엑스 우테로 사전 배후에서 고급 유기발생에 이르는 마우스 배아의 배양

요약

전체 배아 배양을 위한 향상된 플랫폼은 사전 배기 단계부터 고급 유기발생까지 최대 6일 동안 이식 후 마우스 배아의 연속적이고 강력한 전자궁 개발을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 정적 플레이트와 회전 병 시스템을 사용하여 성공적인 배아 배양을 위한 표준 절차를 자세히 설명합니다.

초록

이식 후 포유류 배아 배양 방법은 일반적으로 비효율적이고 자궁에서 해부 후 짧은 기간으로 제한되었습니다. 플랫폼은 최근에 향상된 유기발생까지 계란 실린더 단계에서 마우스 배아의 매우 강력하고 장기간 전 자궁 배양을 위해 개발되었습니다. 이러한 플랫폼은 뒷두개 형성 단계(E11)까지 배아(E5.5)를 예식하는 적절하고 충실한 개발을 가능하게 한다. 늦은 가스루 배아(E7.5)는 이러한 설정에서 회전병에서 재배되는 반면, 예기 단계(E5.5 또는 E6.5)에서 확장된 배양은 정적 및 회전 병 배양의 조합을 필요로 한다. 또한, _O2 및 _CO2 농도, 가스 압력, 포도당 수준 및 특정 전 자궁 배양 배지의 사용에 대한 민감한 조절은 적절한 배아 발달에 매우 중요하다. 여기서, 확장된 전자궁 마우스 배아 배양을 위한 상세한 단계별 프로토콜이 제공된다. 기체에서 유기발생에 이르는 정상 마우스 배아 전 자궁 을 성장시키는 능력은 배아 발달 중 다른 실험적 동요의 효과를 특성화하기 위한 귀중한 도구를 나타낸다.

서문

포유류 배아의 자궁 내 발달은 이식 후 발달의 초기 단계의 연구를 제한했다^1,2. 개발 배아의 접근성은 동물 체형 계획의 수립, 세균 층의 사양 또는 조직 및 장기의 형성과 같은 자궁으로 배아 임플란트 후 발생하는 주요 발달 과정의 이해를 방해합니다. 더욱이, 초기 이식 후 배아의 아주 작은 크기는 E103 의 앞에 자궁에 있는 본질적인 화상 진찰에 의해 관찰하기 어렵게 만듭니다. 이 단계에서 살아있는 태아를 관찰하고 조작하는 무능력은 발달 도중 스냅샷에 초기 이식 후 배아 발생의 연구 연구를 제한했습니다.

전 이식 포유류 배아의 체외 배양을 위한 프로토콜은 잘 확립되고, 믿을 수 있고, 정기적으로 이용됩니다⁴. 그럼에도 불구하고, 적절한 포유류 이식 후 배아 성장을 지원할 수 있는 자궁 배양 시스템을 확립하려는 시도는 성공을 제한했다⁵. 종래의 정적 판에서 배아를 배양함으로써 100년 이상 다양한 배양 기술이 제안되어 왔으며, 주로 종래의 정적 플레이트^6,7,8 또는 회전병(롤러 배양)^5,9,10에서 배아를 배양함으로써 제안되었다. 이 플랫폼은 이식 후 포유류 개발에 대한 지식을 확장하는 데 도움이 입증^11,12, 정상적인 배아 생존을 위해 매우 비효율적이고 짧은 기간에 제한에도 불구하고. 배아는 문화 개시 후 24-48 h로 발달 지체 및 형태 학적 이상을 표시하기 시작했다.

