Ex Utero Культура эмбрионов мышей от прегаструляции до продвинутого органогенеза

Резюме

Усовершенствованная платформа для культивирования всего эмбриона позволяет непрерывно и надежно развивать ex utero постимплантационные эмбрионы мышей в течение шести дней, от стадий прегаструляции до продвинутого органогенеза. В этом протоколе мы подробно описываем стандартную процедуру успешного культивирования эмбрионов с использованием статических пластин и вращающихся бутылочных систем.

Аннотация

Постимплантационные методы культивирования эмбрионов млекопитающих были, как правило, неэффективными и ограничивались короткими периодами после рассечения матки. Недавно были разработаны платформы для высокопрочной и длительной внеутробной культуры эмбрионов мышей от стадий яичного цилиндра до продвинутого органогенеза. Эти платформы обеспечивают надлежащее и достоверное развитие прегаструлирующих эмбрионов (E5.5) до стадии формирования задних конечностей (E11). Поздние гаструлирующие эмбрионы (E7.5) выращиваются во вращающихся баллонах в этих условиях, в то время как расширенная культура со стадий предварительной гаструляции (E5.5 или E6.5) требует комбинации статических и вращающихся культур бутылок. Кроме того, чувствительная регуляция концентрации _O2 и _CO2 , газового давления, уровня глюкозы и использования конкретной внеутробной питательной среды имеют решающее значение для правильного развития эмбриона. Здесь представлен подробный пошаговый протокол для расширенной культуры эмбрионов ex utero мыши. Способность выращивать нормальные эмбрионы мышей ex utero от гаструляции до органогенеза представляет собой ценный инструмент для характеристики эффекта различных экспериментальных возмущений во время эмбрионального развития.

Введение

Внутриутробное развитие эмбриона млекопитающего ограничило изучение ранних стадий постимплантационного ^{развития1,2}. Недоступность развивающегося эмбриона препятствует пониманию ключевых процессов развития, происходящих после имплантации эмбриона в матку, таких как создание плана тела животного, спецификация зародышевых слоев или формирование тканей и органов. Кроме того, очень маленький размер раннего постимплантированного эмбриона затрудняет наблюдение с помощью прижизненной визуализации в утробе матери до ^E103. Неспособность наблюдать и манипулировать живыми эмбрионами на этих стадиях ограничила изучение раннего постимплантационного эмбриогенеза моментальными снимками во время развития.

Протоколы культивирования in vitro эмбрионов млекопитающих до имплантации хорошо зарекомендовали себя, надежны и регулярно ^{используются4}. Тем не менее, попытки создать системы внеутробных культур, способные поддерживать правильный рост эмбрионов млекопитающих после имплантации, имели ограниченный ^успех5. На протяжении более века предлагались различные методы культивирования, главным образом путем культивирования эмбрионов в обычных статических пластинах6,7,8 или вращающихся бутылках (роликовых культурах)^5,9,10. Эти платформы оказались полезными в расширении знаний о развитии млекопитающих после имплантации11,12, несмотря на то, что они крайне неэффективны для нормальной выживаемости эмбрионов и ограничены короткими периодами. Эмбрионы начали проявлять задержку развития и морфологические аномалии уже через 24-48 ч после начала культивирования.

Это исследование дает подробное описание для создания системы культивирования эмбрионов ex utero , которая позволяет непрерывно развиваться от прегаструляции до продвинутых стадий органогенеза в течение шести дней постимплантационного ^{развития13}. В этой статье описывается улучшенный протокол культивирования роликов, который поддерживает рост эмбрионов E7.5 (нейронная пластина и стадия головы) до стадии формирования задних конечностей (~ E11) и расширенная культура из E5.5 / E6.5 путем объединения культуры на статических пластинах и платформах для культивирования роликов.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по защите животных Института науки Вейцмана и одобрены соответствующим Институтом Вейцмана IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Здоровых беременных женщин попросили дать свое информированное согласие на забор крови из пуповины, как это было одобрено Хельсинкским комитетом Медицинского центра Рамбам (#RMB-0452-15). У здоровых взрослых людей спрашивали их информированное согласие на сбор крови в соответствии с руководящими принципами Хельсинкского комитета Института науки Вейцмана (#1566-3).

