado para que quepa los embriones utilizando un cortador de vidrio, y manténgala en etanol para evitar la contaminación. Lave la pipeta de vidrio con PBS antes de transferir embriones. Al transferir los embriones al frasco de cultivo, asegúrese de llevar el menor volumen posible del medio de disección para evitar diluir el EUCM.
   8. Coloque las botellas en el sistema de cultivo giratorio a 37 °C, en una atmósfera de 5% de _O2 y 5% de _CO2.
   9. Cada día de cultivo, retire las botellas una por una de la incubadora para evaluar el desarrollo embrionario bajo un estereomicroscopio. Asegúrese de cerrar el orificio vacío en el tambor con un tapón sólido al retirar una botella. Cortar la punta de una pipeta Pasteur de plástico estéril para que se ajuste al tamaño del embrión y mover los embriones a una placa de Petri para facilitar la observación. Asegúrese de que los embriones estén siempre cubiertos por medio.
      NOTA: Minimizar el tiempo durante el cual los embriones están fuera de la incubadora para evitar efectos perjudiciales en los embriones debido a una disminución de la temperatura corporal. Manipule los embriones con cuidado para evitar la ruptura de los vasos sanguíneos del saco vitelino, lo que afecta la supervivencia del embrión.
   10. En el día de cultivo 1 (equivalente a E8.5), transfiera grupos de 3 embriones a un nuevo frasco con 2 ml de EUCM fresco y preequilibrado que contenga 3 mg/ml adicionales de D-glucosa y una mezcla de gases de 13% de _O2, 5% de _CO2.
   11. Después de 48 h (equivalente a E9.5), transfiera grupos de dos embriones a una nueva botella con EUCM fresco precalentado más 3,5 mg/ml de glucosa en una atmósfera gaseosa de 18% _O2 y 5% _CO2.
   12. A las 72 h de cultivo (equivalente a E10,5), mover cada embrión a un frasco individual que contenga 1,5-2 ml de medio fresco suplementado con 4 mg/ml de glucosa y un suministro de gas de 21% de _O2 y 5% de _CO2.
       NOTA: Los embriones alcanzan su máximo crecimiento alrededor de la medianoche del día 4 de cultivo.
   13. Use fórceps finos para eliminar el saco vitelino y el amnios, y desprenda el cordón umbilical para la observación adecuada de la morfología embrionaria. Apague el módulo de regulación de gas y la incubadora de precisión.
       NOTA: Preequilibrar el medio de cultivo durante 1 hora mediante incubación dentro de una botella de vidrio en el cultivo de rodillos con una atmósfera de gas adecuada según la etapa embrionaria. Limpie las botellas de cultivo y toda la cristalería de la incubadora después de cada uso realizando tres lavados con agua destilada corriente seguida de un lavado nocturno sumergido en etanol al 70%. Vuelva a lavar tres veces con agua destilada corriente, deje que las botellas se sequen durante la noche y esterilize en autoclave. Del mismo modo, autoclave los tapones de silicio regularmente. Limpie a fondo todas las herramientas de disección con etanol al 70% y esterilícelas en seco.