본 연구는 사전 접종에서 최대 6일간의 고급 유기발생 단계로의 지속적인 발달을 허용하는 전 자궁 배아 배양 시스템을 설정하기 위한 상세한 설명을 제공한다¹³. 이 논문은 정전기 판및 롤러 배양 플랫폼에 문화를 결합하여 뒷다리 형성 단계(~E11)와 E5.5/E6.5로부터의 확장배양까지 E7.5 배아(신경판 및 헤드폴드 스테이지)의 성장을 지원하는 개선된 롤러 배양 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 바이즈만 과학 연구소의 동물 보호 지침에 따라 수행되었으며 관련 Weizmann Institute IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2)에 의해 승인되었습니다. 건강한 임산부는 람밤 의료 센터 헬싱키 위원회 (#RMB-0452-15)의 승인을 받아 탯줄에서 혈액을 수집하는 데 정보에 입각한 동의를 요청받았습니다. 건강한 성인은 과학 헬싱키 위원회의 Weizmann 연구소의 지침에 따라 혈액을 수집하기 위해 자신의 정보에 입각한 동의를 요청했다 (#1566-3).

1. 미디어 준비

1. 페놀 레드와 L-글루타민없이 덜벡코의 수정 독수리 매체(DMEM)의 500mL를 사용하여 해부 매체를 준비, 10% 태아 소 혈청, 5mL 의 페니실린/스트렙토마이신, 필터 멸균 0.22 μm 필터를 사용 하 여.
   참고: 해부 배지를 최대 1개월 동안 4°C로 유지하십시오.
2. 배아 배지의 25%와 쥐 혈청 50%, 인간 탯줄 혈청(HCS) 또는 인간 성체 혈액 혈청(HBS)을 사용하여 생물학적 후드 내에서 매일 씩 씩씩하게 배아 배양 배지(EUCM)를 준비한다.
3. 배아 매체를 준비하려면 글루타민 5mL, HEPES 5mL, 페니실린/스트렙토마이신 5mL을 페놀 레드 및 L-글루타민 없이 DMEM 500mL에 넣으세요. 10-15 mL 알리코를 준비하고 최대 2 개월 동안 4 °C에서 저장하십시오.
   참고: 오염이 발생하면 항생제 농도를 두 배로 늘리십시오.
4. 30-45분 동안 56°C에서 쥐 세럼을 가열하고 0.22 μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드 필터를 통해 필터를 드십시오. 비활성화 당일 문화에 세럼을 사용하십시오. HCS 또는 HBS를 해동하고 실험에 즉시 사용하십시오.
   참고: 상업용 쥐 혈청은 일관된 결과를 제공합니다(명백한 변화 없이 최소 4개의 로트 테스트). 대안적으로, 고품질 쥐 혈청은 이전에 설명된 바와 같이 사내에서 얻을 수 있다^8,14. HCS를 사용할 수 없는 경우 사내에서 수집된 HBS로 교체하십시오. 쥐 혈청, HCS 및 HBS는 한 번 재냉동하고 다른 날에 사용하기 위해 -20 °C에서 보관 할 수 있습니다. 동결 및 새로 해동 된 세럼의 더 큰 볼륨과 재냉동 세럼을 결합하고 다시 고정하지 않습니다.