1. Подготовка СМИ

1. Приготовьте среду для рассечения, используя 500 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) без фенольного красного и L-глутамина, дополненного 10% фетальной бычьей сывороткой, 5 мл пенициллина / стрептомицина, и фильтруйте-стерилизуйте с помощью фильтра 0,22 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите среду для рассечения при 4 °C до 1 месяца.
2. Готовьте культуральную среду ex utero embryo culture (EUCM) каждый день культивирования внутри биологического капюшона, используя 25% эмбриональной среды плюс 50% сыворотки крыс и 25% сыворотки пуповинной крови человека (HCS) или сыворотки крови взрослого человека (HBS).
3. Для получения эмбриональной среды добавляют 5 мл глутамина, 5 мл HEPES и 5 мл пенициллина/стрептомицина в 500 мл DMEM без фенольного красного и L-глутамина. Приготовьте 10-15 мл аликвот и храните их при 4 °C до двух месяцев.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удвоение концентрации антибиотиков при наличии какого-либо загрязнения.
4. Термоактивируют сыворотку крыс при 56 °C в течение 30-45 мин и фильтруют через фильтр 0,22 мкм поливинилидендифторида. Используйте сыворотку для посева в тот же день инактивации. Разморозьте HCS или HBS и немедленно используйте его для экспериментов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческая крысиная сыворотка дает стабильные результаты (минимум 4 партии были протестированы без очевидных изменений). Альтернативно, высококачественная крысиная сыворотка может быть получена собственными силами, как описано ^{ранее8,14}. Если HCS недоступен, замените его на HBS, собранный собственными силами. Крысиная сыворотка, HCS и HBS могут быть повторно заморожены один раз и сохранены при -20 ° C для использования в другой день. Разморозьте и соедините замороженную сыворотку с большим объемом свежеотмороженной сыворотки и не замораживайте ее повторно.

2. Коллекция сыворотки пуповинной крови человека и сыворотки крови взрослого человека

1. Чтобы изолировать HCS, соберите пуповинную кровь у здоровых беременных женщин в день планового кесарева сечения.
   1. Двойной зажим пуповины на 5-7 см от пупка и трансекция между зажимами сразу после родов младенца.
   2. Вручную извлекайте кровь с помощью большой иглы 14 Г и шприца 50 мл непосредственно из пупочной вены, в то время как плацента остается на месте, чтобы избежать каких-либо следов гемолиза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите кровь после того, как младенец был удален из области хирургии, и пуповинная кровь была взята для клинических испытаний.
2. Дозируют собранную кровь до 5 мл прокоагулянта в стерильных пробирках и сразу же переносят их до 4 °C в течение 15 мин, чтобы обеспечить полную коагуляцию. Центрифугировать коагулированные пробирки при 2 500 × г в течение 10 мин при 4 °C.
3. Выбросьте трубки с признаками гемолиза (розово-красная сыворотка). Соберите сыворотку (желтого цвета) с помощью пипетки 5 мл и отфильтруйте ее через фильтр 0,22 мкм. Нагрейте сыворотку сразу же на водяной бане при температуре 56 °C в течение 45 мин.
4. Приготовьте 1-1,5 мл аликвоты инактивированной сыворотки и храните их при -80 °C до шести месяцев. При необходимости отправляйте судно при температуре -70 °C с использованием сухого льда.
5. Для сбора сыворотки крови взрослого человека возьмите кровь у здоровых взрослых и немедленно выделите сыворотку в соответствии с тем же протоколом, описанным для сыворотки пуповинной крови. Храните HBS в виде термоинактивированных и отфильтрованных аликвот при -80 °C в течение шести месяцев.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка пуповины человека и сыворотка для взрослых людей, приготовленная только что на месте , дали превосходные результаты по сравнению с коммерчески доступной сывороткой. Собирайте HCS у здоровых женщин в возрасте старше 18 лет и младше 40 лет, запланированных на кесарево сечение. Исключить женщин, которые родили вагинально, и женщин с любым хроническим заболеванием или активными заболеваниями, включая гестационный диабет или гипертонию.