4. Cultivo embrionario extendido de E5.5/E6.5 a E11

1. Cultivo de embriones de pregastración (E5.5) y gastrulación temprana (E6.5) hasta la etapa temprana de somita (E8.5) en placas estáticas.
2. Preequilibrar el medio de disección durante 1 h en una incubadora con 5% de _CO2 a 37 °C.
   NOTA: Para permitir el intercambio de gases, no cierre la tapa del tubo por completo.
3. Prepare las placas de cultivo agregando 250 μL de EUCM recién preparado a cada pozo. Coloque las placas dentro de una incubadora de _CO2 a 37 °C para el preequilibrio.
   NOTA: Aunque las placas de 8 pocillos son adecuadas para el crecimiento embrionario, el cultivo se puede hacer en cualquier otra placa ajustando el volumen del medio de acuerdo con el tamaño de la placa.
4. Diseccionar embriones de cilindro de óvulo fuera del útero siguiendo la técnica descrita para E7.5. Retire el saco vitelino parietal del embrión y deje el cono ectoplacental intacto unido al cilindro del huevo.
5. Transfiera embriones individuales a cada pocillo de la placa de 8 pocillos usando una micropipeta y coloque la placa dentro de la incubadora con un 5% de _CO2 a 37 ° C.
6. Imagine los embriones bajo un estereomicroscopio y seleccione para el cultivo solo aquellos con una cavidad amniótica bien formada, sin daños evidentes y sin la membrana de Reichert.
   NOTA: Utilice puntas de pipeta de 20 μL para transferir embriones E5.5 y puntas de 200 μL para transferir embriones E6.5. En el caso de cultivos a partir de E6.5, HCS puede ser reemplazado por HBS recién recolectado.
7. Retire la mitad del medio y agregue 250 μL de EUCM precalentado recién preparado después de 24 h de cultivo, asegurando que los embriones estén siempre inmersos en el medio de cultivo. En el caso de cultivos a partir de E5.5, después de dos días de cultivo (equivalente a E7.5), retire 200 μL y agregue 250 μL de nuevo EUCM.
   NOTA: Durante el cultivo estático, los embriones pueden adherirse a la placa (principalmente cuando se usan placas de plástico), lo que comprometerá gravemente el desarrollo embrionario. La unión del embrión a la placa es más frecuente en el primer día de cultivo de embriones E5.5. Para evitar la fijación, empuje cuidadosamente los embriones lejos de la superficie de la placa con fórceps finos y estériles. Verifique que solo el cono ectoplacentario permanezca unido a la superficie de la placa.
8. Transferir los embriones al cultivo con rodillos en la etapa temprana de somita (4-7 somitas; después de tres días de cultivo para embriones explantados a E5.5 y dos días para cultivos iniciados en E6.5), siguiendo las mismas indicaciones descritas anteriormente para embriones en etapa E8.5.
   NOTA: La transferencia de los embriones al cultivo con rodillos en etapas de somita diferentes a las indicadas anteriormente da como resultado el fracaso del desarrollo posterior. A diferencia de los cultivos ex utero de E7.5, es posible mantener los embriones en una atmósfera constante de 21% de oxígeno y 5% de _CO2, proporcionando una eficiencia ligeramente mayor de desarrollo embrionario que las atmósferas con concentración dinámica de oxígeno.

Resultados

Las condiciones de cultivo con rodillos descritas para embriones E7.5 (etapa de gastrulación tardía) apoyan un crecimiento embrionario constante y normal con una eficiencia promedio cercana al 75% después de 4 días de cultivo (Figura 2 y Tabla 1). La eficiencia del desarrollo embrionario puede variar entre diversos antecedentes genéticos de ratón, pero es consistentemente robusta (Figura 2C). La suplementación con HBS en lugar de HCS prod...

Discusión

El protocolo de cultivo presentado aquí puede mantener un desarrollo embrionario de ratón adecuado y continuo ex utero durante un máximo de seis días, desde E5.5 hasta E11. Anteriormente, los embriones en estas etapas de desarrollo podían desarrollarse normalmente en cultivo solo por períodos cortos (hasta 48 h)¹⁵. El acoplamiento del módulo de regulación de gas a la incubadora de cultivo de rodillos para un control preciso de la concentración de oxígeno y la presión de gas hip...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore size filter (250 mL)	JetBiofil	FCA-206-250
0.22 µm pore size syringe PVDF filter	Millipore	SLGV033RS
8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat	iBidi	80827/80826
Bottle with adaptor cap for gas inlet	Arad Technologies
Bungs (Hole)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 06	Used to seal the bottles to the drum
Bungs (Solid)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 07	Used to seal the rotating drum
Culture bottles	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 03/BTC 04	Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04
D(+)-glucose Monohydrate	J.T. Baker
Diamond knife	Fine Science Tools	10100-30/45
Digital Pressure Gauge	Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd	BX-DPG80
DMEM	GIBCO	11880
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Biological industries	02-020-1A
Fetal Bovine Serum	Biological industries	04-013-1A
Gas regulation module	Arad Technologies	HannaLab1
Glutamax	GIBCO	35050061	glutamine
Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
HEPES	GIBCO	15630056
Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)	Fine Science Tools	11255-20
Pasteur pipettes (glass)	Hilgenberg	3150102
Pasteur pipettes (plastic)	Alexred	SO P12201
Penicillin/Streptomycin	Biological industries	03-031-1B
Petri Dishes (60 mm and 100 mm)	Falcon	351007/351029
Precision incubator system	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC01	BTC01 model with gas bubbler kit
Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)	Greiner Bio-One	#456005
Rat whole embryo culture serum	ENVIGO Bioproducts	B-4520
Stereoscopic microscope equipped with heating plate	Nikon	SMZ18
Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration	Pic Solution
Surgical scissors	Fine Science Tools	14094-11