2. 인간 탯줄 혈액 혈청 및 인간 성인 혈액 혈청 의 컬렉션

1. HCS를 격리하려면 예정된 제왕 절개 배달 당일 건강한 임산부로부터 탯줄 혈액을 수집하십시오.
   1. 배꼽 코드 5-7cm를 배꼽에서 이중 으로 고정하고 유아의 출산 직후 클램프 사이에 횡단합니다.
   2. 태반은 혈혈증의 흔적을 피하기 위해 자리에 남아있는 동안 수동으로 큰 보어 14 G 바늘과 배꼽 정맥에서 직접 50 mL 주사기를 사용하여 혈액을 그립니다.
      참고: 유아가 수술 장에서 제거된 후 혈액을 수집하고, 임상 검사를 위해 배꼽 혈액이 그려졌습니다.
2. 수집된 혈액을 5mL 프로응고제 멸균 시험관에 분배하고 즉시 완전한 응고를 허용하기 위해 15분 동안 4°C로 이송합니다. 4°C에서 10분 동안 2,500g× g 에서 응고된 시험관을 원심분리합니다.
3. 용혈 (분홍색 빨간 혈청)의 흔적을 보여주는 튜브를 폐기하십시오. 5mL 파이펫을 사용하여 혈청(노란색)을 수집하고 0.22 μm 필터를 통해 필터링합니다. 45분 동안 56°C 수조에서 즉시 혈청을 열이 비활성화합니다.
4. 불활성 혈청의 1-1.5mL 알리쿼트를 준비하고 최대 6개월 동안 -80°C에 보관하십시오. 필요한 경우 드라이 아이스를 사용하여 -70 °C에서 발송하십시오.
5. 성인 인간의 혈액 혈청 수집을 위해 건강한 성인에게서 혈액을 그리고 탯줄 혈액 혈청에 대해 설명된 동일한 프로토콜에 따라 즉시 혈청을 분리합니다. HBS를 최대 6개월 동안 -80°C에서 열비활성화 및 여과된 알리쿼트로 저장합니다.
   참고: 인간 탯줄 세럼과 어른 의 인간 혈청은 사내에서 신선하게 준비된 상시 세럼에 우수한 결과를 주었습니다. 건강한 여성으로부터 HCS를 수집, 18 세 이상 과 40 세 미만 은 제왕 절개 배달 예정. 임신 성 당뇨병이나 고혈압을 포함하여 만성 질환이나 활동적인 질병을 가진 여성과 질 출산을 한 여성을 제외하십시오.