3. Ex utero роликовая культура эмбрионов от E7.5 до E11

1. Настройка роликового культивируемого инкубатора и газового регулятора
   1. Культивирование Е7.5 или более продвинутых эмбрионов с использованием системы роликовых культур инкубатора. Включите ротатор и нагревательный блок при 37 °C в течение не менее 1 ч до рассечения эмбриона. Добавьте автоклавную воду в газовый баллон и выходную пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите термометр рядом с вращающимся барабаном и часто проверяйте стабильность температуры внутри инкубатора. Открытие инкубатора как можно быстрее, так как длительное время открытия повысит температуру и повлияет на развитие эмбриона. При необходимости добавьте больше автоклавной воды в газовый входной баллон и выходную пробирку, чтобы сохранить их на минимальной половинной емкости во время посева. Защитите эмбрионы внутри инкубатора от света, накрыв инкубатор тканью.
   2. Включите модуль газового регулятора, нажав на главный переключатель и впоследствии включив контроллеры кислорода/азота и _CO2 (рисунок 1A). Установите значения кислорода и _CO2 на 5% с помощью соответствующих контроллеров. Откройте газовый регулятор и установите давление газа на ~6,5-7 фунтов на квадратный дюйм (psi), переместив переключатель напряжения в преобразователе давления (рисунок 1B). Подтвердите значение давления газа с помощью цифрового манометра.
   3. Контролируйте поток газа, проверяя скорость пузырьков, создаваемых внутри заполненной водой пробирки, выделенной внутри прецизионного инкубатора. Установите правильную скорость пузырьков, закрыв/открыв клапан потока газа на крышке бутылки с водой. Убедитесь, что поток газа допускает образование пузырьков со скоростью 2-4 пузырька в секунду или установите пузырьковый поток в первой точке, где пузырьки выходят в заполненную водой выходную трубку.
   4. Наполните бутылки культуры 2 мл питательной среды и заткните их в полый вращающийся барабан для предварительного выравнивания на 1 ч. Используйте полые силиконовые бунги, чтобы запечатать бутылки на барабане. Держите герметичными пустые пространства во вращающемся барабане с помощью сплошных бунгов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие пузырьков в выпускной трубке (нет газа, проходящего через систему) или исключительно высокий поток газа могут повлиять на развитие эмбриона. В случае отсутствия пузырькового потока к выходной пробирке проверьте, что все кремниевые бунги правильно расположены во вращающемся барабане и герметизируют систему, и убедитесь, что бутылка с водой закрыта правильно и все трубки подключены правильно. Отсутствие пузырьков, поступающих в бутылку с водой, может свидетельствовать о неисправности в газовом регуляторе.
2. Вскрытие эмбрионов мышей от беременных мышей
   1. Предварительно выравнивайте среду для рассечения внутри инкубатора при 37 °C и 5% _CO2 в течение не менее 1 ч. Оставьте крышку слегка открытой, чтобы обеспечить газообмен.
   2. Принесите беременную самку при вывихе шейки матки, очистите живот самки 70% этанолом, а ножницами разрезайте кожу и брюшную стенку. Найдите один конец матки и разрезайте на пересечении между яичником и маткой. Затем нарежьте матку до другого конца и переложите ее в 100-миллиметровую чашку Петри, наполненную фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco комнатной температуры (DPBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать не гормонально-праймированные, естественно спаренные самки.
   3. Быстро мойте концептуалы в DPBS и разрезайте попарно, чтобы облегчить обработку эмбрионов. Переместите все пары концептуусов на предварительно уравновешенную среду рассечения в 60-миллиметровой чашке Петри и разделите на отдельные концептуалы.
   4. Удаляют стенку матки концептусов, разрывая ткань матки с помощью пары грубых щипцов. Используйте тонкие микрохирургические щипцы, чтобы разрезать кончик грушевидной децидуа. Вставьте щипцы рядом с эмбрионом параллельно его длинной оси и откройте щипцы, чтобы разделить децидуу на половинки.
   5. Наконец, оставьте неповрежденный эктоплацентарный конус, прикрепленный к цилиндру яйцеклетки, захватив эмбрион из децидуа и сняв теменной желточный мешок с эмбриона с помощью тонких щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать воздействия на эмбрион, выполните вскрытие на микроскопе, оснащенном нагревательной пластиной при 37 °C в течение максимум 30-40 мин. Рассекайте по одному помету эмбрионов за раз.
   6. Сразу после рассечения перенесите эмбрионы на новую пластину, заполненную уравновешенной средой для рассечения, используя стеклянную пипетку Пастера, чтобы предотвратить прилипание эмбрионов к обломкам тканей.
   7. Выберите те эмбрионы, которые находятся на стадии нервной пластинки / ранней складки головки, не показывающие повреждения в эпибласте, и перенесите 5-6 эмбрионов на бутылку в предварительно уравновешенные стеклянные бутылочки для культивирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подготовить стеклянную пипетку Пастера, разрежьте отверстие пипетки до подходящего размера, чтобы соответствовать эмбрионам, используя стеклорез, и храните его в этаноле, чтобы избежать загрязнения. Вымойте стеклянную пипетку PBS перед переносом эмбрионов. При переносе эмбрионов в бутылочку для культивирования убедитесь, что вы переносите как можно меньший объем среды для рассечения, чтобы избежать разбавления EUCM.
   8. Поместите бутылки во вращающуюся культуральную систему при 37 °C, в атмосферу с содержанием 5% _O2 и 5% _CO2.
   9. Каждый день культивирования извлекайте бутылочки один за другим из инкубатора, чтобы оценить развитие эмбриона под стереомикроскопом. Обязательно закройте пустое отверстие в барабане твердым бунгом при извлечении бутылки. Вырежьте кончик стерильной пластиковой пипетки Пастера, чтобы она соответствовала размеру эмбриона, и переместите эмбрионы в чашку Петри, чтобы облегчить наблюдение. Убедитесь, что эмбрионы всегда покрыты средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сведите к минимуму время, в течение которого эмбрионы находятся вне инкубатора, чтобы избежать пагубных последствий для эмбрионов из-за снижения температуры тела. Обращайтесь с эмбрионами осторожно, чтобы избежать разрыва кровеносных сосудов желточного мешка, влияющего на выживаемость эмбрионов.
   10. На 1-й день культивирования (эквивалент Е8.5) переносят группы из 3 эмбрионов в новый флакон с 2 мл свежего и предварительно уравновешенного EUCM, содержащего дополнительные 3 мг/мл D-глюкозы и газовую смесь 13% _O2, 5% _CO2.
   11. Через 48 ч (эквивалентно Е9,5) переносят группы из двух эмбрионов в новый флакон со свежим предварительно нагретым EUCM плюс 3,5 мг/мл глюкозы в газовой атмосфере 18% _O2 и 5% _CO2.
   12. Через 72 ч культуры (эквивалентно Е10,5) переместите каждый эмбрион в отдельный флакон, содержащий 1,5-2 мл свежей среды, дополненной 4 мг/мл глюкозы и газоснабжением 21% _O2 и 5% _CO2.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы достигают своего максимального роста около полуночи 4-го дня культивирования.
   13. Используйте тонкие щипцы, чтобы удалить желточный мешок и амнион, и отсоедините пуповину для правильного наблюдения за морфологией эмбриона. Выключите модуль регулирования газа и прецизионный инкубатор.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное выравнивание питательной среды в течение 1 часа путем инкубации внутри стеклянной бутылки в роликовой культуре с адекватной газовой атмосферой в соответствии со стадией эмбриона. Очищайте бутылки для культивирования и всю стеклянную посуду инкубатора после каждого использования, выполняя три промывки с проточной дистиллированной водой с последующей ночной промывкой, погруженной в 70% этанол. Трижды промыть проточной дистиллированной водой, дать бутылкам высохнуть на ночь и стерилизовать автоклавом. Аналогичным образом, регулярно автоклавируйте кремниевые пробки. Тщательно очистите все инструменты для рассечения 70% этанолом и стерилизуйте их.