3. E7.5에서 E11까지 배아의 자궁 롤러 배양

1. 롤러 배양 인큐베이터 및 가스 레귤레이터 설정
   1. 배양 E7.5 이상의 고급 배아는 롤러 배양 인큐베이터 시스템을 이용하여 한다. 배아 해부 전에 적어도 1 시간 동안 37°C에서 회전기 및 가열 장치를 켭니다. 가스 입구 병과 콘센트 테스트 튜브에 자동 용수를 추가합니다.
      참고: 회전 드럼 에 인접한 온도계를 배치하고 자주 인큐베이터 내부온도의 안정성을 확인합니다. 가능한 한 빨리 인큐베이터를 열어 개방 시간이 길어지면 온도가 증가하고 배아 발달에 영향을 미칩니다. 필요한 경우 가스 입구 병과 출구 테스트 튜브에 더 많은 자동 용수를 추가하여 문화 중에 최소 절반 용량으로 유지하십시오. 인큐베이터를 천으로 덮어 인큐베이터 내부의 배아를 빛으로부터 보호합니다.
   2. 메인 스위치를 누르고 산소/질소 및 _CO2 컨트롤러를 켜서 가스 레귤레이터 모듈을 켭니다(그림 1A). 각 컨트롤러를 사용하여 산소 및 _CO2 값을 5%로 설정합니다. 가스 레귤레이터를 열고 압력 송신기(그림 1B)에서 전압 스위치를 이동하여 제곱인치당 6.5-7파운드(psi)로 가스 압력을 설정합니다. 디지털 압력 게이지를 사용하여 가스 압력 값을 확인합니다.
   3. 정밀 인큐베이터 내부에 할당된 배출구 수분 충전 테스트 튜브 내부에서 생성된 기포의 속도를 확인하여 가스 흐름을 모니터링합니다. 물병 뚜껑에 가스 흐름 밸브를 닫고 열어 적절한 거품 속도를 설정합니다. 가스 흐름이 초당 2-4 기포 의 속도로 기포의 형성을 허용하거나 버블링이 물로 채워진 출구 튜브에 나오는 첫 번째 지점에서 거품 흐름을 설정할 수 있는지 확인합니다.
   4. 배양 배지 2mL로 배양병을 채우고 1h의 프리플리션을 위해 속이 빈 회전 드럼에 연결합니다. 속이 빈 실리콘 번그를 사용하여 병을 드럼에 밀봉하십시오. 솔리드 번그를 사용하여 회전 드럼의 빈 공간을 밀봉하십시오.
      참고: 출구 관에 기포가 없거나(시스템을 통해 들어오는 가스 없음) 또는 매우 높은 가스 흐름이 태아 발달에 영향을 줄 수 있습니다. 출구 테스트 튜브에 거품 흐름이 부족한 경우 모든 실리콘 번그가 회전 드럼에 올바르게 배치되어 시스템을 밀봉하고 물병이 제대로 닫혀 있고 모든 튜브가 올바르게 연결되어 있는지 확인하십시오. 물병에 거품이 들어오지 않아 가스 조절기의 오작동을 나타낼 수 있습니다.
2. 임신 한 마우스에서 마우스 배아의 해부
   1. 인큐베이터 내부의 해부 배지를 37°C및 5% _CO2 에서 최소 1h로 선평화한다. 뚜껑을 약간 열어 가스 교환을 허용합니다.
   2. 자궁 경부 탈구로 임신 한 여성을 희생하고, 여성의 복부를 70 %의 에탄올로 청소하고, 가위로 피부와 복벽을 잘라냅니다. 자궁의 한쪽 끝을 찾아 난소와 자궁 사이의 교차점에 잘라. 다음으로, 자궁을 따라 다른 쪽 끝까지 자르고 실온 덜벡코의 인산완충식식염(DPBS)으로 채워진 100mm 페트리 접시로 옮는다.
      참고: 비 호르몬 프라이밍의 사용, 자연스럽 게 짝짓기 된 여성 권장.
   3. DPBS의 개념을 신속하게 세척하고 쌍으로 잘라 배아 처리를 용이하게합니다. 모든 컨셉을 60mm 페트리 접시에 미리 보정된 해부 매체로 옮기고 개별 컨셉으로 자른다.
   4. 총 집게 한 쌍을 사용하여 자궁 조직을 찢어 개념의 자궁 벽을 제거합니다. 미세한 미세 수술 용 집게를 사용하여 배 모양의 데시두아의 끝을 잘라냅니다. 긴 축에 평행배 옆에 있는 집게를 삽입하고 집게를 열어 데시두아를 반으로 나눕다.
   5. 마지막으로, 데시두아에서 배아를 잡고 미세 한번을 사용하여 배아에서 정수리 노른자 주머니를 벗겨내어 계란 실린더에 부착된 그대로의 자궁절 콘을 남깁니다.
      참고: 배아에 영향을 미치지 않으려면 최대 30-40분 이내에 37°C의 가열 플레이트가 장착된 현미경에서 해부를 수행합니다. 한 번에 한 마리의 배아를 해부합니다.
   6. 해부 직후, 배아를 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 평형 해부 배지로 채워진 새로운 판으로 배아를 옮겨 배아가 조직 파편에 달라붙는 것을 방지합니다.
   7. 신경판/초기 헤드 폴드 스테이지에서 이러한 배아를 선택하여 에피블라스트에 손상을 주지 않고 병당 5-6개의 배아를 미리 보정된 유리 배양 병으로 옮기십시오.
      참고: 유리 파스퇴 파이펫을 준비하려면 파이펫의 개구부를 유리 커터를 사용하여 배아에 맞게 적절한 크기로 자르고 오염을 방지하기 위해 에탄올에 보관하십시오. 배아를 옮기기 전에 PBS로 유리 파이펫을 씻으시면 됩니다. 배아를 배양병으로 옮길 때, EUCM희석을 피하기 위해 가능한 한 해부 매체의 적은 부피를 이월해야 한다.
   8. 회전 배양 시스템에 병을 37°C, 5% _O2 및 5% _CO2의 대기에 놓습니다.
   9. 문화의 매일, 스테레오 현미경에서 배아 개발을 평가하기 위해 인큐베이터에서 하나씩 병을 제거합니다. 병을 제거할 때 드럼의 빈 구멍을 단단한 붕으로 닫아야 합니다. 멸균 플라스틱 파스퇴르 파이펫의 끝을 잘라 배아 크기에 맞게 배아를 페트리 접시로 이동하여 관찰을 용이하게 합니다. 배아는 항상 매체에 의해 덮여 있는지 확인하십시오.
      참고: 배아가 인큐베이터 외부에 있는 시간을 최소화하여 체온 의 감소로 인해 배아의 해로운 영향을 피하십시오. 배아 생존에 영향을 미치는 노른자 낭 혈관의 파열을 피하기 위해 배아를 신중하게 처리하십시오.
   10. 문화일1(E8.5에 해당)에서 3개의 배아를 새로운 병에 옮기는 그룹은 2mL의 신선하고 미리 보정된 EUCM으로 D-포도당 3 mg/mL을 추가로 함유하고 있으며 가스 혼합물은 13% _O2, 5% _CO2이다.
   11. 48h(E9.5에 해당) 후, 2개의 배아를 신선한 예열된 EUCM과 3.5 mg/mL의 가스 대기에서 18% _O2 및 5% _CO2의 가스 대기로 새로운 병으로 이송한다.
   12. 72h의 배양(E10.5에 해당)에서 각 배아를 1.5-2mL의 신선한 배지를 함유한 개별 병으로 이동하여 4 mg/mL의 포도당과 21% _O2 및 5%의 _CO2의 가스 공급으로 보충한다.
       참고: 배아는 4일 자정에 최대 성장에 도달합니다.
   13. 미세 한 집게를 사용 하 여 노 른 자 낭과 양수 를 제거 하 고 배아 형태의 적절 한 관찰에 대 한 탯줄을 분리. 가스 규제 모듈과 정밀 인큐베이터를 끕니다.
       참고: 배아 단계에 따라 적절한 가스 대기로 롤러 배양에서 유리병 내부의 배양배지를 1시간 동안 선평화한다. 배양병과 모든 인큐베이터 유리제품을 세척하여 증류수 세 번의 세척을 수행한 후 70% 에탄올에 잠수한 야간 세척을 수행합니다. 증류수로 세 번 재세척하고, 병이 하룻밤 동안 건조하게 하고, 오토클레이브로 살균합니다. 마찬가지로 실리콘 플러그를 정기적으로 오토클레이브합니다. 70% 에탄올로 모든 해부 도구를 철저히 청소하고 건조 살균합니다.