4. Расширенная культура эмбрионов от E5.5/E6.5 до E11

1. Культивировать прегаструляцию (Е5.5) и раннюю гаструляцию (Е6.5) эмбрионы до ранней стадии сомита (Е8.5) в статические пластины.
2. Предварительно уравновешивают среду рассечения в течение 1 ч в инкубаторе с 5% _CO2 при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить газообмен, не закрывайте крышку трубки полностью.
3. Подготовьте формы для культивирования, добавив в каждую лунку по 250 мкл свежеприготовленного EUCM. Поместите пластины внутрь _{CO2-инкубатора} при температуре 37 °C для предварительного уравновешивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя 8-луночные пластины хорошо подходят для роста эмбрионов, культивирование может быть выполнено в любой другой пластине путем регулировки объема среды в соответствии с размером пластины.
4. Рассечение эмбрионов яичного цилиндра из матки по методике, описанной для E7.5. Удалите теменный желточный мешок эмбриона и оставьте неповрежденный эктоплацентарный конус, прикрепленный к цилиндру яйца.
5. Перенесите отдельные эмбрионы в каждую лунку 8-луночной пластины с помощью микропипетки и поместите пластину внутрь инкубатора с 5% _CO2 при 37 °C.
6. Визуализируйте эмбрионы под стереомикроскопом и выбирайте для культивирования только эмбрионы с хорошо сформированной амниотической полостью, без видимых повреждений и без мембраны Райхерта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники пипеток объемом 20 мкл для переноса эмбрионов E5.5 и наконечники 200 мкл для переноса эмбрионов E6.5. В случае культур, начинающихся с E6.5, HCS может быть заменен свежесобранным HBS.
7. Удалите половину среды и добавьте 250 мкл свежеприготовленного предварительно приготовленного EUCM после 24 ч культивирования, гарантируя, что эмбрионы всегда погружаются в культуральную среду. В случае культур, начинающихся с E5.5, после двух дней культивирования (эквивалентно E7.5) удаляют 200 мкл и добавляют 250 мкл нового EUCM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время статической культуры эмбрионы могут прикрепляться к пластине (в основном при использовании пластиковых пластин), что серьезно помешает развитию эмбриона. Прикрепление эмбриона к пластине происходит чаще в первый день культивирования эмбрионов Е5.5. Чтобы предотвратить прикрепление, осторожно оттолкните эмбрионы от поверхности пластины с помощью тонких, стерильных щипцов. Убедитесь, что к поверхности пластины остается только эктоплацентарный конус.
8. Перенос эмбрионов в роликовую культуру на ранней стадии сомита (4-7 сомитов; после трех дней культивирования для эмбрионов, эксплантированных при Е5,5 и двух дней для культур, начатых при Е6,5), следуя тем же показаниям, описанным ранее для эмбрионов стадии Е8.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос эмбрионов в роллеровую культуру на стадиях сомита, отличных от указанных выше, приводит к сбою дальнейшего развития. В отличие от E7.5 ex utero культур, можно поддерживать эмбрионы в постоянной атмосфере 21% кислорода и 5% _CO2, обеспечивая несколько более высокую эффективность развития эмбриона, чем атмосферы с динамической концентрацией кислорода.

Результаты

Условия культивирования роликов, описанные для эмбрионов E7.5 (стадия поздней гаструляции), поддерживают постоянный и нормальный рост эмбриона со средней эффективностью, близкой к 75% через 4 дня культивирования (рисунок 2 и таблица 1). Эффективность развития эмбри...

Обсуждение

Протокол культивирования, представленный в настоящем описании, может поддерживать правильное и непрерывное развитие эмбриона мыши ex utero в течение шести дней, от E5.5 до E11. Ранее эмбрионы на этих стадиях развития могли нормально развиваться в культуре только в течение коротких перио...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore size filter (250 mL)	JetBiofil	FCA-206-250
0.22 µm pore size syringe PVDF filter	Millipore	SLGV033RS
8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat	iBidi	80827/80826
Bottle with adaptor cap for gas inlet	Arad Technologies
Bungs (Hole)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 06	Used to seal the bottles to the drum
Bungs (Solid)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 07	Used to seal the rotating drum
Culture bottles	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 03/BTC 04	Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04
D(+)-glucose Monohydrate	J.T. Baker
Diamond knife	Fine Science Tools	10100-30/45
Digital Pressure Gauge	Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd	BX-DPG80
DMEM	GIBCO	11880
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Biological industries	02-020-1A
Fetal Bovine Serum	Biological industries	04-013-1A
Gas regulation module	Arad Technologies	HannaLab1
Glutamax	GIBCO	35050061	glutamine
Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
HEPES	GIBCO	15630056
Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)	Fine Science Tools	11255-20
Pasteur pipettes (glass)	Hilgenberg	3150102
Pasteur pipettes (plastic)	Alexred	SO P12201
Penicillin/Streptomycin	Biological industries	03-031-1B
Petri Dishes (60 mm and 100 mm)	Falcon	351007/351029
Precision incubator system	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC01	BTC01 model with gas bubbler kit
Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)	Greiner Bio-One	#456005
Rat whole embryo culture serum	ENVIGO Bioproducts	B-4520
Stereoscopic microscope equipped with heating plate	Nikon	SMZ18
Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration	Pic Solution
Surgical scissors	Fine Science Tools	14094-11