4. E5.5/E6.5에서 E11로 확장된 배아 배양

1. 배양 배기 전 (E5.5) 및 초기 위화 (E6.5) 정적 플레이트에서 초기 소미트 단계 (E8.5)까지 배아.
2. 37°C에서 5% _CO2 로 인큐베이터에서 1h의 해부 배지를 선평화한다.
   참고: 가스 교환을 허용하려면 튜브 뚜껑을 완전히 닫지 마십시오.
3. 새로 준비된 EUCM 250 μL을 각 웰에 추가하여 배양 판을 준비합니다. 미리 보정을 위해 _CO2 인큐베이터 내부에 플레이트를 37°C로 배치합니다.
   참고: 8웰 플레이트는 배아 성장에 적합하지만, 배양은 플레이트의 크기에 따라 배지의 부피를 조정하여 다른 플레이트에서 수행할 수 있다.
4. E7.5에 대해 기술된 기술에 따라 자궁에서 계란 실린더 배아를 해부한다. 배아의 정수리 노른자 주머니를 제거하고 계란 실린더에 부착 된 그대로 ectoplacental 콘을 둡니다.
5. 마이크로피펫을 사용하여 8웰 플레이트의 각 웰에 개별 배아를 옮기고 플레이트를 37°C에서 5% _CO2 로 인큐베이터 내부에 놓습니다.
6. 스테레오현미경아래 배아를 이미지화하고, 명백한 손상없이 라이처트의 멤브레인없이 잘 형성 된 양수 구멍을 가진 사람들만 배양을 선택합니다.
   참고: 20 μL 파이펫 팁을 사용하여 E5.5 배아와 200 μL 팁을 전송하여 E6.5 배아를 이송합니다. E6.5에서 시작되는 문화의 경우 HCS는 갓 수거된 HBS로 대체할 수 있습니다.
7. 배지의 절반을 제거하고 24시간 후 새로 준비된 예온 EUCM 250 μL을 추가하여 배아가 항상 배양 배지에 침지되도록 합니다. E5.5에서 시작되는 배양의 경우, 2일간의 배양(E7.5에 해당)을 제거하여 200 μL을 제거하고 새로운 EUCM의 250 μL을 추가합니다.
   참고: 정적 배양 시 배아는 배아 발달을 심각하게 손상시키는 플레이트(주로 플라스틱 플레이트를 사용하는 경우)에 부착할 수 있습니다. 배아를 접시에 부착하는 것은 E5.5 배아를 배양하는 첫날에 더 빈번합니다. 부착을 방지하기 위해 미세한 멸균 집게를 사용하여 배아를 플레이트 표면에서 조심스럽게 밀어 넣습니다. 절제된 콘만 플레이트 표면에 부착된 상태로 남아 있는지 확인합니다.
8. 초기 소미트 단계에서 롤러 배양으로 배아를 전송 (4-7 somites; E5.5에서 배양에 박은 배아에 대한 문화의 3 일 후 E6.5에서 시작), E8.5 단계 배아에 대해 이전에 설명 된 동일한 표시에 따라.
   참고: 상기와 다른 소미트 스테이지에서 배아를 롤러 배양으로 옮기면 추가 개발이 실패하게 된다. E7.5 전 자궁 배양과 는 달리, 21% 산소와 5% _CO2의 일정한 대기에서 배아를 유지할 수 있어, 동적 산소 농도를 가진 대기보다 배아 발달의 약간 더 높은 효율을 제공한다.

결과

E7.5 배아(후기 위화 단계)에 대해 설명된 롤러 배양 조건은 4배양일 후 평균 효율이 75%에 가까운 일정하고 정상적인 배아 성장을 지원합니다(그림 2 및 표 1). 배아 발달의 효율성은 다양한 마우스 유전 배경에 따라 다를 수 있지만 일관되게 견고합니다(그림 2C). HCS 대신 HBS를 사용하면 마우스의 유전적 배경에 따라 4일간의 자궁 배양 ?...

토론

본 명세서에 제시된 배양 프로토콜은 E5.5에서 E11까지 최대 6일 동안 적절하고 지속적인 마우스 배아 발달 ex utero를 유지할 수 있다. 이전에는 이러한 발달 단계에 있는 배아가 짧은 기간 동안만 배양에서 정상적으로 개발할 수 있었습니다(최대 48h)¹⁵. 산소 농도 및 고압 가스 압력의 정밀한 제어를 위한 롤러 배양 인큐베이터에 가스 조절 모듈을 결합하는 것은 본 원에 기재?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore size filter (250 mL)	JetBiofil	FCA-206-250
0.22 µm pore size syringe PVDF filter	Millipore	SLGV033RS
8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat	iBidi	80827/80826
Bottle with adaptor cap for gas inlet	Arad Technologies
Bungs (Hole)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 06	Used to seal the bottles to the drum
Bungs (Solid)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 07	Used to seal the rotating drum
Culture bottles	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 03/BTC 04	Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04
D(+)-glucose Monohydrate	J.T. Baker
Diamond knife	Fine Science Tools	10100-30/45
Digital Pressure Gauge	Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd	BX-DPG80
DMEM	GIBCO	11880
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Biological industries	02-020-1A
Fetal Bovine Serum	Biological industries	04-013-1A
Gas regulation module	Arad Technologies	HannaLab1
Glutamax	GIBCO	35050061	glutamine
Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
HEPES	GIBCO	15630056
Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)	Fine Science Tools	11255-20
Pasteur pipettes (glass)	Hilgenberg	3150102
Pasteur pipettes (plastic)	Alexred	SO P12201
Penicillin/Streptomycin	Biological industries	03-031-1B
Petri Dishes (60 mm and 100 mm)	Falcon	351007/351029
Precision incubator system	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC01	BTC01 model with gas bubbler kit
Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)	Greiner Bio-One	#456005
Rat whole embryo culture serum	ENVIGO Bioproducts	B-4520
Stereoscopic microscope equipped with heating plate	Nikon	SMZ18
Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration	Pic Solution
Surgical scissors	Fine Science Tools	14094-11